本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗银屑病的免疫细胞制剂、其制备方法及应用。
背景技术
银屑病是一种常见的严重危害人类健康的皮肤病，俗称牛皮癣，是以表皮过度增生为特征的慢性复发性非感染性炎症性皮肤病；也是一种在多基因遗传背景下，由多种致病因子刺激机体免疫系统而引起的以t细胞介导为主的自身免疫性皮肤病。根据皮损及临床表现通常分为寻常型银屑病、红皮病型银屑病、脓疱病型银屑病和关节病型银屑病4种类型。我国绝大多数银屑病患者为寻常型银屑病，占银屑病患者的96％以上。该病发病以青壮年为主，临床表现以红斑、鳞屑为主，全身均可发病，以头皮，四肢伸侧较为常见，多在冬季加重，病程长，反复发作，难以治愈，严重影响患者的生活、工作和身心健康，甚至致残，给个人、家庭及社会带来严重危害。
其发病机制尚未阐明。有关本病的病因虽然进行过许多研究，但至今尚不十分清楚。目前认为，本病的发生不是单一的原因，可能涉及多方面。1、遗传。一部分患者有家族性发病史，有的家族有明显的遗传倾向；本病患者的某些hla抗原出现率显著增高；银屑病与其他疾病(如类风湿性关节炎，特应性皮炎等)遗传位点可能存在重叠。2、感染。许多学者从体液免疫(抗链球菌组)、细胞免疫(外周血及皮损t细胞)、细菌培养和治疗等方面均证实链球菌感染与银屑病发病和病程迁延有关；另外，对于银屑病患者，金黄色葡萄球菌感染可使皮损加重，这与金葡菌外毒素的超抗原有关。3、免疫异常。大量研究证明，银屑病是免疫介导的炎症性皮肤病，其发病与炎症细胞浸润和炎症因子有关，因此越来越多的证据认为本病为自身免疫性疾病。4、内分泌因素。部分女性患者妊娠后皮损减轻甚至消失，分娩后加重。5、其他。精神神经因素与银屑病的发病有一定关系；饮酒、吸烟、药物和精神紧张可能会诱发和加重银屑病。
针对本病目前尚无特效疗法，主要治疗方法为外用药物和口服药物的对症治疗，可以联合使用、交替使用、序贯使用等。这类药物多数为激素类或抗生素类，适当应用对症治疗可以暂时控制症状，但治标不治本，长期使用亦病情反复、无法治愈，且引起很多不良反应，因此使本病的治疗成为难点。
目前对疾病的诊断治疗已经进入分子和细胞时代。干细胞、免疫细胞具有很大的治疗潜力。目前干细胞申请专利很多。如：cn201210133427.x公开了一种用于创面修复的干细胞制剂及其制备方法，cn108030790公开了一种治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法，cn106511975a公开了一种治疗肝硬化的干细胞制剂及其制备方法等。
免疫细胞应用于临床治疗最早见于期刊：phenotypiccharacterizationandidentificationofcytokine-inducedkilledcells[j].exphematol,1993；21(13):1673-1679，是患者自体细胞体外诱导扩增后用于治疗肿瘤，之后的一些研究也多限于这方面，均是应用患者自身细胞，经体外扩增诱导后再回输患者。应用自体细胞治疗，细胞来源受限，治疗个体受限，无法做到大批量生产和产业化发展，也无法使更多的患者方便治疗。而且，国内外尚未见到有细胞制剂对银屑病进行临床研究的报道。
现有针对银屑病的治疗药物主要是外用或内服的维生素a或激素类、抗生素类制剂等，这些药物治标不治本，长期使用副作用大，而且患者易反复发作，无法达到根治。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种免疫细胞制剂及其制备方法，应用自体或者异体来源血液中的淋巴细胞进行体外诱导扩增，得到的免疫细胞制剂针对难治性银屑病具有良好疗效。
本发明的技术方案为：
治疗银屑病的免疫细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：采集血液，从所述血液中分离单个核细胞，将所述单个核细胞进行培养以诱导扩增，培养完毕即得所述治疗银屑病的免疫细胞制剂。
所述血液为银屑病患者自身外周血、健康人脐带血、健康亲属血、健康他人捐献血中的任意一种；所述血液用血袋盛装，采用75％的酒精擦拭所述血袋外壁2-3遍进行消毒。
使用ficoll-hypaque淋巴细胞分离液，以密度梯度离心法进行所述单个核细胞的分离；所述密度梯度离心法中，进行所述离心的转速为1800-2200rpm/min，进行所述离心的时间为18-22min。
以密度梯度离心法分离出所述单个核细胞后，加入生理盐水离心洗涤2-3遍，进行所述离心洗涤的转速为1800-2200rpm/min，进行所述离心洗涤的时间为18-22min，然后再进行培养。
所述培养方法包括如下步骤：
(1)向单个核细胞中加入培养液得到基础培养体系；
(2)向基础培养体系中加入人血清和ifn-γ得到一次培养体系，将所述一次培养体系于培养箱中进行一次培养，然后加入il-2、cd3mcab和il-1得到二次培养体系；
(3)将所述二次培养体系于培养箱中进行二次培养，每隔3天向所述二次培养体系内补加一次营养液，二次培养完毕后，收获分离出细胞，用无菌生理盐水洗涤所述细胞即得治疗银屑病的免疫细胞制剂。
步骤(1)中，所述培养液为gt-551培养液，通过所述培养液的加入量控制所述基础培养体系中的细胞密度为3.5×106-4.5×106个/ml。
步骤(2)中，所述一次培养体系中，人血清的浓度为8±1wt％，ifn-γ的浓度为1000±100u/ml；
步骤(2)中，所述培养箱的培养温度为37±0.5℃，所述培养箱内co2浓度为5％，进行所述一次培养的时间为24±2h；
步骤(2)中，所述二次培养体系中，il-2的浓度为500±50u/ml，cd3mcab的浓度为100±10ng/ml，il-1的浓度为100±10u/ml。
步骤(3)中，所述培养箱的培养温度为37±0.5℃，所述培养箱内co2浓度为5％，进行所述二次培养的时间为11-15天；
步骤(3)中，所述营养液包括gt-551培养液、人血清和il-2；每次补加营养液时，先添加gt-551培养液调整细胞密度为1.5×106-2.5×106个/ml，然后每100ml二次培养体系中加入5±1ml人血清，每1ml二次培养体系中加入500±50u的il-2；
步骤(3)中，用所述无菌生理盐水洗涤所述细胞2-4遍。
治疗银屑病的免疫细胞制剂，通过权利要求1-8任一项所述方法制备而得。
所述免疫细胞制剂在制备治疗银屑病的药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的治疗银屑病的免疫细胞制剂，通过调节免疫平衡达到标本兼治的目的，能够显著改善患者皮肤症状甚至治愈顽固性银屑病，治疗效果显著且不易复发，填补了国内外采用免疫细胞制剂治疗银屑病的空白，为银屑病患者带来一种新的治疗选择；有效避免现有技术方法治疗银屑病时，患者因长期使用外用或内服激素类、抗生素类制剂等常规治疗方式而带来的副作用大，易反复发作的缺陷。此外，本发明提供的制备方法，用于制备所述免疫细胞制剂的细胞既可以来源于患者自身，也可以来源于异体，可以是外周血，也可以是脐带血，细胞来源更为广泛，从而可以扩大生产规模，实现产业化，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种治疗银屑病的免疫细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
采集银屑病患者自身外周血于采血袋中，检查采血袋外观、采集量等并做好记录与编号，采用蘸有75％酒精的纱布擦拭采血袋外壁2遍进行消毒，然后使用ficoll-hypaque淋巴细胞分离液，以1800rpm/min的转速进行密度梯度离心18min，分离出单个核细胞，加入生理盐水，以1800rpm/min的转速离心洗涤22min，离心洗涤2遍，用gt-551培养液调整细胞密度为3.5×106个/ml，得到基础培养体系，向所述基础培养体系中加入人血清和ifn-γ得到一次培养体系，所述一次培养体系中人血清的浓度为7wt％，ifn-γ的浓度为1100u/ml，将所述一次培养体系于培养温度为37.5℃，co2浓度为5％的培养箱中进行一次培养26h，然后加入il-2、cd3mcab和il-1得到二次培养体系，所述二次培养体系中，il-2的浓度为550u/ml，cd3mcab的浓度为110ng/ml，il-1的浓度为110u/ml。将所述二次培养体系于培养温度为37.5℃，co2浓度为5％的培养箱中进行二次培养11天，每隔3天向所述二次培养体系内补加一次营养液，所述营养液包括gt-551培养液、人血清和il-2，每次补加营养液时，先添加gt-551培养液调整细胞密度为1.5×106个/ml，然后每100ml二次培养体系中加入6ml人血清，每1ml二次培养体系中加入550u的il-2，二次培养完毕后，收获分离出细胞，用无菌生理盐水洗涤所述细胞2遍，即得治疗银屑病的免疫细胞制剂。
实施例2
本实施例提供一种治疗银屑病的免疫细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
采集健康人脐带血于采血袋中，检查采血袋外观、采集量等并做好记录与编号，采用蘸有75％酒精的纱布擦拭采血袋外壁3遍进行消毒，然后使用ficoll-hypaque淋巴细胞分离液，以2200rpm/min的转速进行密度梯度离心22min，分离出单个核细胞，加入生理盐水，以2200rpm/min的转速离心洗涤18min，离心洗涤3遍，用gt-551培养液调整细胞密度为4.5×106个/ml，得到基础培养体系，向所述基础培养体系中加入人血清和ifn-γ得到一次培养体系，所述一次培养体系中人血清的浓度为9wt％，ifn-γ的浓度为900u/ml，将所述一次培养体系于培养温度为36.5℃，co2浓度为5％的培养箱中进行一次培养22h，然后加入il-2、cd3mcab和il-1得到二次培养体系，所述二次培养体系中，il-2的浓度为450u/ml，cd3mcab的浓度为90ng/ml，il-1的浓度为90u/ml。将所述二次培养体系于培养温度为36.5℃，co2浓度为5％的培养箱中进行二次培养15天，每隔3天向所述二次培养体系内补加一次营养液，所述营养液包括gt-551培养液、人血清和il-2，每次补加营养液时，先添加gt-551培养液调整细胞密度为2.5×106个/ml，然后每100ml二次培养体系中加入4ml人血清，每1ml二次培养体系中加入450u的il-2，二次培养完毕后，收获分离出细胞，用无菌生理盐水洗涤所述细胞4遍，即得治疗银屑病的免疫细胞制剂。
实施例3
本实施例提供一种治疗银屑病的免疫细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
采集健康人捐献血于采血袋中，检查采血袋外观、采集量等并做好记录与编号，采用蘸有75％酒精的纱布擦拭采血袋外壁3遍进行消毒，然后使用ficoll-hypaque淋巴细胞分离液，以2000rpm/min的转速进行密度梯度离心20min，分离出单个核细胞，加入生理盐水，以2000rpm/min的转速离心洗涤20min，离心洗涤3遍，用gt-551培养液调整细胞密度为4×106个/ml，得到基础培养体系，向所述基础培养体系中加入人血清和ifn-γ得到一次培养体系，所述一次培养体系中人血清的浓度为8wt％，ifn-γ的浓度为1000u/ml，将所述一次培养体系于培养温度为37℃，co2浓度为5％的培养箱中进行一次培养24h，然后加入il-2、cd3mcab和il-1得到二次培养体系，所述二次培养体系中，il-2的浓度为500u/ml，cd3mcab的浓度为100ng/ml，il-1的浓度为100u/ml。将所述二次培养体系于培养温度为37℃，co2浓度为5％的培养箱中进行二次培养12天，每隔3天向所述二次培养体系内补加一次营养液，所述营养液包括gt-551培养液、人血清和il-2，每次补加营养液时，先添加gt-551培养液调整细胞密度为2×106个/ml，然后每100ml二次培养体系中加入5ml人血清，每1ml二次培养体系中加入500u的il-2，二次培养完毕后，收获分离出细胞，用无菌生理盐水洗涤所述细胞3遍，即得治疗银屑病的免疫细胞制剂。
临床试验例
将本发明治疗银屑病的免疫细胞制剂应用于临床试验，进一步研究了本发明在治疗银屑病上的治疗效果，具体试验过程如下：
1、临床试验样本：选取2009年6月-2016年6月解放军第208医院收治的15例病例进行临床观察，均符合中华医学会皮肤病分会制定的银屑病诊断标准，排除严重心、脑、肝、肾等脏器病变及血液系统疾病者，其中男11例，女4例，年龄最小22岁，最大65岁。患者皮肤均有边界清楚、形状大小不一的红斑，周围有炎性红晕，有浸润增厚，表面覆盖多层银白色鳞屑。鳞屑易于刮脱，刮净后淡红发亮的半透明薄膜，刮破薄膜可见小出血点(auspitz征)。皮损多发于头部、骶部和四肢伸侧面。患者自觉程度较重的瘙痒。所有患者均为已采用激素类药物、免疫抑制剂等多种药物治疗3年以上仍反复发作的顽固性难治患者。治疗前原使用药物逐渐减量直至停止其他药物治疗。
2、治疗方法：静脉输注该细胞制剂，每天1次，连续4天为一疗程，1个月进行1疗程，治疗3个疗程。
3、疗效评定标准：
患者病情评分参照pasi(psoriasisareaandseverityindex，银屑病面积和严重程度指数)标准，包括皮损面积评分和皮损严重程度评分。
疗效判定标准:按照pasi评分标准，记录治疗前后的pasi评分，根据pasi评分下降率进行疗效判定。每例患者均随访6个月以上，6个月后判定疗效。
pasi评分下降率＝(治疗前pasi评分-治疗后pasi评分)/治疗前pasi评分×100％。痊愈，pasi评分下降率>90％；显效，pasi评分下降率为60％-89％；有效，pasi评分下降率为20％-59％；无效，pasi评分下降率<20％。总有效率＝(痊愈例数+显效例数+有效例数)/总例数×100％。
4、治疗结果：大多数患者治疗1个疗程即开始起效，治疗3个疗程后，15例患者均表现皮损减轻、脱落、变薄，皮肤表面平整光滑；随访6个月，8例患者pasi评分下降率>90％，色素沉着完全消失，与正常皮肤相同，达到治愈标准；5例患者pasi评分下降率为60-89％，达到显效标准；1例患者pasi评分下降率为40％，达到有效标准；1例患者pasi评分下降率为15％，判为无效。患者经过治疗后普遍反映皮肤症状缓解明显，而且体力明显增强。总例数15例，治愈8例，显效5例，有效1例，总有效率93.3％。
5、不良反应：治疗过程中及治疗后所有患者均未观察到全身不良反应。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。