一种地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备方法及应用与流程

本发明涉及蛋白药物制备技术领域，特别是一种地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备方法及应用。

背景技术

现代社会因交通事故、偶发事件(烫伤，机械性损伤等)、医疗手术等原因造成的各种创伤患者数目在不断激增。研究表明，全世界范围内由于创伤导致的死亡率在各种疾病中居第四位。另据统计，我国每年因创伤死亡人数为10万人，伤残100万人，造成直接经济损失100亿人民币。随着社会的发展，这一数字还在不断攀升。因此创伤后修复一直是医学领域研究的热点课题。近年研究发现，传统中药地龙(蚯蚓，lumbricus)在这一方面表现出了独特的疗效。近年来大量的研究结果表明地龙提取物能够通过刺激上皮细胞增殖，达到促进创伤愈合的作用。

然而，蛋白作为一种高分子物质在自然界中非常容易降解，所以地龙蛋白在使用过程中也存在消耗量大，成本高，相对药效低的问题。纳米药物载体一般具有多孔、中空、多层等结构特性，易于药物的缓释控制。通过选择载体材料的种类和配比，可控制药物的释放速度，制备出具有缓释特性的载药纳米粒，极大延长药物的半衰期，减少用药次数和用药量。此外，纳米药物载体的比表面积大、连接或载带的功能基团或活性中心多，易于实现疗效跟踪与治疗的同步化。目前已有超顺磁纳米粒子spio(superparamagneticironoxidenanoparticles)商用的产品(endorem、feridex、resovist)，这些均为多聚糖覆盖的四氧化三铁纳米粒子，整个粒子的粒径在50nm，但这些材料都不具备作为药物缓释材料的条件。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备方法，包括以下步骤：

s1、地龙蛋白的制备：将鲜活地龙用生理盐水清洗三次，除去体表泥沙与污物，剪碎后用压力破碎的方式获得细胞破碎浆，向细胞破碎浆中加入生理缓冲液在4℃进行低速离心5分钟，除去体内泥沙与消化物后得到细胞破损混合物；在离心管内配制含tris-hcl缓冲液的10％～70％梯度蔗糖溶液，轻置细胞破损混合物于上述蔗糖溶液上端，于2500rpm离心，分别收集离心管内的上层组分、中层组分、下层组分，而后针对中层组分通过常规离子交换法和凝胶色谱法制备地龙蛋白混合物；

s2、纳米碳球的制备：称取40g蔗糖溶解在100ml去离子水中，超声搅拌过夜，然后加热至200℃使其全部碳化，用去例子水和乙醇/丙酮混合液反复冲洗，除去碳中杂质，然后超声分散72小时，得到纳米炭球，备用；

s3、过渡系金属纳米中空微球的制备，具体包括：

s31、称取0.5mol过渡系金属盐mxn，其中m为过渡系金属，加入到已经超声分散好的纳米炭球中，在乙醇/水混合液中继续超声分散72小时，然后除去溶液，添加新的乙醇/水混合溶液继续超声分散72小时；

s32、然后向s31中加入1g氯化铵继续超声分散1小时，然后在150℃下加热12小时，自然冷却后过滤得到沉淀，用乙醇/水混合液将沉淀冲洗3次后在40℃低温烘干得到烘干产物；

s33、将s32制得的烘干产物以0.5℃/min的升温速率升至700℃，维持5小时，然后以1℃/min的速率开始降温至50℃后于室温冷却，即得到过渡系金属纳米中空微球；

s4、地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备：称取1g过渡系金属纳米中空微球，加入2mg/ml的由地龙蛋白混合物与溶剂pbs混合而成的地龙蛋白混合液，4℃下搅拌24小时，离心除去上清液，沉淀部分即为制备好的地龙蛋白微球纳米创伤复合物，于4℃保存。

进一步，所述s31中的纳米炭球在乙醇/水混合液中继续超声分散时，每隔12小时在80摄氏度机械搅拌12小时。

进一步，所述s4中的地龙蛋白混合液的ph＝7.5。

另外，本发明还提供一种地龙蛋白微球纳米创伤复合物的应用，所述地龙蛋白微球纳米创伤复合物用于动物创伤愈合。

与现有技术相比，本发明将蛋白以物理方式内嵌入过渡系金属纳米中空微球中，从而制备出具有缓释，诱导和多位点效应的医用药物制剂，以达到促创伤修复的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中制得的金属铁的纳米中空微球电镜图。

图2(a)为本发明实施例2中空白组(blank)、阳性对照组(jwh)、地龙纳米组(ew)的18天的愈合率统计图；(b)为本发明实施例2中空白组(blank)、阳性对照组(jwh)、地龙纳米组(ew)创伤后3天、6天时死亡率统计图；(c)为本发明实施例2中空白组(blank)创伤的新生皮肤的h&e染色图、(d)为本发明实施例2中阳性对照组(jwh)创伤的新生皮肤的h&e染色图、(e)为本发明实施例2中地龙纳米组(ew)创伤的新生皮肤的h&e染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

一种地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备方法，包括以下步骤：

s1、地龙蛋白的制备：将鲜活地龙用生理盐水清洗三次，除去体表泥沙与污物，剪碎后用constant压力破碎机进行压力破碎获得细胞破碎浆，向细胞破碎浆中加入生理缓冲液(tris-hcl，20mm，ph＝7.5)在4℃进行低速离心5分钟，除去体内泥沙与消化物后得到细胞破损混合物；在离心管内配制含tris-hcl缓冲液的10％～70％梯度蔗糖溶液，轻置细胞破损混合物于上述蔗糖溶液上端，于2500rpm离心，分别收集离心管内的上层组分、中层组分、下层组分，而后针对中层组分通过常规离子交换法(以nacl1m，tris-hcl20mm阳离子洗脱)和凝胶色谱法(以20mmtris-hcl作为洗脱液)制备地龙蛋白混合物；

s2、纳米碳球的制备：称取40g蔗糖溶解在100ml去离子水中，超声搅拌过夜，然后加热至200℃使其全部碳化，用去例子水和乙醇/丙酮混合液反复冲洗，除去碳中杂质，然后超声分散72小时，得到纳米炭球，备用；

s3、过渡系金属纳米中空微球的制备，具体包括：

s31、称取0.5mol过渡系金属盐mxn，其中m为过渡系金属，加入到已经超声分散好的纳米炭球中，在乙醇/水混合液中继续超声分散72小时，每隔12小时在80摄氏度机械搅拌12小时，然后除去溶液，添加新的乙醇/水混合溶液继续超声分散72小时；

s32、然后向s31中加入1g氯化铵继续超声分散1小时，然后在150℃下加热12小时，自然冷却后过滤得到沉淀，用乙醇/水混合液将沉淀冲洗3次后在40℃低温烘干得到烘干产物；

s33、将s32制得的烘干产物以0.5℃/min的升温速率升至700℃，维持5小时，然后以1℃/min的速率开始降温至50℃后于室温冷却，即得到过渡系金属纳米中空微球，如图1所示；

s4、地龙蛋白微球纳米创伤复合物的制备：称取1g过渡系金属纳米中空微球，加入2mg/ml的由地龙蛋白混合物与溶剂磷酸缓冲盐溶液pbs混合而成的ph＝7.5的地龙蛋白混合液，4℃下搅拌24小时，离心除去上清液，沉淀部分即为制备好的地龙蛋白微球纳米创伤复合物，于4℃保存。

实施例2

实施例1制得的地龙蛋白微球纳米创伤复合物能够用于动物创伤愈合。

验证实例

使用4周龄balb/c鼠进行实验，将小鼠适应性饲养1周后，分为3组分别命名为：空白组(blank)、阳性对照组(jwh)、地龙纳米组(ew)，进行实验。10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，将实验鼠俯卧位，置于无菌单，背部皮肤用碘伏消毒。

然后对小鼠背部进行机械脱毛，使用无菌眼科剪在背部做一圆形切口(直径2cm)，造成开放性创伤模型，放入笼中继续饲养。

依据创伤面积对小鼠伤口进行涂药，用药量均为100mg/cm²(以蛋白质量计算)，空白组仅涂抹生理盐水，阳性对照组涂抹商业化药品，地龙纳米组涂抹实施例1制得的地龙蛋白微球纳米创伤复合物。单笼饲养，每3天换药一次，连续治疗27天，每隔三天统计伤口愈合情况，对三组小鼠的伤口进行等比例拍照，用imagej软件分析创口面积；然后过度麻醉处死后取创口组织样品，进行h&e染色，观察组织恢复情况。

研究结果发现，在愈合过程中，涂抹了复合物的地龙纳米组(ew)，创伤后18天的愈合速度快于其他两组，如图2(a)所示。涂抹了地龙蛋白微球纳米创伤复合物的地龙纳米组(ew)与未涂抹药物的空白组(blank)相比，小鼠前3天的死亡率略有下降，而涂抹了某商业化药物的阳性对照组(jwh)，在前期出现了较高的死亡率，6天时统计涂抹了阳性对照组(jwh)的小鼠死亡率明显高于空白组(blank)和涂抹了地龙蛋白微球纳米创伤复合物的地龙纳米组(ew)，如图2(b)所示。另外，通过观察创伤的新生皮肤的h&e染色图如图2(c)、(d)、(e)，其中(c)为空白组(blank)创伤的新生皮肤的h&e染色图、(d)为阳性对照组(jwh)创伤的新生皮肤的h&e染色图、(e)为地龙纳米组(ew)创伤的新生皮肤的h&e染色图，发现涂抹了地龙蛋白微球纳米创伤复合物的地龙纳米组(ew)在新生皮肤上较早的生长了体毛，第28天取新生组织进行h&e染色实验发现，经地龙蛋白微球纳米创伤复合物治疗的地龙纳米组(ew)的小鼠组织其有序程度明显强于未经治疗的空白组和jwh治疗的阳性对照组(jwh)，第30天对小鼠全部采用呼吸麻醉法处死，处死后半经验定性的统计了新生皮肤的耐拉伸强度，发现经过地龙蛋白微球纳米创伤复合物治疗的实验组的皮肤韧性也高于其他两组。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。