一种用于细胞三维立体培养的复合支架材料的制作方法

本发明涉及一种用于细胞三维立体培养的复合支架材料。

背景技术

细胞的三维立体培养技术是利用可降解的材料制备的多孔支架进行细胞培养，该过程不同于常规的二维平面培养技术，能够在极大程度上模拟体内细胞的生存环境，使细胞产生一定的特异性结构。

目前制备的三维立体支架常用材料大致分为三类：天然高分子材料、合成高分子材料以及某些无机物。丝素蛋白(sf)、羟基磷灰石(ha)、聚乳酸-羟基乙酸(plga)是目前制备三维立体支架常用的天然可降解材料，其中sf属于天然高分子材料，具有良好的可塑性、生物相容性以及一定的可降解性，是理想的生物材料，可以用于组织工程支架的制备，但其机械性能较差，且降解速率不易控制；ha是天然骨无机盐成分，是理想的骨修复材料，力学性能和化学稳定性较强，但ha较高的化学稳定性也使其降解性能大大降低，而且其脆性大，也会对支架的性能产生较大的影响；plga是聚乳酸和聚羟基乙酸通过聚合而生成的共聚物，具有良好的可降解性能，但常常因其较高的造价及力学性能的不足，使其应用得到了限制。

现有的研究表明：sf单组份支架降解较快且机械性能较低，加入ha后所制备的sf/ha支架在机械性能方面虽然有所提高但是脆性大，易破碎；sf与plga因分别溶于不同的溶剂所以难以结合，且制备出的sf/plga支架机械性能较低。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有单一或者两类材料复合后制备的三维立体支架降解过快或难降解、机械性能差、细胞黏附率低等缺点，提供一种具有良好的机械性能、可控的降解速率以及良好的生物相容性的sf/ha/plga复合支架材料。

为实现上述目的，本发明所采用的sf/ha/plga复合支架材料由丝素蛋白、羟基磷灰石、聚乳酸-羟基乙酸按质量比为3:0.5～1.5:0.5～1.5制备而成，制备方法为：将丝素蛋白冻干粉和羟基磷灰石分别完全溶解于六氟异丙醇中，然后将聚乳酸-羟基乙酸加入羟基磷灰石的六氟异丙醇溶液中，搅拌使聚乳酸-羟基乙酸充分溶解后，与丝素蛋白冻干粉的六氟异丙醇溶液混合，搅拌均匀后置于48孔板中，用保鲜膜覆盖，冷冻干燥，得到丝素蛋白/羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸复合支架材料。

上述sf/ha/plga复合支架材料优选由丝素蛋白、羟基磷灰石、聚乳酸-羟基乙酸按质量比为3:1:1制备而成。

上述制备方法中，冷冻干燥前，优选先在-20℃下冷冻24～48h，然后再冷冻干燥。

上述制备方法中，冷冻干燥前，进一步优选先在-20℃下冷冻12～24h，然后在-80℃下冷冻4～12h，最后再冷冻干燥。

本发明的有益效果如下：

本发明通过将sf、ha以及plga三种不同类别的材料结合，在支架制备的过程中，由于sf属于水溶性材料，而plga常常更易溶于有机溶剂，所以本发明选择对二者皆具有良好溶解性能的六氟异丙醇作为溶剂；ha作为一种纳米级颗粒物，如果直接加入plga溶液，容易发生“抱团”现象，使ha与plga结合发生沉降，造成制备溶液不均。因此，本发明先将plga加入ha的六氟异丙醇溶液中，搅拌至完全溶解，然后将已充分溶解于六氟异丙醇的sf冻干粉溶液，使其混合更加充分、均匀，最后通过简单易操作的冻干法，将溶剂挥发，即制成sf/ha/plga复合支架材料。

本发明制备出的sf/ha/plga复合支架材料能够克服天然材料较低的机械强度、不可控制的降解速度、无机材料极其缓慢的降解速度和极大的脆性以及合成材料较高的造价和较低的力学性能等一系列不足，具有良好的机械性能、可控的降解速率以及良好的生物相容性，适于细胞生长，可用于人造皮肤，血管支架以及骨组织的修复等，同时利用所制备的三维立体支架构建的细胞模型可以进行中药活性成分筛选和分析、抗肿瘤机制研究、药物毒性评价等研究工作。

附图说明

图1是实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料的形貌。

图2是sf/ha支架材料的形貌(sf与ha的质量比为3:1)。

图3是实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料的扫描电镜图。

图4是sf/ha支架材料的扫描电镜图。

图5是sf/ha支架材料及实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料的孔隙率图。

图6是sf/ha支架材料及实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料的降解率图。

图7是细胞在实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料上孵育5天以后放大500倍的扫描电镜照片。

图8是细胞在sf/ha支架材料上孵育5天以后放大500倍的扫描电镜照片。

图9是细胞在实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料上孵育5天以后放大2000倍的扫描电镜照片。

图10是细胞在平面爬片上孵育5天以后放大500倍的扫描电镜照片。

图11是细胞在sf/ha支架材料及实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料上的增殖柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

将2.88gsf冻干粉加入到30ml六氟异丙醇中，磁力搅拌12h使其充分溶解；将0.96gha加入18ml六氟异丙醇中，超声分散5min，再加入0.96plga，磁力搅拌12h使其充分溶解；然后将两组溶液混合，磁力搅拌2h后置于48孔板中，用保鲜膜覆盖，在-20℃下冷冻12h，然后在-80℃下冷冻12h，最后再冷冻干燥24h，得到sf/ha/plga复合支架材料。

实施例2

将2.88gsf冻干粉加入到30ml六氟异丙醇中，磁力搅拌12h使其充分溶解；将0.48ha加入18ml六氟异丙醇中，超声分散5min，再加入0.96gplga，磁力搅拌12h使其充分溶解；然后将两组溶液混合，磁力搅拌2h后置于48孔板中，用保鲜膜覆盖，在-20℃下冷冻48h，然后再冷冻干燥24h，得到sf/ha/plga复合支架材料。

实施例3

将2.88gsf冻干粉加入到30ml六氟异丙醇中，磁力搅拌12h使其充分溶解；将0.96gha加入18ml六氟异丙醇中，超声分散5min，再加入0.48gplga，磁力搅拌12h使其充分溶解；然后将两组溶液混合，磁力搅拌2h后置于48孔板中，用保鲜膜覆盖，在-20℃下冷冻24h，然后再冷冻干燥24h，得到sf/ha/plga复合支架材料。

发明人对实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料进行了表征和性能测试，并以目前被广泛应用的两组分sf/ha支架材料为对照，具体试验及试验结果如下：

1、形貌特征

从图1和2中可以看出，sf/ha/plga复合支架材料表面光滑，呈疏松多孔状，较sf/ha支架材料表面看更加厚实。从图3和4中可以看出，两种支架材料均呈多孔结构，sf/ha/plga复合支架材料孔径较小，孔壁因ha颗粒的存在较粗糙，且孔与孔之间的连通性明显，这样的结构不仅有利于细胞的粘附和增殖，更有利于代谢物质和营养物质的运输。

2、孔隙率

经测量，sf/ha支架材料的平均孔径为1160±156μm，sf/ha/plga复合支架材料的平均孔径为493±137μm，两者有极显著差异(p＜0.01)。从图5中可以看出，两种支架材料的孔隙率都在85％以上，根据相关文献的报道，组织工程支架的孔隙率在70％以上即可利于细胞的粘附和增殖。

3、机械性能测定

将干燥支架的表面用刀切平整，设置电子万能试验机参数实验速度2mm/min，预加张力1n，压缩高度100％，然后测试支架的压缩性能，计算压缩应力和压缩模量。每个组分的支架分别测量3次，然后求取平均值。结果见表1。

表1支架的机械性能

从表1中可以看出，sf/ha/plga复合支架材料的压缩应力和弹性模量有了非常明显地提高，其弹性模量与sf/ha支架材料比较有极显著差异(p＜0.01)。可见除了纳米级ha粒子本身的稳定性和耐磨性，以及其与sf发生的化学结合，也有效的降低了后续步骤中溶剂对sf结构的影响，使plga与sf混合更加充分，结合更加紧密。而且plga的加入也较大程度地克服了ha脆性大的缺点，使三组分的sf/ha/plga支架材料的力学性能有了较大程度的改善。

4、体外降解实验

将干燥的支架称重，记为m1，然后用75％酒精消毒处理30min。将其浸泡于pbs中，真空抽气，使其充分浸润，然后将其置于紫外灯下照射1h。在24孔板中加入恒定量的pbs(ph＝7.4)，将消毒处理好的支架放入并用封口膜密封，然后置于co2恒温培养箱中。于1、2、3、4、5、6、7、8周取出支架样品，吸取孔板中的pbs，用酸度计测其ph；支架用蒸馏水冲洗干净，滤纸擦去表面水分后烘干称重，记为m2，然后按以下公式计算其降解率：

降解率＝(m1-m2/m1)×100％

从图6中可以看出，随着时间的增加，两组支架均发生了不同程度的降解。第8周实验结束时，sf/ha/plga复合支架材料与sf/ha支架材料相比有显著差异(p＜0.05)。从表2中可以看出，到第8周实验结束时，两组支架的ph分别为：6.68、6.81，与初始ph7.4相比较，未发生明显的变化。在整个实验过程中，ph都没有明显的升高或降低，说明所制备的支架在降解过程中均未产生过酸或过碱性的物质，不影响后续生物相容性评价实验中细胞的粘附和生长。

表2两组支架的ph变化

发明人进一步以sf/ha支架为对照，对实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料的生物相容性进行了评价，具体试验如下：

1、细胞接种

将干燥支架切割成高度2mm左右的圆片状，在75％的乙醇中消毒处理30min，在紫外灯下照射30min，待其自然晾干。将灭菌后的sf/ha/plga复合支架材料和sf/ha支架材料分别置于含新鲜dmem培养液的培养皿中于co2恒温培养箱中浸泡24h。待其充分浸润后，将支架用镊子轻轻夹出，移入24孔板，并用枪将多余的培养液吸出。将生长状态良好的hepg2肝癌细胞通过胰酶消化，然后将其制成已知浓度的细胞悬液，将细胞悬液按8×10³个/孔分别接种于含不同组分支架的培养板中，置于5％co2、温度37℃的培养箱中孵育4h，然后沿孔板壁缓缓加入500μldmem培养液，继续放入co2培养箱中，以后隔天换液一次。

2、hepg2肝癌细胞在支架上的生长状态

在细胞孵育5d以后，将生长细胞的支架用镊子轻轻取出置于新的培养板中并用pbs缓冲液冲洗2遍，去除培养液残留和未粘附在支架表面的细胞。用2.5％的戊二醛固定30min，再用pbs缓冲液洗去固定液。分别用50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇进行梯度洗脱，每个梯度脱水15min。干燥喷金后用扫描电镜进行观察并拍照。

从图7和8中可看出，大多数细胞在支架表面及孔隙间粘附生长，粘附形态各异，且sf/ha/plga复合支架材料上的细胞数目最多，细胞可向任意方向伸展和迁移并且细胞分层生长；具有大量细胞基质与细胞-细胞相互作用的三维网状结构，有大量的细胞聚集成簇。从图9中可以直观地看出，在sf/ha/plga复合支架材料上生长的细胞呈立体多角形或聚集成球形，有伪足，且表面有微绒毛，并且有代谢物堆积，而在平面生长的细胞相对数目较少，且只是单面贴壁，大多细胞单独生长(见图10)。

3、mtt法检测hepg2肝癌细胞在支架上的增殖情况

在细胞分别孵育1、2、3、5、7d以后，将生长细胞的支架用镊子轻轻取出置于新的培养板中并用不含血清的dmem培养液冲洗支架2遍，去除未粘附在支架表面的细胞。分别加入50μl5mg/ml的mtt和500μl不含血清的dmed培养液，置于co2培养箱内4h。在这个过程中，支架表面会形成紫色物质，用枪轻轻吸干培养液和mtt混合液，加入500μldmso，用枪反复吹打支架3min。取96孔板，每孔内用移液枪滴加150μl，用酶标仪于570nm下测其吸光度值。

由图11可见，在细胞孵育第5天和第7天后，sf/ha/plga复合支架材料的吸光度与sf/ha支架材料比较有极显著差异(p＜0.01)，说明本发明所制备的sf/ha/plga复合支架材料的性能优于二组分支架，该结果与扫描电镜结果一致。

上述试验结果表明，本发明实施例1制备的sf/ha/plga复合支架材料的孔隙率能够达到85％以上，弹性模量为159.43±8.34mpa，降解率为31.52％，sem和mtt实验，发现其细胞生长状况良好，说明制备出的sf/ha/plga复合支架材料具有良好的机械性能、可控的降解速率以及良好的生物相容性。