本发明涉及一种肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型的构建方法。
背景技术：
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，以下简称hcc或肝癌)占原发性肝癌90％以上，为我国第四位的常见恶性肿瘤及第三位的肿瘤致死病因。尽管肝癌的基础与临床研究取得了一定进展，但肝癌患者的总体生存率仍未得到明显改善(cancerstatisticsinchina,2015.cacancerjclin2016,66(2):115-32.)，目前仍需继续探索肝癌治疗的新策略。
肿瘤微环境(tme)是指肿瘤生长过程中，由肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质等共同构成的局部稳态环境，为肿瘤的发生发展、侵袭转移等提供了必要的物质基础。临床研究发现，在肿瘤靶向治疗过程中，仅针对肿瘤细胞的靶向药物已无法完全抑制肿瘤的活性，共同以肿瘤细胞及肿瘤微环境为靶点，可能发挥更好疗效。肝癌微环境组成中的细胞及其细胞因子等的变化，为肝癌的诊断与预后提供了信息，如肿瘤相关巨噬细胞、treg细胞等与肿瘤侵袭转移或患者预后相关(cancertherapy:anevolvedapproach.nature2016,532(7598):166-8.)。此外，肿瘤微环境(tumormicroenvironment,tme)作为肝癌细胞赖以生存和发展的土壤，可促进hcc的发生发展，并影响肝癌治疗方案的选择及疗效(roleofthemicroenvironmentinthepathogenesisandtreatmentofhepatocellularcarcinoma.gastroenterology2013,144(3):512-27.)。因此，探索通过干预tme抑制肝癌侵袭转移的机制及其转化研究，有望提高肝癌患者的长期生存。
构建可模拟人肝癌生物学特征的动物模型是探索肝癌的发病机制和治疗策略的研究基础，目前常用于建立肝癌模型的动物有大鼠，小鼠、兔、旱獭、猴等，小鼠遗传物质和人非常相似，构建模型成本低、周期短、基因修饰技术更容易实现，因此小鼠是用于人类肝癌研究的理想动物(precisioncancermousemodelsthroughgenomeeditingwithcrispr-cas9.genomemed2015,7(1):53.)，目前构建的肝癌小鼠模型类型包括诱发性小鼠肝癌模型、移植性小鼠肝癌模型，基因修饰性小鼠肝癌模型等(小鼠肝癌模型研究进展，中国实验动物学报2016，24(2):213-216.)，移植性小鼠肝癌模型是目前最常用的模型类型，建模多将人肝癌细胞移植至裸鼠肝脏，构建裸鼠肝癌原位移植模型(裸小鼠肝癌原位移植模型的建立，中国实验动物学报2016，24(3):239-247.)，然而之前基于裸鼠的肝癌研究成果并未展现出较好的临床转化价值，这可能归因于裸鼠存在免疫缺陷，肝癌微环境和人纤维化背景下的肝癌微环境成分不同，裸鼠肝癌原位移植模型未能真实的模拟人肝癌微环境，忽略了肿瘤微环境对肝癌发生发展、侵袭转移的影响，因此目前需要构建一种可模拟人肝癌微环境的小鼠肝癌原位移植模型。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型的构建方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型的构建方法，用ccl4溶液灌胃小鼠28天-56天，ccl4溶液每周灌胃3次或两周灌胃7次，获得肝纤维化的小鼠，然后对小鼠用肝癌细胞进行肝癌原位移植，即得肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型。
进一步的，所述ccl4溶液中ccl4的体积浓度为20％～40％。
进一步的，所述ccl4溶液中的溶剂选自橄榄油或玉米油。
进一步的，所述小鼠为4-6周龄小鼠。
进一步的，所述灌胃一次ccl4溶液的用量为0.1ml-0.15ml。
进一步的，每只小鼠进行肝癌原位移植所用的肝癌细胞数为1.0×106-5.0×106个。
进一步的，所述肝癌细胞包括hepa1-6和h22。
上述任一项所述方法制得的小鼠肝癌原位移植瘤模型在制备移植瘤肝内转移和/或移植瘤肺转移模型中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明应用ccl4对c57bl/6或balb/c小鼠进行肝纤维化诱导，建立稳定的肝纤维化小鼠模型，而后应用同源性肝癌细胞(hepa1-6或h22)进行肝癌原位移植，构建纤维化基础上小鼠肝癌原位移植模型。该模型模拟了大多数慢性肝病的共同病理特征，更加真实反应人肝癌发展的过程，较好的展现肝纤维化背景下的肿瘤微环境对肝癌增殖、侵袭转移的影响，更准确的模拟了人肝癌生物学特性，解决了关于肿瘤微环境对肝癌发生发展、侵袭转移的研究缺少理想动物模型的问题，有助于探索干预tme抑制肝癌侵袭转移的机制及其转化研究的开展，对筛选以肝癌微环境为靶点的药物、探讨治疗肝癌新策略起到了积极的推动。
附图说明
图1为移植瘤小鼠于术后第7、14、21和28天(每组6只)，利用小动物活体成像系统动态监测正常肝脏与纤维化小鼠肝脏原位移植瘤的生长；其中normalliver表示用正常肝脏小鼠建立的模型，fibrosis表示本发明小鼠肝脏原位移植瘤模型；
图2为图1肿瘤生物发光强度动态变化趋势，*表示p＜0.05。
图3为正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型与本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型中移植瘤肝内转移的h&e与天狼星红染色图；t表示肿瘤原发灶，m表示肝内转移瘤。
图4为正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型与本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型中移植瘤肝内转移结节数(左图)及肝叶数(右图)的统计分析，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
图5为正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型与本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型中移植瘤肺转移的h&e染色图；m表示肺转移灶。
图6为正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型与本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型中移植瘤肺转移数目的统计分析，*表示p＜0.05。
图7为正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型与本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型的生存曲线图，其中位生存期分别为40天和29.5天，f代表本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型的生存曲线，n代表正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型的生存曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型的构建方法
1)配制体积浓度为40％的ccl4的橄榄油溶液，选取4周龄c57bl/6小鼠，应用ccl4的橄榄油溶液连续灌胃4周(3次/周，0.1ml/次)，获得肝纤维化的小鼠，小鼠肝脏纤维程度通过天狼星红染色进行评估。
2)取体外已转入荧光素酶的、培养生长良好的小鼠肝癌细胞(hepa1-6)，用胰酶消化细胞后离心，应用等体积比的pbs溶液和matrigel胶将细胞配置成浓度为4×107/mlhepa1-6细胞稀释液；利用该hepa1-6细胞稀释液对上述肝纤维化的小鼠进行肝癌原位移植，原位移植的hepa1-6细胞数为1×106个/只，即得肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型。
实施例2一种肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型的构建方法
1)配制体积浓度为20％的ccl4的橄榄油溶液，选取5周龄balb/c小鼠，应用ccl4的玉米油溶液连续灌胃8周(7次/2周，0.15ml/次)，获得肝纤维化的小鼠，小鼠肝脏纤维程度通过天狼星红染色进行评估。
2)取体外已转入荧光素酶的、培养生长良好的小鼠肝癌细胞(h22)，用胰酶消化细胞后离心，应用等体积比的pbs溶液和matrigel胶将细胞配置成浓度为2×108/mlhepa1-6细胞稀释液；利用该hepa1-6细胞稀释液对上述肝纤维化的小鼠进行肝癌原位移植，原位移植的hepa1-6细胞数为5×106个/只，即得肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型。
对比例1正常肝脏小鼠肝癌原位移植瘤模型的构建方法
取体外已转入荧光素酶的、培养生长良好的小鼠肝癌细胞(hepa1-6)，用胰酶消化细胞后离心，应用等体积比的pbs溶液和matrigel胶将细胞配置成浓度为4×107/mlhepa1-6细胞稀释液；利用该hepa1-6细胞稀释液对8周龄正常小鼠进行肝癌原位移植，原位移植的hepa1-6细胞数为1×106个/只，即得正常肝脏小鼠肝癌原位移植瘤模型。
下面对本发明制备的肝纤维化小鼠肝癌原位移植瘤模型作进一步的效果检测。
一、本发明小鼠肝脏原位移植瘤模型中的移植瘤生长更快
方法：应用小动物活体成像系统动态监测上述实施例1(fibrosis)和对比例1(normalliver)小鼠肝癌生物发光强度，检测前腹腔注射荧光酶素底物并实施吸入性麻醉，10分钟后将小鼠放入仪器(bruker，fxpro)内进行检测。
结果：检测结果如图1和图2所示，图1为移植瘤小鼠于术后第7、14、21和28天(每组6只)，利用小动物活体成像系统动态监测正常肝脏与纤维化小鼠肝脏原位移植瘤的生长；其中normalliver表示用正常肝脏小鼠建立的模型，fibrosis表示本发明小鼠肝脏原位移植瘤模型；从中可以看出，本发明小鼠模型体内的移植瘤所发出的荧光强度和面积均显著高于对正常肝脏小鼠建立的模型。说明与正常肝脏小鼠建立的模型相比，本发明肝纤维化的小鼠肝脏原位移植瘤模型更有利于移植瘤的快速生长，说明说明本发明方法建立的小鼠移植瘤生长速度更快(图1，图2)。
二、本发明小鼠肝脏原位移植瘤模型更易发生移植瘤肝内转移
方法：对上述实施例1(fibrosis)和对比例1(normalliver)所得小鼠模型的肝脏分别进行石蜡包埋，通过h&e和天狼星红染色验证肝脏成瘤和纤维化诱导效果。
结果：检测结果如图3和图4所示，从中可以看出，与正常肝脏小鼠建立的模型相比，在本发明小鼠模型体内的中移植瘤肝内转移的结节数和肝叶数显著提高，说明说明本发明方法建立的小鼠肝脏原位移植瘤模型更有利于移植瘤的肝内转移(图3，图4)。
三、本发明小鼠肝脏原位移植瘤模型更易发生移植瘤肺转移
方法：对上述实施例1(fibrosis)和对比例1(normalliver)所得小鼠模型的肝脏分别进行石蜡包埋，通过h&e染色验证肝癌肺转移情况。
结果：检测结果如图5和图6所示，从中可以看出，与正常肝脏小鼠建立的模型相比，在本发明小鼠模型体内的中移植瘤肺转移的数目显著提高，说明本发明方法建立的小鼠肝脏原位移植瘤模型更有利于移植瘤的肺转移(图5，图6)。
四、本发明小鼠肝脏原位移植瘤模型生存期更短
方法：构建正常肝脏小鼠建立的原位移植瘤模型(如对比例1)与本发明肝纤维化小鼠原位移植瘤模型，记录小鼠生存时间并绘制成生存曲线。
结果：如图7，从中可以看出，与正常肝脏小鼠建立的模型(中位生存期为40天)比，在本发明小鼠模型生存期(中位生存期为29.5天)明显缩短，本发明方法建立的小鼠肝脏原位移植瘤模型更有利于肿瘤进展，并缩短了生存期(图7)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。