本发明属于组织工程材料
技术领域：
，具体涉及一种载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
：临床上治疗粉碎骨折，肿瘤切除，或骨髓炎病灶清除后大段骨缺损仍然是骨科医生面临的一大挑战。高能量创伤导致的严重骨缺损往往伴随着骨缺损部位的感染，从而阻碍骨正常愈合，形成骨髓炎后会导致坏死骨、空洞、窦道等形成，进一步加重骨缺损的严重性。现今的骨修复材料多存在生物活性不足、修复速率慢、修复效果不佳、无法抵御外界细菌感染等普遍性问题。因此，在过去几年中，多功能生物活性材料治疗创伤、肿瘤、感染或遗传畸形等骨缺损受到了广泛关注。1970年，carlisle研究表明，硅(si)元素可能在类骨病组织(preosseoustissue)矿化过程中发挥重要的作用。许多研究硅酸盐生物活性材料，包括磷酸钙和生物活性玻璃，已被用于骨再生的研究。银是一种广谱性杀菌材料，是研究最为热门的无机抗菌剂。文献报道，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及厌氧菌均有较强的杀菌能力。近年来，进一步研究发现msns可应用于载带银离子或银纳米颗粒实现抗菌功能。美国uclajeffreyi.zink率先制备出载银纳米颗粒的核壳形mcm-41介孔纳米颗粒，并证明其在液相悬浮介质和lb模板中均显示出极好的广谱抑菌性能。近年来载银介孔氧化硅纳米颗粒(themesoporoussilicananoparticlesencapsulatedwithsilvernanociystals,ag-msn)用于骨的研究已受到重视。然而，大多数研究都集中在改进聚合物/介孔二氧化硅复合材料的力学性能以及杀菌作用。这些研究表明，载银介孔氧化硅具有良好的生物相容性，但没有关于骨修复材料具有成骨效果的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒及其制备方法和应用，所述载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒不仅具有较好的杀菌作用，而且促进bmscs成骨作用和促进bmscs血管化作用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)将载银介孔氧化硅纳米颗粒置于含有0.6～1.5mg/ml的pdgf-bb的磷酸缓冲溶液中，23～28℃避光条件下搅拌吸附22～26h，得到预混液；(2)将所述步骤(1)中的预混液用磷酸缓冲溶液洗涤，离心，收集固相，得到载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒。优选的，所述载银介孔氧化硅纳米颗粒的质量与含有pdgf-bb的磷酸缓冲溶液的体积比为9～12mg：9～12ml。优选的，所述pdgf-bb在载银介孔氧化硅纳米颗粒表面的浓度为5～10μg/ml。优选的，所述载银介孔氧化硅纳米颗粒中介载银的量为5～10mg/ml。优选的，所述载银介孔氧化硅纳米颗粒的直径为2～4μm。本发明提供了所述的载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒在制备促进骨髓间充质干细胞分化的组织工程骨中的应用。优选的，所述骨髓间充质干细胞分化包括成骨化和/或血管化。本发明提供了所述方法制备的载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒(p-ag-msn)，利用载银介孔氧化硅纳米颗粒(ag-msn)载携并能逐步释放促进组织血管化的生长因子(pdgf-bb)，在骨的塑形和重塑过程中促进干细胞血管化成为组织工程血管化，同时能够在体液环境中释放银离子，发挥杀菌作用，能为骨组织再生材料提出一种全新理念，即能够诱导骨髓间充质干细胞(bmscs)的多向分化，同时具有控制感染效能的单一生物材料系统。qrt-pcr法实时定量检测成骨样细胞以及成血管分化相关基因表达检测，结果表明：3天以后各组p-ag-msn组的成骨样细胞的alp基因表达量较对照组显著增加有统计学差异。bmscs细胞中vegf，hif-1a，ang-1和hgf蛋白表达较ag-msn处理相比，具有显著增加。所述p-ag-msn对相关致病菌mic/mbc检测，实验结果提示f-ag-msn在体外对于慢性骨髓炎的常见致病菌具有广谱抗菌能力。同时本发明提供的p-ag-msn对细胞没有毒性，采用cck8法检测材料的细胞毒性，根据cck8法测定的od值计算相对增殖率(rgr)，50ug/ml的p-ag-msn组对bmscs增殖能力有轻度的抑制，但随后在3天、5天、7天时，4组不同浓度的p-ag-msn均未抑制bmscs细胞的增殖，无统计学差异。附图说明图1为p-ag-msn的电镜图片和小角度xrd分析图，其中图1-a为p-ag-msn的电镜t图片；图1-b为小角x射线衍射图；图2为不同浓度p-ag-msn在模拟体液中银离子释放曲线；图3为不同浓度组的msns对pdgf-bb的释放趋势结果；图4为p-ag-msn对bmscs的新陈代谢活力的影响结果；图5为用不同浓度的ag-msn和p-ag-ms培养7天后的bmscs中alp，ocpandrunx2蛋白表达的elisa分析结果，其中图5-a为alp蛋白表达情况，图5-b为opn蛋白表达情况，图5-c为ocn蛋白表达情况，图5-d为runx2蛋白表达情况；图6为采用rt-pcr法检测p-ag-msn对培养7天的bmscs中成骨基因表达的影响，其中图6-a为alp基因表达结果，图6-b为opn基因表达结果，图6-c为ocn基因表达结果和runx2基因表达结果；图7为用不同浓度的ag-msnandp-ag-ms培养7天后的bmscs中骨相关基因表达的影响，其中图7-a为alp蛋白表达情况，图7-b为opn蛋白表达情况，图7-c为ocn蛋白表达情况，图7-d为runx2蛋白表达情况；图8为p-ag-msn对bmscs中的血管生成分化的影响；图8-a为mscs原代培养三天，图8-b为添加10μgpdgf-bb三天；图8-c为添加10μgpdgf-bb7天；图8-d为添加10μgpdgf-bb7天20倍；图8-e为添加10μgpdgf-bb7天荧光共聚焦图像；图9为用不同浓度的ag-msnandp-ag-msn溶液对培养7天后的bmscs中基因表达的影响，图9-a和图9-b为vegf基因表达的情况，图9-c和图9-d为hif-1α基因表达的情况，图9-e和图9-f为hgf基因表达的情况，图9-g和图9-h为ang-1基因表达的情况；图10为用不同浓度的ag-msn和p-ag-msn溶液培养的bmscs中vegf,hif-1a,hgfandang-1蛋白表达的westernblotting分析。图11为p-ag-msn对相关致病菌mic/mbc检测结果；图12为各类细菌生长曲线检测结果，其中图12-a为大肠埃希菌100/50/25μg/ml组在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)，图12-b为白色念珠球菌组100/50μg/ml在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)，图12-c为铜绿假单胞菌细菌100/50μg/ml组在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)，图12-d为金黄色葡萄球菌100μg/ml组在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)。具体实施方式本发明提供了一种载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)将载银介孔氧化硅纳米颗粒置于含有0.6～1.5mg/ml的pdgf-bb的磷酸缓冲溶液中，23～28℃避光条件下搅拌吸附22～26h，得到预混液；(2)将所述步骤(1)中的预混液用磷酸缓冲溶液洗涤，离心，收集固相，得到载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒。本发明将载银介孔氧化硅纳米颗粒置于含有0.6～1.5mg/ml的pdgf-bb的磷酸缓冲溶液中，23～28℃避光条件下搅拌22～26h，得到预混液。在本发明中，所述载银二氧化硅微球的制备方法具体参见刘艳于2013年表发的名称为《中空介孔载银二氧化硅微球的制备及其抗菌性能研究》的硕士论文(浙江大学)中记载的制备方法即可。所述二氧化硅微球和银离子的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的来源即可。在本发明中，pdgf-bb为血小板衍生生长因子-bb，来源为购自北京奥博来公司。在本发明中，所述载银介孔氧化硅纳米颗粒的质量与含有0.6～1.5mg/ml的pdgf-bb的磷酸缓冲溶液的体积比为9～12mg：9～12ml，更优选为10mg：10ml。所述pdgf-bb的磷酸缓冲溶液浓度优选为0.8～1.2mg/ml，更优选为1.0mg/ml。所述磷酸缓冲溶液的ph值为7.4。所述搅拌的温度优选为25℃。所述搅拌的时间优选为23～25h，更优选为24h。得到预混液后，本发明将所述预混液用磷酸缓冲溶液洗涤，离心，收集固相，得到载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒。在本发明中，所述洗涤用磷酸缓冲溶液的ph值优选为7.4。所述离心的条件优选如下：转速1000～3000rpm，时间为5～10min；更优选为转速1500～2500rpm，时间为7～9min；最优选为转速2000rpm，时间为8min。所述洗涤和离心的次数优选为2～3次。本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒，包括载银介孔氧化硅纳米颗粒载体和负载在所述载银介孔氧化硅纳米颗粒载体的pdgf-bb。在本发明中，用紫外分光光度计测量添加载银二氧化硅微球前后的pdgf-bb的磷酸缓冲溶液的吸光度，得到负载在ag-msn上的pdgf-bb质量，通过式i计算pdgf-bb的负载率：负载量＝ag-msn负载的pdgf-bb质量/ag-msn加入的质量(式i)在本发明中，所述载银介孔氧化硅纳米颗粒中载携pdgf-bb的量优选为5～10μg/ml，更优选为7μg/ml。所述载银介孔氧化硅纳米颗粒中介载银的量优选为5～10mg/ml，更优选为7mg/ml。所述载银介孔氧化硅纳米颗粒的直径优选为2～4μm，更优选为3μm。所述ag-msn的体表面积比较大，表面积达到462.7m2g-1以上，有足够的空间载携pdgf-bb。本发明提供了所述的载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒在制备促进骨髓间充质干细胞分化组织工程骨中的应用。所述骨髓间充质干细胞分化优选包括成骨化和/或血管化。在本发明中，硅离子促进bmscs成骨作用，pdgf-bb促进bmscs血管化作用以及银离子具有杀菌作用。所述p-ag-msn的应用浓度为不高于50μg/ml，更优选为不高于25μg/ml。在体外或临床中，通过f-ag-msn释放的pdgf-bb的刺激可促进血管生成与骨形成的耦合，有望成为骨缺损的潜在治疗靶标。下面结合实施例对本发明提供的一种载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1采用模板法与法相结合的工艺，制备了粒径约3um球形规则、粒度均一的单分散性中空介孔二氧化硅微球。ag+通过静电引力吸附在磺化聚苯乙烯(ps)模板微球表面，随后被pvp还原并稳定，得到ps/ag复合微球；然后，teos在氨水催化作用下生成的二氧化硅胶粒依靠氢键作用包覆在ps/ag微球表面，形成二氧化硅球壳；最后，通过煅烧去除ps球和pvp，得到具有中空介孔结构的载银二氧化硅微球(ag-msn)。具体参见刘艳于2013年表发的名称为《中空介孔载银二氧化硅微球的制备及其抗菌性能研究》的硕士论文中记载的制备方法即可。将上述制备的ag-msn10mg在10ml含有不同浓度的pdgf-bb(0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml)的磷酸缓冲溶液(pbs，ph＝7.4)中，室温避光下搅拌24h达到吸附平衡，制得了pdgf-bb负载的ag-msn样品(p-ag-msn)。随后用pbs溶液多次离心洗涤，将材料表面未负载的pdgf-bb去除，用紫外分光光度计测量吸附前后的吸光度。pdgf-bb的负载率通过以下公式进行计算：负载率(％)＝ag-msn负载的pdgf-bb量/ag-msn加入的量×100％。对得到的p-ag-msn进行表征，结果见图1。图1为p-ag-msn的形态和结构图片。由图1可通过tem图像显示了msn的分散性和形貌(图1-a)。低倍透射电镜分析球形尺寸大多在30～40nm之间。小角x射线衍射(saxrd)分析显示不同的衍射峰在2θ＝2°，这表明msns已经具有有序细观结构。实施例2精密称取2mg的p-ag-msn，融入l0mlsbf内，采用超声振荡仪于超声震荡l0min,获得200ug/ml材料的sbf，釆用倍数梯度稀释法获得含100、50、25、12.5ng/ml材料的sbf，每组sbf各分至9个ep管内，每管1ml，置于36℃温箱中保存，分别于30min,1h,3h,6h,12h,24h,3d,7d,l0d,14d每组各取一管置于高速离心机内行7000r离心l0min，取上清液，采用火焰原子吸收光谱法检测上清液内的银离子浓度，获得各组的银离子释放曲线。p-ag-msn在模拟体液中银离子释放曲线的检测结果如图2所示。由图2可知，p-ag-msn浸泡3～6小时后银离子释放达到峰值；银离子释放量占总含银量30％左右；浸泡3d后银离子含量逐渐下降。在整个释放过程中，各浓度组的总释放趋势基本一致。实施例3将实施例1制备的负载p-ag-msn在37℃下，pbs(ph＝7.4)稀释后成为不同浓度pdgf-bb的溶液(100μg/ml,50μg/ml和25μg/ml)。pdgf-bb体外释放实验采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法测定。取5块复合物放置于100mlpbs的缓冲液中，置于37℃恒温箱中；按照pdgf-bbelisa试剂盒说明检测缓冲液pdgf-bb含量的变化，以释放时间为横坐标、累积释放百分率为纵坐标，绘制体外释放曲线。pdgf-bb的装载量与pdgf-bbinpbs溶液浓度的增大而增大。药物分子的扩散是由外部解和中孔通道之间的浓度梯度的控制，和物理吸附负载药物的主要力量，药物分子的变化随着溶液浓度的增加可作为显示inzeta电位测试、pdgf-bb负载量的增加后，绝对值从8.32增加到18.73。结果表明，pdgf-bb成功加载在介孔氧化硅的孔中。在整个释放过程中，各浓度组的pdgf-bb总释放趋势基本一致；整个发布过程中，各浓度组的整体释放发展动向基本相同。爆发释放70％～80％载p-ag-msn在第一个3天而3p-ag-msn药物释放具有缓释直到10天。70％～80％突释的加载p-ag-msn在最初的3天中，p-ag-msn药物释放一直持续到第十天。图3为不同浓度组中msns对pdgf-bb的释放趋势结果。pdgf-bb可以持续释放255天。实施例4采用细胞毒性检测试剂盒(cck8)进行检测。将bmscs按一定密度与mem培养基接种在培养板中24小时，待细胞在培养瓶或培养板上成功贴壁并融合至80％以上，加入0.25wt％edta进行溶解，取96孔板，每孔加入细胞悬液100μl(约1*104的细胞)，置于37℃，5％co2的培养箱内培养24小时，弃原培养液，加入以上配制的实验组(0.25、12.5、25和50μg/m的p-ag-msn)及对照组(ag-msn)的培养基悬液共培养，分别于1、3和7天三个时间点时取出培养板，弃培养液并用pbs洗涤细胞一次，随后加入l0ul的新型细胞增殖及毒性检测溶液，在37℃，5％co2条件下共培养4小时，在酶标仪450mn波长下检测每孔的光密度od值，每个材料组在每个时间点做3个重复孔。实验组的od值与对照组进行对比，进而评价其细胞毒性。cck8法检测材料的细胞毒性(mg63)结果如表1和图4所示。表1不同处理浓度的p-ag-msn在不同培养时间内细胞增值率结果不同处理的浓度(μg/m)第1天第3天第5天第7天对照组(ag-msn)100％100％100％100％p-ag-msn6.25105.43％101.23％95.76％94.86％p-ag-msn12.5102.58％97.65％94.85％93.69％p-ag-msn2596.75％95.82％93.77％92.65％p-ag-msn5089.76％87.61％89.67％88.53％根据cck8法测定的od值计算相对增殖率(rgr)，50ug/ml的p-ag-msn组对bmscs增殖能力有轻度的抑制，但随后在3天、5天、7天时，4组不同浓度的p-ag-msn均未抑制bmscs细胞的增殖，无统计学差异(图4)。实施例5elisa法检测成骨样细胞分化相关因子分泌量bmscs细胞按一定密度与mem培养基接种在培养板中24小时，待细胞在培养瓶或培养板上成功贴壁并融合至80％以上，加入0.25％edta进行溶解，加入培养基调成约1*105的细胞悬液，取6孔板，每孔加入细胞悬液1ml，空白培养基1ml，置于37℃，5％co2的培养箱内培养24小时，弃原培养液，加入实验组及对照组的培养基悬液共培养，分别于1、3、5和7天四个时间点时取出培养板，仔细收集上清液，放入ep管中，按照alp，ocn以及runx2的elisa试剂盒进行操作，分光光度计450nm波长处测定各孔od值，每个实验组做3个副孔。结果如图5所示。由图5可知，p-ag-msn可促进mscs成骨化作用。实施例6qrt-pcr法实时定量检测成骨样细胞以及成血管分化相关基因表达依照sybrpremixextaqtmii(takara)试剂盒说明书的指导操作。使用rotor-gene3000a荧光定量pcr仪(corbett)，检测实施例5中配制的实验组和对照组成骨样细胞细胞中alp与ocn的mrna的表达。分别用gapdh为内参照，配制反应缓冲体系最后通过对荧光强度的分析来达到定量检测目基因表达量的目的(见表2)。表2不同基因的扩增引物序列情况结果如图6所示。图6为real-timeqrt-pcr检测各实验组与对照组在不同时间点alp基因表达量。由图6可见，1天内，各实验组与对照组相比alp基因表达量无明显统计学差异，而3天以后各组p-ag-msn组的成骨样细胞的alp基因表达量较对照组显著增加，有统计学差异(*versuscon,p<0.05.)。结果进一步证实，ocn、opn、runx2的表达对纳米微球中的浓度增加随产生依赖性，特别是与p-ag-msn浓度一致(图6-b，图6-c和图6-d)，但差异不显著ag-msn和p-ag-msn之间在相同的浓度。酶联免疫分析表明，ocnopn、runx2蛋白的表达与实时荧光定量pcr分析结果一致(图6)。碱性磷酸酶基因的表达量在不同的时间点在所有实验组和对照组，采用实时荧光定量pcr检测组。比较实验组与对照组，alp基因表达量均无显著统计学差异；然而，alp基因表达量在p-ag-msn组的成骨细胞与对照组相比明显增高，差异有统计学意义(p＜0.05)。结果还表明，根据纳米微的浓度和p-ag-msn浓度增加，ocn、opn、runx2的表达增加(图6-b，图6-c和图6-d)。然而，在相同的浓度ag-msn和p-ag-msn无显著差异(图7)。elisa分析(图5)表明，ocn的表达，opn、runx2蛋白与实时荧光定量pcr分析结果一致。实施例7bmscs经过p-ag-msn诱导后微血管网形成1.剪切组织先将所取得的组织，用d-hanks或hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为(2～5)×105cells/ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置co2培养箱内，5％co2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1/2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。培养后2天，4天，7天分别利用激光扫描共聚焦显微镜观察。2天后，bmscs均无明显聚集趋势，小部分细胞有轻微拉伸，两种细胞之间无相互作用或联系(图8-a)。4天后，大部分mscs呈明显聚集、拉伸趋势，细胞之间相互连接，可见轻微管状结构；7天后，mscs有明显伸展，mscs相互聚集形成明显类血管网状结构，mscs形成的类血管网状结构聚集靠拢，甚至参与其构成(图8)。管腔结构明显，mscs形成管腔的大部分结构，为构成共培养体系中微血管的主要元素，维持并稳定其类血管网状结构；而mscs聚集在微血管周围，部分bmscs与huvecs相互连接，共同参与其管壁形成(图8)。实施例8分别用0、12.5、25、50μg/ml不同浓度的ag-msn和p-ag-msn溶液处理成骨样细胞，统计培养7d和14d时细胞中vegf基因、hif-1α基因、hgf基因和ang-1基因的表达情况，方法参见实施例6。结果见图9。图9为用不同浓度的ag-msn和p-ag-msn溶液对培养7天和14天后的bmscs中基因表达的影响，其中图9-a和图9-b为vegf基因表达的情况，图9-c和图9-d为hif-1α基因表达的情况，图9-e和图9-f为hgf基因表达的情况，图9-g和图9-h为ang-1基因表达的情况。由图9可知，不同浓度的ag-msn对细胞中vegf基因、hif-1α基因、hgf基因和ang-1基因的表达量没有变化，而p-ag-msn溶液随着浓度的升高的细胞中vegf基因、hif-1α基因、hgf基因和ang-1基因表达量逐渐升高；同时随着时间的延长，细胞中vegf基因、hif-1α基因、hgf基因和ang-1基因的表达量也随之升高。这表明p-ag-msn溶液有助于提高细胞中vegf基因、hif-1α基因、hgf基因和ang-1基因的表达量。实施例9为了进一步探讨p-ag-msn对mscs的血管分化的影响，进行了westernblot法检测成骨样细胞opg/rankl通路关键因子opg/rankl蛋白的表达。从骨样细胞中提取的总可溶性蛋白在10％的硬纤维聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并经电泳转移到硝化纤维素膜上。用5％的牛奶阻断斑点，然后用蔬菜抗体(r&d系统，1:300)、hfgantiody(abcam，剑桥，马，1:950)、hif-1α抗体(r&d系统，1:500)、ang-1抗体(r&d系统，1:600)格氏抗体(碧云天，北京，中国，1:1000)。然后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠苗孵化出斑点。结果如图10所示，将p-ag-msn的加入后mscs与分泌vegf明显增加。hif-1α，hgf和ang-1蛋白表达也明显增强。实施例10f-ag-msn对于骨髄炎常见致病菌mic/mbc及生长曲线影响的检测1、标准菌株的细菌悬液制备所采用的标准菌株(大肠轩菌atcc25922、金黄色葡萄球菌atcc25923、铜绿假单胞菌atcc27853、白色念珠球菌atcc90029、脆弱拟杆菌atcc25285)均由新疆医科大学第一附属医院检验科提供，获取标准菌株原液后，先分别涂布于血琼脂平板(大肠杆菌、金葡菌、铜绿假单胞菌)或沙门罗氏平板(白色念珠球菌)于36℃培养箱内培养18～24小时进行细胞复苏(白色念珠球菌所需时间较长，约为24～36小时)，待细菌长满涂布区域时，即为细菌到达对数生长期，用无菌棉签挑取平板上的单一菌落，溶于5ml的生理盐水中，用标准比浊仪比浊至独度为0.5，可获得1.5*108个/l的细菌悬液，稀释150倍(100ul菌液溶于15ml生理盐水)即为1*106个/l的细菌悬液。2、标准肉汤稀释法检测材料mic及mbc实验步骤取小试管6支，标记为不同的组，1号加入1ml纯培养基，作为对照组，2号加入1ml含100ug/mlp-ag-msn的培养基悬液作为不含银材料对照组，采用倍数梯度稀释法分别向3-6号加入1ml含(100、50、25和12.5μg/mlp-ag-msn的培养基悬液作为实验组，分别往6支试管中加入1ml浓度为1*106个/l的目标细菌悬液，此时每个混合体系中即含有5*105个/l的细菌，1号试管为细菌对照组，2号试管为材料对照组，3-6号为分别含有100、50、25、12.5μg/mlf-ag-msn的实验组。置于36℃细菌培养箱中培养24小时，取出观察，与细菌对照组进行比较，悬液清亮的最低浓度即为材料对该种细菌的mic，各取每个试管中的l00ul混合液体分别涂板后再置于36℃细菌培养箱内培养24小时后取出观察菌群并计数，没有细菌生长或菌群数目小于5个的实验组材料浓度为材料对该种细菌的mbc。3、od600测细菌生长曲线实验步骤取无菌96孔板一块，中间的6排作为实验区域在板盖上做好标记，将每组细菌材料悬液分别移入96孔板内，每孔加入200μl的体系，每个实验组各做4个孔，第5孔加入100μl该组材料悬液和100μl纯培养基作为调零。分别于培养箱内培0,3,6,9,12,18,24小时时取出平板，每个孔分别吹匀后置于分光光度计内，使用od600的射线进行吸收峰值的检测，获得的数据进行调零后各个组的4个孔取平均值即可绘制各组的细菌生长曲线。4、统计学方法采用spss17.0统计学软件进行数据的统计学分析，数据使用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素或双因素方差分析，p<0.05认为是存在显著性差异。图11为材料mbc检测结果，由图11中可见，各细菌实验组中涂板培养24小时观察，平板无菌落或菌落数小于5个的最低p-ag-msn材料浓度即为其对于该种细菌的最低杀菌浓度(mbc)。结果显示，p-ag-msn对于金葡菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、脆弱拟杆菌的最小抑菌浓度(mic)均为200ug/ml，而最小杀菌浓度(mbc)则分别为400、200、200、200ug/ml。结果说明，释放出来的银及银离子在其中发挥了抗菌的作用。图12为各类细菌生长曲线检测，图12-a为大肠埃希菌100/50/25μg/ml组在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)；图12-b为白色念珠球菌组100/50μg/ml在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)；图12-c为铜绿假单胞菌细菌100/50μg/ml组在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)；图12-d为金黄色葡萄球菌100μg/ml组在12小时相对于对照组均能显著抑制细菌生长(p<0.05)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>新疆医科大学第一附属医院<120>一种载携pdgf-bb的载银介孔氧化硅纳米颗粒及其制备方法和应用<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cctcctcggaagacactctgacc23<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgcctggtagttgttgtgagcatag25<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcaaaggtgcagcctttgtg20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggctcccagccattgatacag21<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcacctgtgccataccagttaa22<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tgagatgggtcagggtttagc21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gtgataaattcagaagggagg21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cttttgctaatgcttcgtgt20<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gctgtcttgggtgcattgg19<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gcagcctgggaccacttg18<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tggagataggaaccagcctct21<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tggatttcaagacgggatgt20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tcgttccttgggattattgc20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcgcagttgttttgttttgg20<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15tcagcaatgcctcctgcac19<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16tctgggtggcagtgatggc19当前第1页12