一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺的制作方法

本发明涉及一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯丙酮酸ppa是一种常用于医药、轻工等领域的双羟基化合物，可以用于制作复方α酮酸片；ppa是合成d-苯丙氨酸的原材料，d-苯丙氨酸是手性药物和食品添加剂的合成中间体；ppa还可以用于制备苯乳酸，苯乳酸可以用于抗菌防腐和风味添加剂。

ppa作为一种多功能有机酸，目前主要使用化学合成法和生物法生产，化学合成法通常有α-乙酞氨基肉桂酸水解、乙内酰脲与苯甲醛合成法和氯苄经双羟基化反应三条路线。但是化学合成法存在反应需要高，产品得率低、设备投资大，反应时间长且会产生有毒有害物质等问题。生物法生产ppa具有许多优势：易制备，成本低；更稳定，使用方便；无污染，副产物少。ppa的生物法生产可以采用直接发酵法和酶转化法生产。根据文献报道，鲁氏酵母(zygosaccharomycesrouxii)、普通变形杆菌(proteusvulgaris)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)和摩氏摩根菌(morganellamorganli)可以直接发酵生产ppa，其中p.vulgaris通过分批发酵产量可以达到3.0g/l。但由于菌体内ppa的路径较长，代谢路径酶活低，直接发酵法paa产量相对较低，且发酵液中含有大量菌体、蛋白质、无机盐等杂质，ppa的下游分离纯化工艺复杂。利用生物酶制剂转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸是目前的研究热点。

酶转化法可以利用苯丙氨酸脱氢酶、氨基酸转移酶和l-氨基酸脱氨酶转化l-苯丙氨酸生产苯丙酮酸，hou等在大肠杆菌中异源表达来自proteusmirabiliskctc2566的l-aad，ppa的产量为2.60±0.1g·l^-1，转化率为86.7％。又经过ppa降解途径改造和l-aad分子改造，最终使ppa产量提高至30.00±1.2g·l^-1，转化率达到100％。还建立了两阶段全细胞转化策略，利用两阶段温度调控策略，即：低温诱导12h，添加底物l-苯丙氨酸，提高温度至转化温度，至反应结束，然后收集菌体，进行静息细胞转化，有效实现了ppa的积累。另外，研究者还对e.colifad合成和再生系统进行代谢改造强化、构建fadh2/fad再生系统，进一步提高ppa的产量至58g·l^-1。

技术实现要素：

为了进一步提高ppa的产量，本发明提供了一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺。

发明人之前在申请号为201810670959.4的专利申请中已经公开了通过基因工程构建得到可以利用l-氨基酸脱氨酶高产苯丙酮酸的突变株，其苯丙酮酸产量可以达到72.5g/l。本发明进一步对l-aad转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺进行优化，显著提高苯丙酮酸的产量，适用于工业化生产苯丙酮酸。

本发明的第一个目的在于提供一种重组菌，所述重组菌，以大肠杆菌为宿主、采用pet系列载体表达了氨基酸序列如seqidno:3所示、核苷酸序列如seqidno:2所示的氨基酸脱氨酶突变体。

本发明的第二个目的在于提供一种高密度发酵生产l-氨基酸脱氨酶的方法，所述方法是应用上述重组菌进行发酵生产。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述突变体或所述重组菌，按照5～8％接种量接种于发酵培养基，发酵罐装液量为3.0l/5.0l，通气量1.5～2.5vvm，温度36～38℃，搅拌速率500～600rpm，设定溶氧为100％，当od600达到15～18时，溶氧上升至60％以上，添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在20～40％；当培养至od600在20～25，将温度下降至24～25℃，加入10～15g/l乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，发酵培养24～28h，od600达到75～90时结束发酵，发酵过程中通过补加氨水控制ph在6.5～7.5。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包括：甘油6g/l，酵母粉15～20g/l，大豆蛋白胨5～10g/l，k2hpo4·12h2o2.0～3.0g/l，kh2po45.0～8.0g/l，金属离子液10ml/l；所述补料培养基的成分为：甘油400～600g/l，酵母粉5～8g/l，mgso4·7h2o6～10g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述金属离子液的成分包括：feso4·7h2o5g/l，cacl22g/l，znso4·7h2o1.2g/l，mnso4·4h2o0.4g/l，(nh4)6moo24·4h2o0.1g/l，h3bo30.5g/l。

本发明的第三个目的在于提供一种重组菌转化生产苯丙酮酸的方法，所述方法是以苯丙氨酸为底物，应用上述重组菌转化底物生产苯丙酮酸。

在本发明的一种实施方式中，所述应用上述重组菌转化底物生产苯丙酮酸的转化条件是：ph7.5～8.0，转化温度为22～26℃，转化时间18～24h，湿细胞添加量25.0～30.0g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述应用上述重组菌转化底物生产苯丙酮酸在发酵罐中进行，搅拌转速为400rpm，通气量0～12h控制为0.5vvm，12h以后关闭通气至转化结束。

在本发明的一种实施方式中，在所述应用上述重组菌转化底物生产苯丙酮酸的转化体系添加0.1～0.2mmol/lmgcl2。

本发明的第三个目的在于提供一种上述重组菌在食品、医药、化工领域的应用。

本发明有益效果是：

本发明利用来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)的l-aad突变体生产苯丙酮酸，经过表达系统中密码子优化、发酵条件和转化条件优化，添加湿细胞添加量25.0～30.0g/l，转化18～20h，转化率达到98％以上，苯丙酮酸产量达到81.1～83.0g/l，转化体系简单和高转化率使得下游纯化简易，极大的降低了生产成本，能够满足工业化需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：添加剂对全细胞转化生产苯丙酮酸的影响；

图2：通气量对全细胞转化生产苯丙酮酸的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

下述实验都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。

样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以ppa作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。

苯丙酮酸含量的测定：高效液相色谱法，流动相成分：5.0mmol/l稀硫酸，流速0.8ml/min；进样体积：10μl；色谱柱：aminexhpx-87hionexclusioncolumn，300×7.8mm；检测器：紫外检测器，波长为210nm。

氨基酸脱氨酶的酶活检测：将15ml浓度约为30g/l的l-苯丙氨酸溶液30℃预热，分别称取0.5g左右的湿菌体于250ml锥形瓶中，加入14.5ml预热的ph7.5的tris-hcl缓冲液缓冲液，再加入预热的l-苯丙氨酸转化液中，30℃、200rpm的摇床中反应30min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。酶活单位定义为1min内转化生成1μmolppa所需的酶量。

实施例1：生产氨基酸脱氨酶突变体的重组菌株的构建

l-aad突变体的核苷酸序列如seqidno:1所示，进一步通过适用于大肠杆菌表达系统的密码子优化，突变体核苷酸序列如seqidno:2，优化前该基因的gc含量为44.0％，在大肠杆菌中密码子适应性指数(cai)为0.269，优化后gc含量为51.4，cai提高至1.0。通过全基因合成seqidno:2的核苷酸序列，并连接于pet24a载体，在大肠杆菌e.colibl21(de3)中重组表达，菌株命名为e.coli-pm-laad。密码子优化后l-aad酶活从2.37u/ml提高至3.21u/ml，酶活提高了35.4％。

实施例2：营养条件对发酵生产氨基酸脱氨酶的影响

(1)发酵培养基a的成分为：甘油6g/l，酵母粉20g/l，大豆蛋白胨5g/l，k2hpo4·12h2o2.5g/l，kh2po45.0g/l，金属离子液10ml/l。

金属离子液的成分为：feso4·7h2o5g/l，cacl22g/l，znso4·7h2o1.2g/l，mnso4·4h2o0.4g/l，(nh4)6moo24·4h2o0.1g/l，h3bo30.5g/l。

发酵培养基b为tb培养基：甘油4g/l，酵母粉24g/l，大豆蛋白胨12g/l，kh2po42.31g/l，k2hpo4.3h2o12.54g/l。

补料培养基的成分为：甘油400～600g/l，酵母粉5～8g/l，mgso4·7h2o6～10g/l。

(2)将实施例1中e.coli-pm-laad接种于lb种子培养基(硫酸卡那霉素100mg/l)，37℃，200rpm震荡培养10～12h，按照5％接种量分别接种于发酵培养基a和发酵培养基b，通气量2.0vvm，温度37℃，搅拌速率500～600rpm，此时设定溶氧为100％，当od600达到15～18时，溶氧突然上升至60％以上，此时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在20～40％，当培养至od600达到25，将温度下降至25℃，加入15g/l乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，发酵培养24～28h，od600达到75～90时结束发酵，发酵过程中通过补加氨水控制ph在6.5～7.5。

(3)不同培养基对发酵l-aad的酶活影响如表1，使用优化后培养基a高密度发酵，单位菌体干重l-aad酶活和菌体干重分别可以达到1.36u/mg和31.9g/l，相对于常规的tb培养基分别提高了16.2％和13.9％。高密度发酵时高菌浓可以降低菌体的生产成本，而单位菌体酶活提高有利于转化时降低菌体用量。

表1营养条件对发酵生产氨基酸脱氨酶的影响

实施例3：添加剂对全细胞转化生产苯丙酮酸的影响

取用实施例2发酵培养基a中获得的e.coli-pm-laad湿菌体，作为细胞催化剂用于转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸。在1l转化体系中，用ph7.5tris-hcl缓冲液溶解l-苯丙氨酸75g/l、湿菌体30g/l，4mol/lnaoh溶液控制ph7.5～8.0、温度25℃、搅拌转速400rpm，通气量控制为0.5vvm，分别添加0.1％ctab、0.1％曲拉通-100、0.1％吐温-80、2mmol/lmncl2、2mmol/lmgcl2、2mmol/lcacl2，检测添加剂对ppa产量的影响。实验结果如图2：mgcl2对ppa产量有一定促进作用，产量从70.4g/l提高至73.9g/l，转化率从94.4％提升至99.1％；其他金属离子对转化结果没有明显的影响；表面活性剂的添加对转化都存在不同程度的抑制作用ctab的抑制作用最强，分析原因可能是表面活性剂会破坏菌体的膜结构，增加膜的通透性，而l-aad为膜结合蛋白，破坏了膜结构影响了l-aad活力，使产量下降。

实施例4：通气量对全细胞转化生产苯丙酮酸的影响

取用实施例2发酵培养基a中获得的e.coli-pm-laad湿菌体，作为细胞催化剂用于转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸。在1l转化体系中，用ph7.5tris-hcl缓冲液溶解l-苯丙氨酸80g/l、湿菌体30g/l，2mmol/lmgcl2，4mol/lnaoh溶液控制ph7.5～8.0、温度25℃、搅拌转速400rpm，考察不同通气量对转化的影响，分别设置整个转化过程中不通气，通气量控制为0.5vvm，通气量0～12h控制为0.5vvm、12h以后关闭通气直至转化结束，转化26h，转化过程曲线如图2所示：通气时，苯丙酮酸积累较快，不通气整个转化速率变慢；不通气时，转化24h苯丙酮酸产量最高为73.0g/l，通气0.5vvm时转化20h苯丙酮酸产量最高，达到74.4g/l；两阶段控制在12h之后关闭通气，转化速率降低，但是菌体在20h之后仍然具有持续的转化能力，转化22h苯丙酮酸产量达到78.2g/l，摩尔转化率为98.3％。

实施例5：苯丙氨酸生产苯丙酮酸的规模化制备

取用实施例2发酵培养基a中获得的e.coli-pm-laad湿菌体，作为细胞催化剂用于转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸。在30l发酵罐中装液量为15l，转化体系中使用ph7.5tris-hcl缓冲液溶解l-苯丙氨酸82.0～85.0g/l、湿菌体25～30g/l，2mmol/lmgcl2，4mol/lnaoh溶液控制ph7.5～8.0、温度25℃、搅拌转速400rpm，采用实施例4中两阶段控制通气量。转化结果如表2，当湿菌体添加量25～30g/l，苯丙酮酸产量可以达到81.1～83.0g/l，苯丙氨酸的摩尔转化率达到98.0％以上。

表2苯丙氨酸生产苯丙酮酸的规模化制备

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>江南大学

无锡宸明生物技术有限公司

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