本发明涉及医药领域，具体涉及一种豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途。
背景技术：
豆芋(apiosamericanamedikus)原产于北美洲东部的加拿大至美国佛罗里达州的南部地区，属多年生豆科植物(蝶形花科亚科)。其可食用部分为地下块茎，且其蛋白质含量高于其他植物块茎，是一种既营养又有经济价值的作物，因而常被印第安人作为主食。豆芋自2009年国内引种成功，并被逐渐在富阳、金华、龙游、温州等地推广种植。研究表明豆芋不同部位(花、藤、叶、块茎)均含有丰富的游离氨基酸、可溶性蛋白、多糖、皂苷、黄酮、异黄酮、维生素c、维生素e和矿物质等成分。其中，豆芋叶含有较高含量多糖、总皂苷和异黄酮，具有极大的开发潜力。
然而随着现代生活水平的提高及生活方式的变更，生活节奏的加快和社会压力的增大，令越来越多人的健康亮起“黄灯”——被亚健康困扰。免疫力是人体自身的防御机制，当免疫力长时间比较低下，通常被称为亚健康状态。在我国，亚健康人群约占总人口数的60％，而北京、上海和广州三大城市人群的亚健康发生率更超过70％，许多重大疾病的发生、发展均与不注重日常保健以及免疫力低下密切相关。但对于豆芋叶提取物的提高免疫力功能鲜有报道，因而以豆芋为原料开发免疫调节功能性食品具有重要意义。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途，为医学、食品科学等领域开发天然提高免疫增强剂提供新资源。
为解决上述技术问题，本发明提供一种豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途：
用于制备增强机体免疫力的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为增加免疫抑制体重的食品或药物(即，缓解环磷酰胺造成体重下降的食品或药物)。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为增强胸腺指数和脾脏指数的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为增强白细胞和淋巴细胞数量的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为增强单核-巨噬细胞功能的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为增强体液免疫的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为增强免疫球蛋白分泌的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述增强机体免疫力的食品或药物为调节细胞因子分泌水平的食品或药物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述豆芋叶乙醇提取物的制备方法包括以下步骤：
①、按照1g:5～10ml(较佳为1g:8ml)的料液比将豆芋叶和含0.1mol/l盐酸的85％乙醇混合后打浆，所得浆液于45±5℃超声(40,000hz的超声波频率)浸提240±10min后，提取液离心(4000转/min离心30min)，得上清液；
②、将步骤①离心所得的滤渣代替豆芋叶按步骤①重复提取两次，合并三次滤液，旋蒸浓缩直至为原体积的5～10％，得到浓缩液；
③、将步骤②所得的浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化；以体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂，以含有0.05％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂，收集洗脱液；
④、将步骤③所得洗脱液旋转蒸发浓缩成至为原体积的5～10％，得浆状浓缩液；
⑤、将步骤④所得浆状浓缩液在-70～-90℃预冻5～7h，然后用真空冷冻干燥机(真空冷冻干燥机设定的工艺参数为-40℃，1.2pa)将其干燥(含水率≤0.1％)成粉末状，得到豆芋叶乙醇提取物。
作为本发明豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途的进一步改进：
所述步骤③的具体步骤为：
首先用两倍柱体积的甲醇活化大孔树脂，三倍柱体积的双蒸水进行平衡；
然后以0.4～0.6ml/min(较佳为0.5ml/min)的流速上样，待提取液被充分吸附后，用体积浓度1％甲酸水溶液作为淋洗剂进行淋洗(淋洗的目的是为了除去蛋白质、糖、酸等物质)，所述淋洗剂的用量为两倍柱体积，流速为0.4～0.6ml/min(较佳为0.5ml/min)；最后用含有0.05％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂的用量三倍柱体积，流速为0.4～0.6ml/min(较佳为0.5ml/min)；收集洗脱液。
注：
含有0.05％甲酸的甲醇水溶液的制备方法为：在100ml体积浓度90％甲醇水溶液中加入0.05ml的甲酸。
上述旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09mpa。
所采用的大孔树脂为大孔树脂ab-8(天津兴南允能高分子技术有限公司)。
本发明公开了一种豆芋叶乙醇提取物的制备方法及其提高免疫力用途，为医学、食品科学等领域开发天然免疫增强剂提供新资源。本发明中的豆芋叶乙醇提取物经免疫功能评价实验证明，可以显著增强免疫抑制小鼠的细胞免疫、体液免疫和固有免疫功能，作用效果全面且显著。因此，本发明的豆芋叶乙醇提取物应用于制备免疫增强型食品或药品，以增强亚健康等免疫低下人群的免疫功能。
本发明的豆芋叶乙醇提取物的用法为口服，用量每次约150～250mg，每日三次。
本发明同现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明首次发现豆芋叶乙醇提取物能够显著增强免疫抑制小鼠的细胞免疫、体液免疫和固有免疫功能，作用广泛，效果显著，具有良好的开发前景。
2、本发明为豆芋叶乙醇提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。
附图说明
图1为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠体重的影响。
图2为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠胸腺指数的影响。
图3为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠脾脏指数的影响。
图4为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠体液免疫功能的影响。
图5为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清免疫球蛋白a(iga)的影响。
图6为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清免疫球蛋白g(igg)的影响。
图7为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清免疫球蛋白m(igm)的影响。
图8为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清γ-干扰素(ifn-γ)的影响。
图9为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清白细胞介素-2(il-2)的影响。
图10为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清白细胞介素-6(il-6)的影响。
图11为本发明中不同浓度豆芋叶乙醇提取物对小鼠血清肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的影响。
注：本发明图1～图11中：
control代表对照组(灌胃生理盐水)；
ctx代表模型组(灌胃生理盐水)；
lms代表阳性对照组(灌胃50mg/(kg·d)左旋咪唑)；
l代表低剂量组(灌胃100mg/(kg·d)豆芋叶乙醇提取物)；
m代表中剂量组(灌胃200mg/(kg·d)豆芋叶乙醇提取物)；
h代表高剂量组(灌胃300mg/(kg·d)豆芋叶乙醇提取物)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途，如图1-图11所示，豆芋叶乙醇提取物具有显著的提高免疫力效果。
豆芋叶乙醇提取物具体制备步骤如下：
(1)、按照1g：8ml的料液比将豆芋叶和含0.1mol/l盐酸的85％乙醇混合后，经榨汁机处理打浆。所得浆液在45℃条件下，超声(40，000hz的超声波频率)浸提240min后，提取液4000转离心30min，提取液离心，得上清液。
(2)、将步骤(1)离心所得的滤渣代替步骤(1)中豆芋叶，重复提取2次，合并三次滤液，将所得的上清液在旋转蒸发仪(旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09mpa)进行旋转蒸发浓缩直至为原体积的10％。
(3)、将旋蒸所得浓缩液采用大孔树脂进行分离纯化，所采用的大孔树脂为大孔树脂ab-8(天津兴南允能高分子技术有限公司)，依次进行以下步骤：
然后以0.5ml/min的流速上样，上样量为200ml(为柱体积的10％)；提取液充分吸附后，1％甲酸(即，体积浓度1％甲酸水溶液)淋洗除去蛋白质、糖、酸等物质，该淋洗剂的用量为两倍柱体积，流速为0.5ml/min；最后用含有0.05％甲酸的甲醇水溶液作为洗脱剂充分洗脱，该洗脱剂的用量三倍柱体积，流速为0.5ml/min；收集洗脱液。
所述含有0.05％甲酸的甲醇水溶液的制备方法为：在100ml体积浓度90％甲醇水溶液中加入0.05ml的甲酸；
(4)、将步骤(3)大孔树脂分离纯化所得洗脱液旋转蒸发(旋转蒸发设定的工艺参数为温度38℃，真空度-0.09mpa)直至为原体积的10％，得浆状浓缩液；
(5)、将步骤(4)所得的浆状浓缩液在-80℃预冻6h，然后用真空冷冻干燥机干燥48h(真空冷冻干燥机设定的工艺参数为-40℃，1.2pa)将其干燥成粉末状(含水率≤0.1％)，得到豆芋叶乙醇提取物。
用上述方法制备获得的豆芋叶乙醇提取物进行干预由环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠，检测其免疫功能相关指标，具体步骤为：
1、实验动物分组与处理；
spf级icr雄性小鼠60只，实验动物按体重平均分为6组：空白对照组、环磷酰胺(ctx)模型组、阳性药左旋咪唑组(lms)和豆芋叶乙醇提取物低(l)、中(m)、高(h)剂量组。除了空白对照组外，其它各个组小鼠于给药的第1、3、5、7、9、16、18、20、22d皮下注射ctx(40mg/kg)造模。空白对照组用生理盐水(0.1ml/10g)进行灌胃，阳性对照组用lms[50mg/(kg·d)]进行灌胃，低、中、高剂量组分别用100mg/(kg·d)，200mg/(kg·d)，300mg/(kg·d)豆芋叶乙醇提取物进行灌胃，连续灌胃30天后测定各项指标。
2、记录豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠体重的影响：
给药第一天开始，每隔3天称一次各组小鼠体重，共10次。
如图1可知，与对照组相比模型组小鼠体重显著降低，阳性对照组及各豆芋叶乙醇提取物处理组同模型组相比体重趋于恢复正常。以上结果表明豆芋叶乙醇提取物能够缓解环磷酰胺造成的小鼠体重下降。
实施例2、豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响；
将实施例1中按步骤1灌胃30天后的小鼠处死，摘取小鼠胸腺和脾脏称重，计算小鼠胸腺指数和脾指数。
结果如图2和图3所示，与空白对照组相比，模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著降低。阳性对照组及各豆芋叶乙醇提取物处理组同模型组相比胸腺指数和脾脏指数趋于恢复正常，且低剂量组和高剂量组均能显著提高免疫低下小鼠的胸腺指数和脾脏指数。
实施例3、豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠外周血常规的影响；
将实施例1中按步骤1灌胃30天后的小鼠，以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管(或商品化的抗凝管)中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数，上机操作参照仪器说明书，具体检测结果如表1所示。
表1豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠外周血常规的影响
结果如表1所示，同对照组相比环磷酰胺能够显著降低血液中白细胞数量和血小板数目，同时提高血液中红细胞和血红蛋白含量。同模型组相比，豆芋叶乙醇提取物处理组能够显著提高免疫低下小鼠血液中白细胞和血小板的数目，同时缓解由环磷酰胺引起的血液中红细胞和血红蛋白的增加。
实施例4、豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞功能的影响；
在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系。以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标，两者呈直线关系。此直线斜率(k)可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数α表示。
将实施例1中按步骤1灌胃30天后的各组小鼠处死前从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(原液稀释4倍)，按每10g体重0.1ml计算。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2min和10min分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml0.1％na2co3溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值(od)，以na2co3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。按下式计算吞噬指数α：
吞噬指数α＝体重/(肝重+脾重)*k1/3
k＝(lgod1-lgod2)/(t2-t1)
公式中α：吞噬指数；k:廓清指数；od1：t1时的吸光度值；od2：t2时的吸光度值；t1：给墨汁后第一次取血的时间；t2：给墨汁后第二次取血的时间。
结果如表2所示，同对照组相比环磷酰胺造模组小鼠的廓清指数和吞噬指数均显著下降。而阳性药物和不同剂量的豆芋叶乙醇提取物干预后均能显著提高免疫低下小鼠的廓清指数和吞噬指数。以上结果表明，豆芋叶乙醇提取物能够显著改善由环磷酰胺造成的小鼠单核-巨噬细胞功能的下降，提高机体免疫。
表2.豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞功能的影响
实施例5、豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响；
按实施例1中步骤1灌胃30天，并于实验第24d，各组实验小鼠腹腔注射4％的绵羊红细胞0.2ml/只，免疫6d后，实验结束，眼眶取血，分离血清进行溶血素测定。
绵羊红细胞(srbc)的制备:从健康绵羊颈部静脉采血，立即与两倍体积量阿氏液(alsever)混勻，置于4℃冰箱中保存备用。临用时取上述保存的绵羊红细胞，用生理盐水洗涤3次，每次2000rpm，离心5min，每次弃上清液，最后用生理盐水配成所需浓度。
补体制备:取膝鼠8只，腹主动脉釆血，离心分离血清，临用时用生理盐水1:10稀释。
设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清10μl，用1ml1:5稀释的sa缓冲液稀释；每孔加入稀释后的血清100μl；空白对照孔：每孔加入100μl1:5稀释sa缓冲液，再依次加入10％(v/v)srbc50μl，补体100μl(用sa溶液或pbs溶液按1:8稀释)，置37℃恒温水浴中保温30min，1500r/min离心10min。然后样品孔和空白对照孔各取上清液50μl加入另一个96孔培养板内，加都氏试剂150μl。同时设半数溶血孔，加入10％(v/v)srbc12.5μl，再加都氏试剂至200μl。用震荡器充分混匀，放置10min后，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。溶血素的量以半数溶血值(hc50)表示，按下列公式计算：hc50＝(样品光密度值-空白光密度值)/(srbc板书溶血时的光密度值-空白光密度值)*稀释倍数。
实验结果如图4所示，同对照组相比环磷酰胺造模组小鼠的半数溶血值(hc50)显著下降。而阳性药物和不同剂量的豆芋叶乙醇提取物干预后均能显著提高免疫低下小鼠的半数溶血值(hc50)。以上结果表明，豆芋叶乙醇提取物能够显著改善由环磷酰胺造成的小鼠体液免疫的下降，提高机体体液免疫。
实施例6、豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白iga、igg、igm分泌的影响；
将各组小鼠按实施例1中步骤1灌胃30天，并于末次给药后予小鼠禁食12小时，然后摘除眼球取血，使用离心机以1500r/min离心5分钟分离出血清，分别装于不同的离心管中，并转移至-80℃低温冰箱中贮存。按iga、igg、igm试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)说明并参考文献用elisa法进行环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清中iga、igm、igg含量进行检测。
结果分表如图5、图6和图7所示，同对照组相比环磷酰胺造模组小鼠的免疫球蛋白iga、igg、igm分泌量显著下降。而阳性药物和中、高剂量的豆芋叶乙醇提取物干预后均能显著提高免疫低下小鼠的免疫球蛋白iga、igg、igm分泌。以上结果表明，豆芋叶乙醇提取物能够显著改善由环磷酰胺造成的小鼠免疫球蛋白含量的下降。
实施例7、豆芋叶乙醇提取物对免疫抑制小鼠血清细胞因子分泌水平的影响；
将各组小鼠按实施例1中步骤1灌胃30天，并于末次给药后予小鼠禁食12小时，然后摘除眼球取血；使用离心机以1500r/min离心5分钟分离出血清，分别装于不同的离心管中，并转移至-80℃低温冰箱中贮存。按ifn-γ、il-2、il-6、tnf-α试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)说明并参考文献用elisa法进行环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清中ifn-γ、il-2、il-6、tnf-α含量进行检测。
结果分表如图8、图9、图10和图11所示，同对照组相比环磷酰胺造模组小鼠血清中ifn-γ、il-2、il-6、tnf-α分泌量显著下降。而阳性药物和不同剂量的豆芋叶乙醇提取物干预后均能显著提高免疫低下小鼠血清中ifn-γ、il-2、il-6、tnf-α分泌。以上结果表明，豆芋叶乙醇提取物能够正向调节由环磷酰胺造成的小鼠血清中免疫相关细胞因子的分泌情况。
综上本发明提出一种豆芋叶乙醇提取物的提高免疫力用途，为医学、食品科学等领域开发天然免疫增强剂提供新资源。同时涉及豆芋叶乙醇提取物在制备免疫增强剂中的应用。
以上列举的仅为本发明的实施的若干实例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。