本发明涉及干细胞技术领域，具体是一种用脐带间充质干细胞分泌细胞因子制备的口腔溃疡软膏及制备方法。
背景技术
复发性口腔溃疡(recurrentoralulcer,rou)是一种常发于唇、舌、颊、和软腭等部位的口腔黏膜疾病，常伴有自发性疼痛，易反复发作，严重影响患者生活质量。复发性口腔溃疡的发病原因主要包括自身免疫障碍、局部损伤、精神压力、饮食等因素。目前尚无根治复发性口腔溃疡的有效方法，只能通过减少复发次数、延长发作间隙、减轻疼痛和促进愈合等方法进行治疗。口腔溃疡的病因主要有以下几种：1)自身免疫反应，通过研究发现复发性口腔溃疡是由于患者的细胞免疫功能出现异常，免疫调节功能处于失衡状态，正常的免疫调节功能紊乱，是一种自身免疫性疾病，其病理过程不仅涉及固有免疫，还与th1/th2失衡、cd4+cd25+foxp3+的treg细胞功能减低数量减少、细胞因子分泌紊乱、粘膜抗体形成、口腔黏膜局部siga低表达以及过敏反应等一系列免疫紊乱反应有关，并发现局部微循环改变以及氧自由基介导的免疫紊乱也参与了复发性口腔溃疡的发病；2)人体血清中铁、锌、铜、钙、锰、锡等微量元素的缺乏可导致复发性口腔溃疡，尤其是铁元素的缺乏可导致免疫细胞活性失调，以至于全身及局部的免疫调节紊乱，口腔上皮变薄，局部发生坏死后溃疡形成；3)内分泌改变，月经前精神紧张可诱发复发性口腔溃疡，女性复发性口腔溃疡患者在月经前发生的原因是血清中孕酮的含量偏低；4)局部微循环障碍引起口腔溃疡，毛细血管扩张以及血液粘度增强血流速度减慢，毛细血管中白细胞增多，以导致溃疡的发生；5)口腔菌群的改变，已有研究证实复发性口腔溃疡的发病存在口腔菌群的变化，其中链球菌和韦荣氏菌显著减少；6)其他变态反应、胃肠疾病、细菌或病毒感染、神经营养障碍、维生素缺乏、精神因素、局部创伤、吸烟、高龄和遗传等原因也可引起口腔溃疡的发生。
口腔溃疡的常用治疗方法包括：①化学药治疗，主要包括消化系统药物、抗菌抗病毒和消毒防腐药物、维生素类药物和免疫调节药物等。消化系统药物主要是蒙脱石散，为天然蒙脱石微粒粉剂，对消化道内的病毒、病菌及其产生的毒素、气体等具有固定和抑制作用，使其失去致病作用，对消化道粘膜具有覆盖保护能力，能修复、提高粘膜屏障对攻击因子的防御功能；抗菌抗病毒药物可对多种病原菌有较强的杀灭作用，还可抑制炎症过程中毛细血管渗透性，消除溃疡创面周围淤肿，抑制炎症过程的介质释放，起到止痛的效果；维生素类药物也可以有效的缩短病程，促进溃疡创面愈合；免疫调节和免疫抑制剂类药物如糖皮质激素，常用强的松。另外，具有非特异性抗炎作用的细胞毒类药物常与糖皮质激素联用来治疗口腔溃疡。因细胞毒类药物只对于增殖活跃的淋巴细胞具有较强的毒性，但是对于已经高度分化的小淋巴细胞作用则不明显，因此治疗效果有限；提高免疫功能的药物转移分子，可提高机体的免疫功能，如左旋咪唑，可调节机体的免疫功能；②补充有关微量元素，甘草锌治疗复发性口腔溃疡效果良好，因为锌是人体必不可少的微量元素，它能增强创伤组织的再生能力。硫酸铜治疗口腔溃疡也取得了一定的效果，因为微量元素铜可能促进局部的新陈代谢，加速溃疡伤口的愈合。用微量元素钙治疗口腔溃疡也具有一定的疗效，微量元素钙在人体内参与肌肉的兴奋与收缩过程，使得腺体分泌，影响细胞膜上供离子通过的闸门开关，促进血液凝固以进行组织的修复；③治疗内分泌障碍，治疗内分泌障碍对于经期前诱发的口腔溃疡具有一定的镇静治疗作用；④中医药治疗，中医药治疗一般可用于缩短病程、减轻症状，促进溃疡伤口的愈合。但因复发性口腔溃疡是由自身免疫系统障碍引发的自身免疫系统疾病，所以以上这些药物治疗具有一定的局限性，很难从根本上进行治疗，也会引起一定的不良反应，如对口腔粘膜的刺激性，患者感觉不舒适，不易接受等，还有一些药物还会产生全身的副作用。
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)可以从脐带、骨髓、脂肪和羊膜等组织分离而来，具有免疫抑制和免疫调节功能，可以抑制免疫细胞异常增殖和具有抗炎症的免疫调节作用。间充质干细胞通过分泌可溶性因子介导免疫抑制，主要包括肝细胞生长因子(hgf)、il-4、il-10、shla-g和tgf-β1等。其中hgf具有促进细胞有丝分裂和抗凋亡的生物活性，并且能够造成一个免疫抑制的微环境；il-4可降低依赖th1的迟发型超敏反应，能阻抗th1分泌的inf-γ发挥生物学功效，从而起到免疫抑制的作用；il-10是公认的treg生长因子，在免疫应答过程中拮抗il-12，是免疫负调节因子，可以部分拮抗间充质干细胞的免疫抑制作用；shla-g是机体内重要的免疫耐受分子，通过异常表达使自身免疫耐受缺失或炎症紊乱，进而诱导免疫抑制；tgf-β1是重要的免疫负调节因子，可以抑制淋巴细胞以外的细胞，除以上细胞因子之外，间充质干细胞还分泌一些小分子化学物质参与介导局部的免疫抑制，如环氧合酶和bt-h1等。
间充质干细胞还可分泌外泌体(exosome)，外泌体是一种由胞内质膜性细胞器内质网和高尔基复合体主动合成并分泌到细胞外环境的直径在30～120nm左右的微型质膜囊体结构，是除细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式，间充质干细胞来源的外泌体内含多种细胞因子、热休克蛋白和microrna等，可保护这些蛋白因子和小分子核酸不被降解，延长半衰期。exosome已被证实对肾脏损伤、心肌梗死、神经系统疾病等多个器官功能损伤具有明确保护作用，可以逆转细胞凋亡趋势，促进组织细胞损伤修复，可有效的促进溃疡组织的修复，加速伤口愈合。
综上所述，间充质干细胞分泌的细胞因子和外泌体具有显著的免疫调节作用，可以显著改善机体的免疫调节功能，从而起到免疫抑制的作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用脐带间充质干细胞分泌细胞因子制备的口腔溃疡软膏及制备方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用脐带间充质干细胞分泌细胞因子制备的口腔溃疡软膏，口腔溃疡软膏的基础液是水，以蛋白浓度代表脐带间充质干细胞分泌细胞因子浓度，口腔溃疡软膏的配方包含浓度为0.5μg/ml～6μg/ml的脐带间充质干细胞分泌细胞因子、质量百分比为1％～6％的金银花、质量百分比为1％～6％的板蓝根、质量百分比为1％～6％的蒲公英、质量百分比为1％～6％的大青叶、质量百分比为1％～8％的聚乙二醇、质量百分比为1％～8％的麦芽糊精和质量百分比为1％～8％的黄原胶。
作为优化，所述口腔溃疡软膏的配方包含浓度为3μg/ml的脐带间充质干细胞分泌细胞因子、质量百分比为3％的金银花、质量百分比为3％的板蓝根、质量百分比为3％的蒲公英、质量百分比为3％的大青叶、质量百分比为4％的聚乙二醇、质量百分比为4％的麦芽糊精和质量百分比为4％的黄原胶。
一种用脐带间充质干细胞分泌细胞因子制备口腔溃疡软膏的方法，该方法包括：
(1)脐带间充质干细胞的获得：无菌取脐带并弃血管，取血管周物质剪碎后，然后使用iv型胶原酶先消化后，离心取下层沉淀；然后再用胰蛋白酶-pbs继续消化，然后离心取沉淀；将沉淀物质悬浮于间充质干细胞培养基中进行培养，培养一定时间后换液再继续培养；到见成纤维状细胞在瓶底贴壁生长达到80％汇合时，再用胰蛋白酶-pbs消化后传代培养；
(2)脐带间充质干细胞分泌细胞因子冻干粉的制备：取f2～f6代的人脐带间充质干细胞，加入免疫调控促进剂和外泌体活化剂继续培养24小时后，收集细胞培养液，加入甘露醇后，冷冻干燥制成细胞因子冻干粉，存于-80℃备用；
(3)口腔溃疡软膏的制备：按照比例称取金银花、板蓝根、蒲公英、大青叶，分别研磨后过300目筛后溶于水，然后按照比例加入聚乙二醇、麦芽糊精、黄原胶，溶于水后，按照比例加入脐带间充质干细胞分泌细胞因子冻干粉，低温条件下不断搅拌制成口腔溃疡软膏，然后分装后于-2℃～-8℃保存。
作为优化，一种用脐带间充质干细胞分泌细胞因子制备口腔溃疡软膏的方法，该方法包括：
(1)脐带间充质干细胞的获得：无菌取脐带并弃血管，取血管周物质剪碎后，然后使用1‰的iv型胶原酶在37℃下消化，然后用2000r/min离心15min后取下层沉淀；再用0.25％胰蛋白酶-pbs继续消化，然后2000r/min离心15min后取下层沉淀，反复消化2次；再将沉淀物质以1×106个/ml的密度悬浮于间充质干细胞培养基中进行培养，培养环境为温度37℃、100％湿度、5％co2和黑暗环境，每3～4天换液1次，经2天可见成纤维状细胞在瓶底贴壁生长，约8～12天后纤维状细胞在瓶底贴壁生长能达到80％汇合时，再用0.25％胰蛋白酶-pbs消化后，再以细胞密度5×104个/cm2传代培养；
(2)脐带间充质干细胞分泌细胞因子冻干粉的制备：取f2～f6代的人脐带间充质干细胞，加入免疫调控促进剂和外泌体活化剂继续培养24小时后，收集细胞培养液，加入质量百分比为14％的甘露醇后，冷冻干燥制成细胞因子冻干粉，存于-80℃备用；
(3)口腔溃疡软膏的制备：按照比例称取金银花、板蓝根、蒲公英、大青叶，分别研磨后过300目筛后溶于水，然后按照比例加入聚乙二醇、麦芽糊精、黄原胶，溶于水后，按照0.5μg/ml～6μg/ml的最终浓度加入脐带间充质干细胞分泌细胞因子冻干粉，低温条件下不断搅拌制成口腔溃疡软膏，然后分装后于-2℃～-8℃保存。
作为优化，步骤(2)所述免疫调控促进剂和外泌体活化剂为按照浓度为0.005mg/ml～0.1mg/ml的cacl2、浓度为20μg/ml～100μg/ml的聚肌胞、浓度为1μg/ml～10μg/ml的脂多糖、浓度为0.5μg/ml～2μg/ml的维生素c和浓度为0.05ng/ml～0.2ng/ml的γ-干扰素(ifn—γ)配备的混合液。
作为优化，步骤(2)所述免疫调控促进剂和外泌体活化剂为按照浓度为0.01mg/ml的cacl2、浓度为50μg/ml的聚肌胞、浓度为5μg/ml的脂多糖、浓度为1μg/ml的维生素c和浓度为0.01ng/ml的γ-干扰素(ifn—γ)配备的混合液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种由脐带间充质干细胞分泌的细胞因子为主要配方、治疗口腔溃疡的口腔涂抹式软膏，为了增加间充质干细胞分泌免疫调控类细胞因子和外泌体的能力，本发明提供了一种添加免疫调控增强剂和外泌体活化剂激活脐带间充质干细胞的方法，并利用脐带间充质干细胞分泌细胞因子冻干粉和中草药提取物制备成口腔溃疡软膏，其中脐带间充质干细胞分泌细胞因子冻干粉包含免疫调控类细胞因子和组织修复类细胞因子。本发明使用时挤出适量软膏，涂抹于溃疡面，15分钟内尽量不喝水或进食，能够有效的治疗口腔溃疡。
在本发明所公布的口腔溃疡软膏的制备过程中，采用脐带间充质干细胞分泌的细胞因子冻干粉添加物，可直接调节紊乱的口腔黏膜下免疫，对黏膜下免疫体系进行改善，并不含激素成分，安全可靠。并辅以金银花、板蓝根、蒲公英、大青叶等对口腔溃疡具有显著疗效的中药成分，使得制剂滋阴活血，清热解毒，收敛止痛功能更效专力，麦芽糊精可以在口腔溃疡创面形成一层保护膜，有效的防止创面与其他部位的接触摩擦，减少疼痛感，而且使得药物在创面具有缓释的效果，比一般的药物更能发挥持久的药效。
本发明所公布的口腔溃疡软膏，由人脐带间充质干细胞所分泌的细胞因子作为主要功能成分，比基因工程改造的大肠杆菌所合成的细胞因子具有更好的蛋白折叠结构和糖基化修饰，因而生物学活性比基因工程产品细胞因子更好。
本发明脐带间充质干细胞细胞因子口腔软膏的制备采用直接混合浓缩的方法，工艺简单，能够满足国内大部分厂家生产现状的需要，生产工艺步骤简单，耗能少，几乎无污染物排放，满足了国家新环保法中关于节能环保的绿色生态清洁生产的要求。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
脐带间充质干细胞的获得：无菌取脐带剪成3cm左右小段，抽弃血管，取血管周物质剪碎后，先使用1‰的iv型胶原酶在消化2h，然后2000r/min离心10min，取下层沉淀再用0.25％胰蛋白酶-pbs在37℃继续消化25min，然后2000r/min离心10min，取细胞沉淀用0.25％胰蛋白酶液消化后，再800r/min离心10min，取细胞沉淀以1×106个/ml的密度悬浮于培养基中，培养基成分为商品化的市购间充质干细胞无血清培养基。置37℃、100％湿度、5％co2和黑暗环境下培养，每3天换液1次，经2天可见成纤维状细胞在瓶底生长，约10天后能达到80％汇合时用0.25％胰蛋白酶-pbs消化后，再以细胞密度5×104个/cm2传代培养。f4代的细胞用于收获细胞因子。
取f2～f6代的人脐带间充质干细胞，加入浓度为0.01mg/ml的cacl2、浓度为50μg/ml的聚肌胞、浓度为5μg/ml的脂多糖、终浓度为1μg/ml的维生素c和终浓度为0.01ng/ml的ifn-γ，，继续培养24小时后，收集细胞培养液，加入质量百分比为14％的甘露醇，冷冻干燥制成细胞因子冻干粉，存于-80℃备用；
收集的细胞培养液(activategroup)用0.22微米滤膜过滤后用elisa试剂盒测定犬尿氨酸(kynurenine)、前列腺素e2(prostaglandine，pge2)、shla-g(solublehla-g)、il10和tgf-β1的含量。未加入免疫调控促进剂和外泌体活化剂的msc细胞培养液作为对照组(ctrlgroup)。结果可见使用本发明所提供方法活化后的msc细胞分泌的shla-g、犬尿氨酸(kynurenine)、il10、pge2和tgf-β1量显著提高，结果见表1。
表1细胞培养液中细胞因子含量elisa检测结果统计表(n＝6)
含细胞因子的口腔溃疡软膏的制备：将金银花、板蓝根、蒲公英、大青叶分别研磨后过300目筛，均按照一定的比例加入聚乙二醇、麦芽糊精、黄原胶和细胞因子冻干粉，溶于水后低温条件下制成口腔溃疡软膏，金银花、板蓝根、蒲公英、大青叶的最终质量比为3％，聚乙二醇最终质量百分比4％、麦芽糊精最终质量百分比为4％、黄原胶最终质量百分比为4％、脐带间充质干细胞分泌细胞因子最终浓度为3μg/ml。分装于铝皮管中，保存于-2℃～-8℃。
治疗过程：随机选取40位口腔溃疡患者作为实验对象，以以上述操作中制得的口腔软膏作为实验例1和实验例2，以普通市售口腔溃疡口含贴片和普通市售口腔溃疡含片分别作为对照例1和对照例2。随机将40位实验对象每10人一组，共分为4组，分别实施实验例1～2和对照例1～2，每天观察各实验对象口腔溃疡创口情况，持续30天，记录痊愈的时间(平均值)，患者痊愈后继续保持观察，记录每组出现复发的人数，结果见表2。可见，与对照相比，本发明实施例1～2制得的间充质干细胞分泌细胞因子口腔溃疡软膏能够加速口腔溃疡痊愈的速度，并有效的防止复发。
表2治疗后口腔溃疡痊愈速度统计表(n＝10/组)
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。