本发明属于核磁共振成像技术领域，具体涉及一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂及其制备方法和应用。
背景技术：
目前在医学领域利用核磁共振成像技术研究人体病变诊断占有重要地位，核磁共振(nmr)是一种可以非侵入性地探测不透明样品而避免电离辐射的技术。nmr通常使用质子产生信号，但它的应用受其灵敏度差的限制，并且在生物体内有很强的背景信号干扰。所以，杂核mri(如13c，31p，19f，129xe)技术越来越受到人们的重视。
纳米乳作为一种新型的纳米材料，具有良好的生物相容性、细胞跨膜运输能力，可应用于肿瘤的诊断以及作为药物载体。全氟化碳(pfcs)纳米乳作为19fmri示踪剂已经被广泛应用。全氟溴辛烷(pfob)是一种无毒性的pfcs，可提供较强的f信号，更是被广泛应用于检测肿瘤细胞、组织以及对活体肿瘤的19fmri成像。另外，pfob对xe具有较好的溶解性，氙气是一种理想的介质，因为它是一种惰性，无毒的气体，在人体内没有背景信号。129xe的天然丰度为26.4％，可通过自制的极化装置产生超极化129xe气体。将超极化的129xe与cest技术相结合可达到超高的灵敏度，最低可在皮摩尔浓度下检测到129xe造影剂。已有文献报道pfob可应用于129xemri造影剂。
使用全氟溴辛烷(pfob)作为129xe的载体，它具有生物相容性好、无毒、体内代谢快等优点，pfob纳米乳作为129xe/19f双通道多功能显影剂，具有超高的灵敏度用于129xemri以及19fmri成像。制备方法简单、材料易得有较好的生物相容性，可以应用于生物体内的核磁共振成像。
技术实现要素：
本发明在于克服现有技术的不足，目的是在于提供一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂及其制备方法和应用；本发明提供的pfob纳米乳结合了129xemri和19fmri两种磁共振成像方法，并且引用rgd配体与癌细胞上的受体特异性结合的靶向诊断的策略，使纳米乳选择性的识别肿瘤细胞。通过129xemri和19fmri技术实现对肺癌肿瘤的靶向诊断。该显影剂有超高灵敏度以及较好的生物相容性。该纳米乳制备方法简单，原料便宜易得，适合用于体内磁共振成像。
为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米乳的制备：先将占磷酸盐缓冲液4wt％的磷脂和占磷酸盐缓冲液0.5wt％的普朗尼克f-68溶解在1ml磷酸盐缓冲液(pbs)中，然后将占磷酸盐缓冲液10wt％-20wt％的全氟溴辛烷(pfob)加入到上述缓冲液中，并在超声仪中处理5-10分钟，再用试管振荡器振荡10-15分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为nps；
(2)rgd-纳米乳的制备：将胆固醇-peg2000-rgd加入到步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳nps-rgd；
(3)荧光标记的rgd纳米乳的制备：向步骤(2)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/ml的荧光染料dii，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到dii标记的rgd-纳米乳。
优选的，所述胆固醇-peg2000-rgd的制备方法为：将胆固醇-peg2000-mal与rgdyc按摩尔比10:1-1:1加入1mlpbs中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20-24小时，然后用透析袋在超纯水中透析去除未反应的rgdyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-peg2000-rgd。
优选的，所述磷脂为大豆卵磷脂(lipoids75)。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5mm，ph为7.4。
优选的，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
优选的，所述胆固醇-peg2000-rgd的加入量与磷脂的摩尔比为1：20。
优选的，步骤(1)中磷脂与f-68的质量比为8：1。
优选的，所述磷脂与全氟溴辛烷(pfob)的质量比为1:2.5-1:5。
另外，本发明还要求保护由所述方法制备得到的rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂以及该显影剂应用于肺癌肿瘤的早期mri诊断。
与现有技术相比，本发明具有以下的明显有益效果：
(1)本发明使用s75磷脂做膜材料，用胆固醇-peg2000-rgd分子进行修饰，采用超声和振荡的方法制备纳米乳，其中f-68的添加可以使微乳结构更加稳定，材料便宜易得，制备方法简单并具有良好的生物相容性；
(2)本发明制备的纳米乳同时作为129xemri和19fmri显影剂以及光学成像显影剂，是一种129xe/19f双通道、双模态mri显影剂；
(3)作为129xehypercest显影剂，本发明纳米乳具有超高的灵敏度高，可在皮摩尔浓度下对肺癌细胞进行mri成像。通过129xemri和19fmri以及光学成像证明了该纳米乳对肺癌肿瘤具有较好的靶向性，该显影剂可以应用于肺癌肿瘤的早期mri诊断。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的动态光散射图；
图2为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的透射电镜图；
图3为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的紫外吸收波普图；
图4为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的荧光发射光谱图；
图5为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的19f谱图；
图6为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的129xenmr谱图；
图7为本发明实施例1制备的nps-rgd纳米乳的129xehypercest谱图；
图8为本发明实施例1制备的nps-rgd分别与正常细胞以及肿瘤细胞孵育之后的129xemri及19fmri谱图；
图9为本发明实施例2制备的nps-rgd纳米乳的动态光散射图；
图10为本发明实施例3制备的nps-rgd纳米乳的动态光散射图；
图11为本发明实施例4制备的nps-rgd纳米乳的动态光散射图。
具体实施方式
下面以具体实施例子，进一步阐述本发明。下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米乳的制备：先将40mg的磷脂lipoids75和5mg普朗尼克f-68溶解在1ml浓度为5mm、ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.2g的全氟溴辛烷(pfob)加入到上述缓冲液中，并在功率为170w超声仪中处理8分钟，再用试管振荡器振荡12分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为nps；
(2)rgd-纳米乳的制备：将1.2mg的胆固醇-peg2000-rgd加入到3ml步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳nps-rgd；
(3)荧光标记的rgd纳米乳的制备：向3ml步骤(3)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/ml的荧光染料dii，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到dii标记的rgd-纳米乳。
其中，所述胆固醇-peg2000-rgd的制备方法为：将21.4mg胆固醇-peg2000-mal和5mgrgdyc加入1mlpbs中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000da透析袋在超纯水中透析去除未反应的rgdyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-peg2000-rgd。
将本实施例1制备的nps-rgd进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图1所示，平均水合粒径为195nm。
将本实施例1制备的nps-rgd用透射电镜进行扫描，所得的透射电镜图如图2所示，图中可以看出，本实施例制备的nps分散性好，粒径均一。表面有一层类似膜的结构，说明pfg-rgd分子修饰到纳米乳的表面。
将本实施例1制备的nps-rgd进行紫外吸收检测，所得的紫外吸收光谱图如图3所示，在275nm处检测到rgd分子特征吸收峰，说明rgd分子成功修饰到纳米乳表面。
将本实施例1制备的nps-rgd进行荧光发射光谱检测，从图4中可以看出最大发射波长为570nm。
将本实施例1制备的nps-rgd进行氟谱检测，所得的氟谱如图5所示，pfob的17个f显示出8组峰。
将本实施例1制备的nps-rgd进行129xenmr谱检测，如图6所示，xe在pfob纳米乳中的信号在106ppm处，水溶液中的xe信号在195ppm。
将本实施例1制备的nps-rgd进行129xehypercest谱检测，如图7所示，106ppm有一个较强的cest信号，来自于xe在pfob纳米乳中的信号。
将本实施例1制备的nps-rgd分别与正常细胞以及肿瘤细胞孵育之后测129xemri谱图，如图8a所示，肿瘤细胞有较强的cest信号，显示出很亮的信号。而正常细胞基本没有信号，说明了nps-rgd对肿瘤细胞有特异性靶向作用。做19fmri成像结果如图8b所示，肿瘤细胞有较强的19f信号，正常细胞没有信号，再次证明了nps-rgd对肿瘤细胞的靶向性及mri成像性质。
实施例2
一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米乳的制备：先将40mg的磷脂lipoids75和5mg普朗尼克f-68溶解在1ml浓度为5mm、ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.1g的全氟溴辛烷(pfob)加入到上述缓冲液中，并在功率为170w超声仪中处理5分钟，再用试管振荡器振荡10分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为nps；
(2)rgd-纳米乳的制备：将1.2mg的胆固醇-peg2000-rgd加入到3ml步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳nps-rgd；
(3)荧光标记的rgd纳米乳的制备：向3ml步骤(3)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/ml的荧光染料dii，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到dii标记的rgd-纳米乳。
其中，所述胆固醇-peg2000-rgd的制备方法为：将8.5mg胆固醇-peg2000-mal和2mgrgdyc加入1mlpbs中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000da透析袋在超纯水中透析去除未反应的rgdyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-peg2000-rgd。
将本实施例2制备的nps-rgd进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图9所示，平均水合粒径为205nm。
实施例3
一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米乳的制备：先将40mg的磷脂lipoids75和5mg普朗尼克f-68溶解在1ml浓度为5mm、ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.2g的全氟溴辛烷(pfob)加入到上述缓冲液中，并在功率为170w超声仪中处理10分钟，再用试管振荡器振荡15分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为nps；
(2)rgd-纳米乳的制备：将0.8mg的胆固醇-peg2000-rgd加入到2ml步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳nps-rgd；
(3)荧光标记的rgd纳米乳的制备：向3ml步骤(3)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/ml的荧光染料dii，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到dii标记的rgd-纳米乳。
其中，所述胆固醇-peg2000-rgd的制备方法为：将33mg胆固醇-peg2000-mal和1.4mgrgdyc加入1mlpbs中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000da透析袋在超纯水中透析去除未反应的rgdyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-peg2000-rgd。
将本实施例3制备的nps-rgd进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图10所示，平均水合粒径为210nm。
实施例4
一种rgd-全氟化碳纳米乳mri显影剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)纳米乳的制备：先将80mg的磷脂lipoids75和10mg普朗尼克f-68溶解在1ml浓度为5mm、ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.4g的全氟溴辛烷(pfob)加入到上述缓冲液中，并在功率为170w超声仪中处理10分钟，再用试管振荡器振荡15分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为nps；
(2)rgd-纳米乳的制备：将1.2mg的胆固醇-peg2000-rgd加入到3ml步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳nps-rgd；
(3)荧光标记的rgd纳米乳的制备：向3ml步骤(3)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/ml的荧光染料dii，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到dii标记的rgd-纳米乳。
其中，所述胆固醇-peg2000-rgd的制备方法为：将33mg胆固醇-peg2000-mal和1.4mgrgdyc加入1mlpbs中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000da透析袋在超纯水中透析去除未反应的rgdyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-peg2000-rgd。
将本实施例4制备的nps-rgd进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图11所示，平均水合粒径为215nm。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。