一种人脐带间充质干细胞在创面修复中的应用的制作方法

本发明涉及创面修复技术领域，具体的涉及一种人脐带间充质干细胞混合自体微粒皮并以异体网状皮覆盖在创面修复中的应用。

技术背景

对大面积烧伤，传统的手术方式是在烧伤后抗休克的同时，早期实施切削痂手术，同时实施自体皮移植的手术方法，此种传统的手术方式存在手术时间长、出血多及植皮成活率低等缺点，而且烧伤面积超过50％的患者就有自体皮源不足的风险。临床上对于大面积的烧伤切痂后皮源不足患者进行微粒皮移植，然后覆盖异种皮。异种皮在一定程度上为微粒皮的成活提供了适宜的湿度、温度的微环境，使微粒皮的覆盖创面的面积增大，但微粒皮修复创面效果差，患者预后外观及功能不理想，且在愈合时间相对较长，增加了感染的风险。临床上应用异体皮及异种皮解决了大面积烧伤患者切痂后的创面覆盖的问题，但是二者都只是暂时的起到过度的作用，机体对他们的排斥明显，而且还有潜在的传播疾病的风险。同种异体皮也存在着伦理学方面的争议，在英国，同种异体移植物的使用已经慢慢地被淘汰了。所以它们在上还有一定的局限性，更多的是发挥着协助的作用。大面积深度烧伤,愈合后还存在瘢痕增生甚至残废等问题,临床医生也一直在努力寻求一种满意的修复方法。

随着对间充质干细胞研究的不断深入，间充质干细胞的增殖分化能力、免疫调控特性等为烧伤创面的愈合提供了新的思路。目前已有研究证明间充质干细胞可以促进烧伤创面的愈合，加速创面闭合，同时在抑制炎症反应防止感染方面有积极的作用。但是目前间充质干细胞疗法最大的瓶颈在于移植后的间充质干细胞无法在烧伤后恶劣的微环境当中存活，也就无法发挥其强大的修复功能，我们研究团队一直致力于研究改善烧伤创面微环境以促进间充质干细胞的存活率，从而更加有效的促进烧伤创面的愈合。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述问题，提出一种人脐带间充质干细胞混合自体微粒皮并以异体网状皮覆盖的方法在创面修复中的应用，再由大小合适的钢圈固定于创面防止创面收缩愈合，通过碘伏棉球打包包扎以及弹力绷带固定，使得创面部分新生组织上皮化，创面收缩不明显，创周无感染迹象，创面愈合良好，可广泛应用于烧伤、整形外科等领域。

为实现上述目的，达到上述效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种人脐带间充质干细胞在创面修复中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

1)自体微粒皮浆和网状皮制备；

2)人脐带间充质干细胞和自体微粒皮浆混合涂抹；

3)网状皮创面覆盖、缝合；

4)钢圈固定创面、凡士林纱布覆盖以及碘伏棉球包扎；

5)外用弹力绷带固定。

优选的，所述步骤1)中将剪碎用做自体微粒皮浆待用，提前准备直径1cm大小的圆形异体皮，并打孔制备网状皮待用。

优选的，所述步骤3)用钢圈固定创面防止周围皮肤收缩愈合。

本发明的有益效果是：本发明将脐带间充质干细和自体微粒皮移植在创面，经异体网状皮覆盖与自体皮肤缝合，再由大小合适的钢圈固定于创面，通过碘伏棉球打包包扎以及弹力绷带固定。动物实验表明该治疗方式使创面愈合速度加快，愈合质量良好，可广泛应用于烧伤、整形外科等领域。

附图说明

图1为实施例中脐带间充质干细胞创面移植过程图；

图2为实施例中三组大鼠创面愈合过程图；

图3为实施例中三组大鼠愈合面积柱状图；

图4为实施例中三组大鼠创面愈合后皮肤组织病理图；

图5为实施例中三组愈合后皮肤组织VEGF检测图；

图6为实施例中三组大鼠创面表达血管内皮生长因子个数的柱状图；

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例

人脐带间充质干细胞混合自体微粒皮并以异体网状皮覆盖的方法，包括以下步骤：

一、SD大鼠烫伤模型的建立

1、SD大鼠烫伤模型制备

实验前一晚大鼠禁食禁水，使用3.6％水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉满意后，固定大鼠于泡沫板上，大鼠背部剃毛，充分暴露背部皮肤，将自制烧伤模具延背侧正中线紧贴于大鼠近头侧约3cm处，用力适度，防止注入水后发生漏水。将烧开的沸水(约93～95℃)注入烧伤模具内。注入量为35ml刻度时停止，开始计时15s，然后迅速将烧伤模具和大鼠分离，终止烫伤过程。使大鼠背部形成直径为15mm的圆形烧伤区域。

2、SD大鼠烫伤模型分组

将烫伤大鼠随机分成3组，每组10只。

第一组：1ml浓度(1x10⁶个细胞/ml)脐带间充质干细胞+自体微粒皮

第二组：自体微粒皮

第三组：无药物

二、脐带间充质干细胞创面移植

如图1所示，脐带间充质干细胞创面移植包括以下步骤：

1、自体微粒皮浆和网状皮制备

大鼠烫伤72小时后切除痂皮，将第一组大鼠和第二组大鼠于颈背部取小块皮肤后缝合，剪碎用做自体微粒皮浆待用，提前准备直径1cm大小的圆形异体皮，并打孔制备网状皮待用。

2、人脐带间充质干细胞和自体微粒皮浆混合涂抹

第一组大鼠将人脐带间充质干细胞1ml(浓度1x10⁶个细胞/ml)混合自体微粒皮浆，用手术刀柄将自体微粒皮浆均匀涂抹于创面。第二组大鼠创面涂抹自体微粒皮浆。第三组大鼠无微粒皮及脐带间充质干细胞涂抹。

3、网状皮创面覆盖、缝合

将准备好的异体网状皮覆盖，与自体皮肤缝合。第一组大鼠、第二组大鼠、第三组大鼠均做此处理。

4、钢圈固定创面、凡士林纱布覆盖以及碘伏棉球包扎

将合适大小的钢圈固定于第一组、第二组、第三组大鼠创面，防止周围皮肤收缩愈合，再用凡士林纱布覆盖于创面，加低浓度碘伏棉球打包包扎，采用烧伤外科打包技术，为创面愈合提供有效的创面敷料固定。

5、外用弹力绷带固定

使用外用弹力绷带固定，弹力绷带的使用，防止裸鼠抓挠辅料脱落，且弹力绷带富有弹力，不会对裸鼠造成束缚，中途可随时拆开进行观察。

三、结果观察

(一)创面愈合时间及面积的观察

1、三组大鼠创面愈合过程图(图2)

2、创面的愈合面积(结果见表1)

每日密切观察创面愈合情况，于7天后拆除打包处，视异体皮有无脱落，未脱落的任其自行脱落。待所有大鼠异体皮全部脱落后，测量大鼠愈合面积并且拍照记录，以后每隔7日测量一次大鼠创面的面积，计算创面愈合的面积，比较各组间的差异，直至创面完全愈合(残余创面<5％)为止。每次拍照记录的创面用IPP6软件分析创面面积大小。创面的愈合面积＝(创面的原始面积—现创面面积)。

表一三组大鼠愈合面积(单位：平方毫米)

注释：*表示与第一组比较P＜0.05；#表示与第二组比较P＜0.05

3、创面愈合面积柱状图(见图3)

由创面愈合面积过程图、创面愈合面积表和柱状图可以看出第一组，的大鼠创面愈合时间最短，愈合的效果最佳。

(二)、愈合创面组织学观察

1、创面取材、固定、脱水、切片

每只大鼠完全愈合后，切除创面愈合后组织及周围部分正常组织，将切下的皮肤组织放于备好的装有4％多聚甲醛的15ml的离心管内保存，后期进行脱水，用冰冻机进行冰冻切片。切片将用于HE染色观察创面组织学变化和免疫荧光检测VEGF含量。

2、HE染色组织学观察

(1)染色:a.移入苏木素中,浸染8～15min。b.移入水中,洗去苏木素和浮色,约1～2min。c.移入分化液(1％盐酸酒精)中,分化几秒至30秒钟,使切片褪色至淡兰红色即可。d、移入流水中,洗涤30～60min,使组织呈鲜兰色或天兰色(兰化)。e、移入伊红液中,浸染2～5min。f.移入水中,洗去伊红浮液。

(2)脱水:a.放入80％酒精中,(二瓶)脱水,约1～2min。b.移入90％酒精中(二瓶)脱水,约2～4min。c.移入无水酒精(100％酒精)(二瓶)彻底脱水,约4～8min。

(3)透明：a.移入二甲苯Ⅰ中透明3～5min。b.移入二甲苯Ⅱ中透明5～10min。

c.移入二甲苯Ⅲ中透明5～10min。

(4)封固:用树胶封固。切片封固后,放在温箱中烤干,或平置凉干后装盒。

将封好片的片子晾干，然后再显微镜下进行观察，观察组织中的血管内皮细胞、成纤维细胞、炎症细胞、微血管含量、胶原含量之间的差异。

观察各组大鼠愈合后皮肤切片染色结果的差别，观察每组大鼠切片中的微血管及毛细血管的多少，胶原含量的差别，成纤维细胞的含量之间的不同。如图4所示：(A为第一组，B为第二组，C为第三组)

结果：从各组大鼠创面伤后愈合创面的皮肤切片染色来看，第三组大鼠创面中的新生肉芽组织是三组大鼠中表达量最多的一组，同时可见第三组中有少量的微血管、成纤维细胞的表达，第三组切片中也可见坏死细胞的表达，但胶原含量较少。第一组大鼠切片中可见多处毛细血管的表达，胶原含量为三组中最多，且胶原排列整齐，创面中有少量的炎症细胞存在。第二组大鼠的切片观察可见组织内胶原排列紊乱，胶原含量少于第一组大鼠的含量。

(三)免疫荧光检测愈合创面VEGF

免疫荧光组织化学染色步骤：

将晾干的冰冻切片置于95％无水乙醇溶液中，静置2mins，再用自来水水化2mins。将柠檬酸组织抗原修复液(北京中杉金桥)置于2L的烧杯中，加入1000ml的单蒸水溶解，定容至2000mL，配制成0.01M PH＝6.0的抗原修复液，备用。将切片置于修复液中，用微波炉进行微波加热修复，中高火加热5mins，静置5mins，如此反复3次，放置至室温，用免疫组化笔将染色组织所在区域圈出，再用0.01M PBS(pH 7.2～7.4)漂洗3次。将玻片置于避光的湿盒中，拭去表面多余的PBS液，滴加抗原封闭液，置于4℃冰箱中封闭2h。

然后将一抗Anti-VEGFA antibody(ab46154)按照1:1000的比例进行稀释，将稀释好的一抗，滴加到组织上，置于湿盒中，室温孵育30mins，然后置于4℃冰箱孵育过夜。将片子用0.01M PBST洗涤液漂洗，每5mins漂洗一次，反复漂洗6次。将荧光二抗—Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor488)(ab150077)按照1:200的比例进行稀释，作为孵育用的二抗。将稀释好的二抗，滴加到组织上，置于湿盒中，室温孵育30mins，然后放于4℃冰箱孵育2h。将片子用0.01M PBST洗涤液漂洗，每5mins漂洗一次，反复漂洗6次。

滴加含DAPI的封片剂(北京中杉金桥)，盖玻片封片后用光学荧光显微镜进行镜下观察。

结果：血管内皮生长因子(VEGF)是可以促进创面血管内皮细胞的增殖，从而促进创面的血管化，它是创面愈合的重要因素。血管内皮生长因子的表达在一定程度上反应了创面愈合的质量。绿色为阳性结果，蓝色为细胞核。

如图5所示：A为第一组x100，B为第二组x100，C为第三组x100，D为第一组x400，E为第二组x400，F为第三组x400

对三组大鼠创面表达的血管内皮生长因子个数进行统计学分析，结果显示第一组与第二组比较P＜0.05，有统计学意义；第一组与第三组比较P＜0.05，有统计学意义；第二组与第三组比较P＞0.05，无统计学意义。表明第一组血管内皮生长因子的表达个数分别多于第二组及第三组的表达个数，第二组和第三组间表达的血管内皮生长因子个数无统计学差异。统计结果见下表2以及图6.

表2三组大鼠创面表达VEGF个数的统计

注释：*表示与第一组比较P＜0.05；

本发明的有益效果是：本发明将脐带间充质干细和自体微粒皮移植在创面，经异体网状皮覆盖与自体皮肤缝合，再由大小合适的钢圈固定于创面，通过碘伏棉球打包包扎以及弹力绷带固定，使得创面部分新生组织皮化，创面收缩不明显，创周无感染迹象，创面愈合良好，可广泛应用于烧伤、整形外科等领域。

对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。