本发明属于临床医学眼科显微手术材料技术领域，具体涉及一种有自由基清除功能的眼科手术粘弹剂及其制备方法和应用。
背景技术：
白内障是常见的致盲性眼病，指眼球内的晶状体发生混浊、由透明变成不透明，阻碍光线进入眼内，从而影响视力。白内障手术是解决这一病症最有效的方法，手术过程包括浑浊晶状体囊摘除和人工晶体放入。手术成功的一个关键因素是根据外科医生的判断，支撑出一个具有一定深度的前腔，便于插入眼内镜，同时在手术操作中保护眼内组织。随着现代医学技术的发展，粘弹剂从上世纪八十年代起作为一种新的白内障手术产品性辅助技术在临床医学眼科手术中得到广泛应用。粘弹剂是具有维持前房深度、利于手术操作、保护角膜内皮细胞、防止术中出血和分离粘连等具有保护功能的高分子材料，是人工晶状体植入手术的必备之物，可以显著提高白内障超声乳化吸出术手术的质量。
研究表明，超声乳化白内障吸出术手术过程中，探针的尖端在超声频率振荡下振动。超声波波长穿过房水，产生微小的空气气泡，膨胀和内爆释放能量和热量。能量和热量释放激发自由基的产生，可能损害角膜内皮细胞。过氧化氢(h2o2)通常在房水中处于极低水平处(0.025mm)。并有实验证明，过氧化氢水平高于0.3mm时对内皮细胞有急性毒性并引发角膜水肿。
现今大多数商业上可用的眼科粘弹剂，是以透明质酸钠(sh)为原料的凝胶制品，透明质酸钠(sh)具有自由基清除作用。然而，透明质酸钠(sh)对自由基的清除反应会伴随着其分子量的降低，降低了对角膜内皮细胞保护作用。开发出一种能高效清除自由基的粘弹剂具有很大的医学价值。
甘露醇又名d-甘露糖醇，分子式为c6h14o6，分子量182.17，是一种人们熟悉的六元醇，与山梨醇为同分异构体。甘露醇是一种不吸湿、无臭、白色或无色的结晶粉末。甘露醇无药理活性，在人体内也很少代谢，也不易通过毛细血管进入组织。在向体内注射甘露醇后，甘露醇分子只能在血管内流动，使组织与血管内系统产生渗透梯度，促进液体从组织流向血管，迅速提高血浆渗透压，使组织中过多的水分向血浆转移，然后通过肾脏排泄系统排出体外，达到利尿排水的作用。此外，甘露醇也是自由基清道夫，能够有效限制自由基对皮肤的氧化破坏力，组织自由基对产品的降解从而减少注射后的红肿反应，减缓凝胶分子的降解，使疗效更加持久。
中国专利cn104771331a公开了一种透明质酸弹性体，其主要是将透明质酸与交联剂反应，从而可以成为眼科粘弹剂。然而这种粘弹剂并未公开具有清除自由基的作用。
技术实现要素：
本发明主要提供了一种有自由基清除功能的眼科手术粘弹剂及其制备方法和应用，将甘露醇与透明质酸钠粘弹剂进行混合，在不影响粘弹剂本身的物理特性的同时赋予其自由基清除的功能。其技术方案如下：
一种有自由基清除功能的眼科手术粘弹剂，其由透明质酸钠与甘露醇磷酸盐缓冲液混合而成，所述粘弹剂中透明质酸钠的浓度为0.1-10wt％。
优选的，甘露醇磷酸盐缓冲液中甘露醇的质量浓度为0.05-2.0％。
一种上述有自由基清除功能的眼科手术粘弹剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取甘露醇固体溶于磷酸盐缓冲液中，得到浓度为0.05-2.0wt％的甘露醇磷酸盐缓冲液，通过滤膜过滤；
(2)称取透明质酸钠干粉，溶于甘露醇磷酸盐缓冲液中，低温静置得到透明质酸钠浓度为0.1-10wt％的透明质酸钠溶液；
(3)将透明质酸钠溶液高温高压灭菌，即得具有自由基清除功能的眼科手术粘弹剂。
优选的，步骤(1)中滤膜的孔径为0.22μm。
上述粘弹剂在眼部手术对角膜内皮细胞保护中的应用。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
本发明粘弹剂将甘露醇与透明质酸钠粘弹剂进行混合，在不影响粘弹剂本身的物理特性的同时赋予其自由基清除的功能。可在白内障手术的中减少超声乳化白内障吸出术过程中的自由基伤害，有效降低角膜内皮细胞损伤以及角膜红肿等现象，提高手术质量，减少角膜内皮细胞自由基损伤，对角膜内皮细胞有很好的保护作用。
附图说明
图1为含有甘露醇与不含有甘露醇的透明质酸钠凝胶动力粘度对比图。
具体实施方式
称取甘露醇固体溶解于磷酸盐缓冲液中(ph7.2)，配制成浓度为0.05-2％(w/v)的溶液，然后采用0.22μm的滤膜过滤，低温静置待用。将透明质酸钠干粉溶解于已配制好的缓冲液溶液中，配制成浓度为1.0-2.5％(w/v)的凝胶溶液，低温静置直至溶解均匀，然后121℃高温高压灭菌15min，制备成具有自由基清除功能的透明质酸钠粘弹剂。
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
实施例1
称取甘露醇固体1.00g，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为1％的含甘露醇缓冲液，并通过0.22μm的滤膜过滤。分别称取2.0g透明质酸钠干粉，溶于含甘露醇及不含甘露醇的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的透明质酸钠凝胶溶液。
实施例2
称取甘露醇固体0.50g，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为0.5％的含甘露醇缓冲液，并通过0.22μm的滤膜过滤。称取2.0g透明质酸钠干粉，溶于含甘露醇及不含甘露醇的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的透明质酸钠凝胶溶液。
实施例3
称取甘露醇固体0.20g，溶于100ml的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为0.2％的含甘露醇缓冲液，并通过0.22μm的滤膜过滤。称取2.0g透明质酸钠干粉，溶于含甘露醇及不含甘露醇的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为20mg/ml的透明质酸钠凝胶溶液。
实施例4
以含0.5％甘露醇的缓冲液为溶剂，配制20mg/ml的透明质酸钠溶液，121℃，灭菌15min，取样0.5ml采用taar2000cx流变仪在0.001-100hz下进行频率扫描。同时使用《中国药典2015年版》通则0633黏度测定法第二法对样品进行测试。
表1粘度测试结果
实施例5
1、羟基自由基法测含甘露醇眼科粘弹剂及甘露醇与透明质酸粘弹剂自由基清除能力，测试原理如下：
在亚铁离子作用下，过氧化氢生成羟基自由基，加入水杨酸捕捉生成的羟自由基，生成紫色产物，产物在可见光区有特征吸收。当有抗氧化剂存在时，将与水杨酸竞争捕捉羟自由基，使紫色产物减少，吸光度改变。通过对比吸光度的变化，评价待测物的抗氧化活性。
方法：分别取6mmol/lfeso4溶液2ml，样品液2ml，6mmol/lh2o2溶液2ml，静置10min后，加入6mmol/l水杨酸溶液2ml，静置30min后，于波长510nm处测吸光度。空白对照用蒸馏水代替样品液，其余不变。
式中：
a0为空白对照的吸光度；
a1为某质量浓度样品液的吸光度；
a2为无水杨酸时样品液的吸光度。
2、羟基自由基法对实施例1、2、3制备的含甘露醇缓冲液、透明质酸钠凝胶以及含甘露醇的透明质酸钠凝胶进行测试。测试结果如下：
表2羟基自由基法测样品自由基清除能力
由表2可看出，甘露醇具有很好的羟基自由基清除效果，且浓度越高清除效果越好。透明质酸钠凝胶也具有一定的自由基清除能力，含有甘露醇的透明质酸钠凝胶自由基清除功能有叠加效应。
实施例6
1、建立兔眼角膜内皮组织损伤模型，通过一根30g针头从动物的眼睛里穿过角膜边缘取出约100毫升的房水，将眼科粘弹剂注入上述部位填充满；等待一分钟，通过20g针头插入冲洗/吸出套管，用生理盐水进行彻底冲洗。注入100μl一定浓度的h2o2溶液，并用生理盐水填充剩余前房区域，对照组注入生理盐水，动物保存麻醉状态下5小时后处死取材。对角膜组织进行环形钻孔取材，janusgreen染色法测试角膜内皮组织损伤程度。
这个方法允许对裸露的内皮细胞受到不可逆过程的氧化变性影响进行定量测试。janusgreen染料能有目的地对变形区域染色而不染色活性内皮细胞。角膜内皮细胞侧用200μl的1％janusgreen染料溶液(sigma)孵育90秒。用平衡生理盐水将游离染料从表皮细胞上冲洗2min去除，然后对角膜进行环钻取材。
与角膜内皮细胞结合的染料通过在1ml纯酒精中浸泡90s从角膜组织中脱离，将带有janusgreen染料的酒精溶液进行十倍稀释。将janusgreen染料去除的酒精样品被稀释为10％，用分光光度计进行光度测量。
2、目的：以兔子为试验对象，建立兔眼角膜内皮组织损伤模型，进行自由基清除能力动物实验效果观察
样品：实施例1、2、3制备的透明质酸钠凝胶样品及含甘露醇的透明质酸钠凝胶样品。
动物：健康新西兰白兔20只。
实验操作：兔眼角膜内皮组织损伤模型对实施例1、2、3制备的透明质酸钠凝胶以及含甘露醇的透明质酸钠凝胶进行测试，h2o2采用10mm浓度。生理盐水缓冲液作为对照组，每组五只兔子，共10只眼镜，以生理盐水平衡液代替粘弹剂作为对照组，为100％伤害。实验结果如下：
表2动物实验内皮损伤情况评价
动物实验结果显示，添加了甘露醇的透明质酸钠凝胶对使用单独透明质酸钠凝胶对角膜内皮细胞具有更强的效果。
实施例7
甘露醇的加入对透明质酸钠粘弹剂性能影响的试验研究
分别以磷酸盐缓冲液和含0.5％的甘露醇磷酸盐缓冲液为溶剂，配制20mg/ml浓度的透明质酸钠溶液，并采用taar2000cx流变仪在0.001-100hz下进行频率扫描。频率扫描结果显示(图1)，添加甘露醇后的透明质酸钠凝胶的流变学特性和粘弹性能有适当提高。同时对含有和不含甘露醇的透明质酸钠凝胶样品进行测试发现，添加甘露醇的透明质酸钠凝胶特性粘数也有所提高。因此，这种具有自由基清除功能的眼科粘弹剂同透明质酸钠凝胶在眼科手术中的作用一样，可以有效的保护角膜内皮细胞免受损伤。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。