铑配合物在制备抗菌药物中的应用的制作方法

本发明属于医药生物领域，特别涉及铑配合物在制备抗菌药物中的应用。
背景技术：
肺炎链球菌常常寄居于正常人的口腔及鼻咽部，一般不致病，只形成带菌状态，只有在免疫力下降时才致病。肺炎链球菌是社区获得性肺炎最常见的致病菌之一，该细菌也会导致许多其他严重疾病，包括脑膜炎、中耳炎、菌血症和败血症等，特别是在儿童、老年人、艾滋病患者和其他免疫缺陷患者中，对全世界的人类健康构成重大威胁。who估算全球每年有至少120万婴幼儿死于肺炎链球菌引起的疾病，其中90％为发展中国家儿童，另外65岁以上的老年人中肺炎球菌引起的侵袭性疾病也达到(24～85)/10万。疫苗和抗生素是目前预防和治疗肺炎链球菌感染疾病的主要手段。但是近年来随着各种抗生素在临床上的广泛使用以及不合理应用，导致了细菌的抗药性迅速提高和传播，耐青霉素肺炎链球菌(prsp)在世界范围内广泛传播(同时伴有对其他抗生素的多重耐药)，一些地区的菌株对青霉素的耐药率高达45％，使得肺炎链球菌感染的治疗面临越来越大的困难。由于耐抗生素的肺炎链球菌的发生率越来越高，抗菌药的研究与开发速度已远远跟不上细菌耐药的速度，因此迫切需要筛选新的药物用于治疗肺炎球菌感染性疾病。铑配合物通常被用于作为催化剂，但是最近陆续有报道显示铑配合物具有抗肿瘤等生物活性，但是对其作用机制知之甚少。到目前为止，尚未有铑配合物用于治疗肺炎链球菌的报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供铑配合物在制备抗菌药物中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：铑配合物在制备抗菌药物中的应用，其中所述的铑配合物为铑配合物rh2ac4，其结构式如式i所示：所述的抗菌药物包括用于治疗肺炎链球菌、化脓链球菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌感染的药物；铑配合物rh2ac4能特异性地抑制肺炎链球菌、化脓链球菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌的生长，但对革兰氏阴性菌大肠杆菌和鲍曼不动杆菌没有抑制作用。所述的铑配合物rh2ac4的浓度优选为12.5～200μm。所述的抗菌药物还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、或表面活性剂等。所述的抗菌药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括粉剂、片剂、胶囊剂、针剂、粉针剂、颗粒剂、冲剂、口服液和糖浆剂等。铑配合物在制备抑制肺炎链球菌生长，抑制血红素摄取和代谢，或干扰肺炎链球菌铁代谢的药物中的应用；rh2ac4能够抑制参与血红素摄取和代谢相关的蛋白spd_1652(piua蛋白)、spd_1590和gap的表达；rh2ac4能够通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内，降低铁的摄取，从而干扰铁的代谢，从而抑制细菌生长。所述的铑配合物为铑配合物rh2ac4，其结构式如式i所示。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明合成了铑配合物rh2ac4，发现它能特异性地抑制肺炎链球菌、化脓链球菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌的生长，但对革兰氏阴性菌大肠杆菌和鲍曼不动杆菌没有抑制作用。接着以肺炎链球菌为研究对象，运用蛋白质组学技术研究了铑配合物rh2ac4的抗肺炎链球菌的作用机制。研究结果显示铑配合物rh2ac4能够通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内，降低铁的摄取，从而干扰铁的代谢，抑制细菌生长。附图说明图1是铑配合物rh2ac4对肺炎链球菌的影响图；其中，图a为铑配合物rh2ac4对肺炎链球菌生长的影响；图b为铑配合物rh2ac4对宿主细胞a549的细胞毒性结果。图2是蛋白质组学技术分析了rh2ac4处理后肺炎链球菌蛋白表达谱的变化结果图(图中黑色代表rh2ac4处理后，肺炎链球菌中高表达的蛋白质；灰色代表rh2ac4处理后，肺炎链球菌中低表达的蛋白质)。图3是铑配合物rh2ac4通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内，降低铁摄取的结果图；其中，图a为westernblotting结果；图b为icp-ms结果；图c为编码piua蛋白的piua基因缺少突变后会降低铑的摄取；图d是piua与血红素的荧光结合图谱；图e是piua与铑配合物rh2ac4的荧光结合图谱。图4为肺炎链球菌中铑配合物rh2ac4通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内的示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明中涉及的铑配合物rh2ac4参考文献合成(p.l.g.a.rempel,h.smith,andg.wilkinson,tetrakis(acetato)dirhodium(ii)andsimilarcarboxylatocompounds,inorganicsynthesesxiii(1972)90-91.)，其合成路线如下所示：铑配合物rh2ac4的结构式如式i所示：实施例11、铑配合物rh2ac4抑制革兰氏阳性细菌的生长测定铑配合物rh2ac4对肺炎链球菌、化脓链球菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的最小抑制浓度；其中，肺炎链球菌d39购自英国nctc；化脓链球菌mgas5005、李斯特菌19117、金黄色葡萄球菌29213、大肠杆菌k12和鲍曼不动杆菌19606均购自美国atcc。肺炎链球菌d39生长于0.5％thye培养基(0.5％thye培养基配方：todd-hewittbroth(oxiod,uk)包含0.5％yeastextract)中，生长条件37℃，5％co2；化脓链球菌mgas5005生长于0.5％thye培养基中，生长条件37℃，200rpm摇床培养；金黄色葡萄球菌29213生长于tsb培养基中，生长条件37℃，200rpm摇床培养；李斯特菌19117、大肠杆菌k12和鲍曼不动杆菌19606生长于lb培养基中，生长条件37℃，200rpm摇床培养。结果如表1所示，从表1可以看出，铑配合物rh2ac4能特异性地抑制肺炎链球菌、化脓链球菌、李斯特菌和金黄色葡萄球菌的生长，但对革兰氏阴性菌大肠杆菌和鲍曼不动杆菌没有抑制作用。表1铑配合物rh2ac4对不同菌株的最小抑制浓度(mic值：μm)细菌rh2ac4肺炎链球菌25化脓链球菌50李斯特菌100金黄色葡萄球菌100大肠杆菌＞200鲍曼不动杆菌＞2002、铑配合物rh2ac4对宿主细胞a549是低毒性的采用ldh试剂盒(中国碧云天生物技术公司)检测铑配合物rh2ac4对宿主细胞a549(美国atcc)的细胞毒性，全细胞裂解液(lysate)作为阳性对照。其中铑配合物rh2ac4的浓度为0，25μm，50μm，100μm，200μm和300μm。结果如图1b所示，当rh2ac4的浓度高达200μm(是其对肺炎链球菌mic的8倍)时，a549细胞的存活率还是很高，表明铑配合物rh2ac4以浓度依赖的方式抑制肺炎链球菌的生长(图1a)，且对宿主细胞a549是低毒性的(图1b)，即铑配合物rh2ac4能选择性地抑制细菌生长。实施例2运用蛋白质组学研究铑配合物rh2ac4抑制肺炎链球菌生长的作用机制为了进一步研究铑配合物rh2ac4抑制肺炎链球菌生长的作用机制，我们运用蛋白质组学技术分析了rh2ac4处理后肺炎链球菌蛋白表达谱的变化，具体步骤如下：待肺炎链球菌od600＝0.3时，加入12.5μmrh2ac4处理2小时，以不加rh2ac4作为对照，然后分别收集处理组和对照组的细菌，用1％的sds裂解液裂解菌体，超声破碎后，离心收集上清，用bca法测定蛋白浓度。蛋白质组学中处理组和对照组分别取200μg蛋白进行酶解、itraq标记和质谱鉴定。生物信息学分析结果显示，rh2ac4抑制参与血红素摄取和代谢相关的蛋白spd_1652，spd_1590和gap的表达(图2)。实施例3细胞和生物化学验证铑配合物rh2ac4能够通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内，降低铁的摄取用浓度为12.5μm的rh2ac4处理肺炎链球菌，然后进行westernblotting检测，结果显示，rh2ac4显著抑制血红素转运系统脂蛋白spd_1652蛋白(又称piua蛋白)和血红素代谢相关蛋白gap的表达，但对铁色素转运系统脂蛋白spd_0915蛋白和铁转运系统脂蛋白spd_1609蛋白表达水平几乎没有影响(图3a)。我们运用通过长臂同源多聚酶链式反应(longflankinghomologypolymerasechainreaction,lfh-pcr)构建了piua缺失突变株，具体步骤如下：以肺炎链球菌的dna为模板，用pcr分别扩增出piua基因的上游片段(引物p1：5’-gaaactctgaattatttggaac-3’，p3：5’-atcaaacaaattttgggcccggctctaacttgagcttttatgtt-3’)、下游片段(引物p4：5’-attctatgagtcgctgccgactgccacttcaaactcaatttaat-3’，p2：5’-tttatctcaccagtctttccac-3’)和以红霉素基因为模板，扩增红霉素(erm)抗性基因(引物erm-f：5’-ccgggcccaaaatttgtttgat-3’，erm-r：5’-agtcggcagcgactcatagaat-3’)，接头引物p3、p4分别带有20～25个与erm抗性基因5’，3’端两侧互补的碱基，这样扩增出的上、下游片段就分别带有一段与抗性基因互补的序列；再通过pcr用外侧引物(引物p1，p2)将这三个片段连接起来，用此连接片段去转化肺炎链球菌，在含抗生素的血平板上即可筛选出piua基因完全被erm抗性基因替代的缺陷菌株，即piua缺失突变株。接着我们用icp-ms(电感耦合等离子体质谱)比较了野生型wt菌株和piua缺失突变株中rh的含量，如图3c所示，与wt相比，piua缺失突变株中rh(铑)的含量显著降低。此外荧光光谱结果显示rh2ac4能够与piua蛋白特异结合，其结合模式与hemin结合piua蛋白的模式相似(图3d&e)。这些结果表明rh2ac4能够通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内(图4)。为了确定铑配合物rh2ac4对fe含量的影响，我们运用icp-ms检测了在有无rh2ac4处理下细菌体内的fe和rh的含量的变化。结果显示，与对照组相比，加入sub-mic的rh2ac4处理后，肺炎链球菌野生型菌株中的fe水平显著降低，同时rh含量显著升高(图3b)。以上结果显示铑配合物rh2ac4能够通过血红素转运系统piuabcd进入肺炎链球菌体内，降低铁的摄取，从而干扰铁的代谢，抑制细菌生长。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>暨南大学<120>铑配合物在制备抗菌药物中的应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物p1<400>1gaaactctgaattatttggaac22<210>2<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atcaaacaaattttgggcccggctctaacttgagcttttatgtt44<210>3<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物p4<400>3attctatgagtcgctgccgactgccacttcaaactcaatttaat44<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物p2<400>4tttatctcaccagtctttccac22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物erm-f<400>5ccgggcccaaaatttgtttgat22<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物erm-r<400>6agtcggcagcgactcatagaat22当前第1页12