一种透明质酸前药及其制备方法和在透皮给药中的应用与流程

本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种透明质酸前药及其制备方法和在透皮给药中的应用。

背景技术：

透皮给药系统是指药物应用于皮肤表面，使其通过皮肤不断地输送到皮下组织并进入血液循环，从而达到有效的治疗浓度。透皮给药系统作为一种新型的给药系统，具有较多优势：减少注射带来的疼痛以及避免口服药物的异味，提高患者的依从性；以恒定的速率释放药物；与皮下注射药相比，克服因吸收过快产生血液浓度过高而引起的不良反应；避免肝脏首过效应以及防止药物在肠胃中的降解；减少用药的个体差异；使用方便，可持续控制给药速度，灵活给药。因此透皮给药系统是目前药物制剂领域的研究热点。但是，目前透皮给药仍存在透过率低、皮肤的正常屏障功能受损、存在皮肤刺激性和过敏性、载体的生物相容性有待提高、药物的利用率低等缺点。

透明质酸是一种多功能基质，广泛分布于人体各个部位。其中皮肤也分布大量的透明质酸。目前，透明质酸已被广泛运用于生物医学，如组织工程(laurent,1992)、药物传递(yun,2004)和分子成像(camber,1989)。作为透皮给药制剂，与皮肤有良好的亲和性和铺展性，对皮肤无刺激性和过敏性，不影响皮肤的正常生理功能。在临床医药领域中，作为皮肤外部药物的载体，对某些生物大分子药物具有较高的附着力，不仅能延缓药物的释放率，而且还能提高经皮吸收效率以及靶向性。透明质酸是理想的保湿因子，可以在皮肤的表面形成水合膜，增加角质层的水分，使得角质细胞在吸收一定量的水分后发生膨胀和减低结构的致密程度，从而改变皮肤角质层的渗透性，促进药物渗透进入皮肤。

因此，如何利用透明质酸的优势，结合药物通过经皮吸收来达到有效的局部或全身治疗已成为研究热点。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种透明质酸前药的制备方法。该方法通过偶联反应将药物分子修饰于透明质酸形成前药高分子，该前药的制备条件温和，操作简单；可负载的药物范围广泛；载药量可通过药物分子与透明质酸的投料比来调节。

本发明另一目的在于提供上述方法制备的透明质酸前药。

本发明再一目的在于提供上述透明质酸前药在制备经皮给药系统中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种透明质酸前药的制备方法，包括以下步骤：

(1)将透明质酸溶解于水中，然后向其中加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀得混合溶液；

(2)将药物分子溶于水中形成药物水溶液，然后将药物水溶液加入到步骤(1)中的混合溶液中，搅拌过夜，然后装入透析袋透析，冷冻干燥后得透明质酸前药。

步骤(1)中所述的透明质酸的分子量范围为100000～2000000；

步骤(1)中所述的透明质酸、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为4～20:2:1；步骤(1)中所述的水的用量满足形成的透明质酸的水溶液中透明质酸的质量分数为0.5％～1％；

步骤(2)中所述的药物分子可以为：具有氨基活性基团的5-氨基酮戊酸、米诺地尔、氨甲环酸和丝裂霉素c；具有羧基活性基团的黄芩苷、熊果酸和二氢卟吩e6；具有羟基活性基团的盐酸阿霉素、紫杉醇、喜树碱、水杨酰苯胺和长春碱等；

步骤(2)中所述的水的用量满足每1g的药物分子对应使用50～200ml水；步骤(2)中所述的药物水溶液和步骤(1)中混合溶液的用量满足药物水溶液中药物分子与混合溶液中的透明质酸的质量比为1：(1～50)，优选为1：2；

步骤(2)中所述的搅拌过夜中的搅拌是为了反应物之间更好的接触，因此可不限定步骤(2)的搅拌速度，本领域常规使用的搅拌速度均可实现此效果，优选为搅拌速度为150～300r/min；

步骤(2)中所述的透析袋的截留分子量为100～1000；所述的透析是指将透析袋浸入水中浸泡，浸泡时间为1～3d。

步骤(1)和(2)中未指明温度的均指在室温下进行，所述的室温优选为5～35℃。

一种由上述方法制备得到的透明质酸前药。

上述的透明质酸前药由于载药量高，稳定性较好，透皮效率高，有效地携带药物分子通过皮肤表层进入皮下组织，从而实现局部或全身的疾病治疗，在制备经皮给药系统中具有广泛的应用价值。

本发明的机理为：

皮肤是人体最大的器官，主要分为表皮层、真皮层和皮下组织。其中，角质层是表皮层的最外层，与外界环境直接接触，是皮肤最重要的保护性结构。角质层作为一个连续的屏障，主要由角质细胞和细胞间脂质构成，具有半透膜的特性。因此，大多数药物的经皮吸收效率低，难以通过皮肤吸收来达到治疗的效果。本发明利用透明质酸来接枝药物分子，使其克服角质层的屏障作用，通过细胞间隙穿透以及皮肤附属器的开口将药物分子传递到皮下组织，提高药物分子靶向性以及皮肤的吸收效率。透明质酸作为给药的载体，可有效提高药物的经皮渗透性，有利于药物被吸收进入体循环，从而达到局部治疗或全身治疗的有效血药浓度。与现有技术相比，本发明通过将药物分子接枝在透明质酸上，药物分子的皮肤渗透量明显增加，提高了药物的利用率，同时也方便医生对患者的治疗，对某些疾病可直接给药，有效降低风险和副作用，具有广阔的应用前景。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)透明质酸是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一，其重要生理功能之一是在皮肤组织中的保湿作用，具有良好的生物相容性，是良好的透皮促渗剂；

(2)透明质酸的基本结构是由两个双糖单位d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的线性多糖，具有大量的羧基和羟基基团，可以接枝大量的药物分子，提高药物的利用率；

(3)透明质酸可接枝任何有活性基团的药物分子，应用领域范围广。

(4)透明质酸作为经皮给药载体接枝药物分子，可以有效地避免肝脏的首过效应，减少药物在肠胃中的降解，进而提高药物的生物利用度；

(5)经皮给药可避免由药物引起的肠胃道功能失调，如食欲不振、恶心、腹胀、便秘或腹泻等；

(6)透明质酸可以特异性结合过度表达cd44的多种癌细胞，增强药物的肿瘤靶向性；

(7)给药次数少，可持续控制给药速度，灵活给药；

(8)本发明材料成分简单、制备的条件容易满足、使用方便、生物相容性好，具有很好的临床使用价值。

附图说明

图1为实施例1制备得到的透明质酸接枝5-氨基酮戊酸和原料透明质酸的核磁氢谱图。

图2为实施例1、2和3制备得到的样品以及原料5-氨基酮戊酸采用franz透皮扩散池测得的不同时间下通过小鼠背部皮肤的累积透过量的实验结果图。

图3为实施例1制备得到的透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的体外细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

实施例1：透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的制备

(1)称取相应的原料：透明质酸、药物分子、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、水余量；

所述的透明质酸与药物分子的质量比为10:1，透明质酸、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为：4:2:1；

(2)将透明质酸溶解于水中，再加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，置于磁力搅拌器上，以200r/min的转速搅拌1h；

(3)将药物分子溶解于水中，再将其加入到(2)中，搅拌过夜；将得到的样品装入透析袋(截留分子量为500)，然后再将透析袋浸入纯水中搅拌3天，冷冻干燥，得到透明质酸接枝5-氨基酮戊酸。

结果分析：图1中对比了透明质酸和透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的核磁图，其中化学位移在2.78、3.24ppm处的峰对应5-氨基酮戊酸中亚甲基的质子峰。结果证实，透明质酸成功地与5-氨基酮戊酸偶联。

实施例2：透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的制备

(1)称取相应的原料：透明质酸、药物分子、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、水余量。

所述的透明质酸与药物分子的质量比为5:1,透明质酸、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为：4:2:1；

(2)将透明质酸溶解于水中，再加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，置于磁力搅拌器上，以200r/min的转速搅拌1h；

(3)将药物分子溶解于水中，再将其加入到(2)中，搅拌过夜；将得到的样品装入透析袋(截留分子量为500)，然后再将透析袋浸入纯水中搅拌3天，冷冻干燥，得到透明质酸接枝5-氨基酮戊酸。

核磁氢谱图与图1一致，说明本实施例中透明质酸也成功地与5-氨基酮戊酸偶联。

实施例3：透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的制备

(1)称取相应的原料：透明质酸、药物分子、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、水余量。

所述的透明质酸与药物分子的质量比为2:1,透明质酸、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为：4:2:1；

(2)将透明质酸溶解于水中，再加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，置于磁力搅拌器上，以200r/min的转速搅拌1h；

(3)将药物分子溶解于水中，再将其加入到(2)中，搅拌过夜；将得到的样品装入透析袋(截留分子量为500)，然后再将透析袋浸入纯水中搅拌3天，冷冻干燥，得到透明质酸接枝5-氨基酮戊酸。

核磁氢谱图与图1一致，说明本实施例中透明质酸也成功地与5-氨基酮戊酸偶联。

实施例4：体外皮肤渗透性测试

对实施例1、2和3制备得到的样品采用franz透皮扩散池进行体外皮肤渗透性试验。具体操作如下：小鼠(购于南方医科大学实验动物中心)一只，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后断颈处死，用电剃刀除去小鼠背部的毛发，再用剪刀剪下已去除毛发的完整皮肤。用沾有生理盐水的棉球擦拭皮肤的真皮层，去除粘附的皮下组织，再用生理盐水洗涤皮肤，擦干，用锡箔纸包裹，置于-20℃的冰箱中保存，备用。将准备好的皮肤固定于franz扩散池的供给室与接收室之间，其中皮肤的表层面向供给室，该扩散池的有效渗透面积为1.767cm²。向接收室加入体积为12ml的pbs(ph＝7.4)，使得液面与皮肤能够紧密接触。实验过程中采用循环水浴加热，使温度保持在37℃，并以200r/min的转速搅拌。

用移液枪分别取溶解于水中的实施例1、2和3制备好的样品5ml(浓度均为1mg/ml)，加入到供给室中，并用保鲜膜密封以防止样品蒸发。在规定的时间(1.0、2.0、3.5、5.5、7.5、10.0、12.0、16.0、20.0、24.0h)抽取上层样品50μl，取得的所有样品放于-4℃冰箱保存。将样品用pbs稀释后经过0.45μm的滤膜过滤，采用高效液相色谱仪对样品进行定量分析，并通过计算得知随时间的增加样品透过皮肤的累积量。结果如图2所示，从图2中可以看出，透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的累积渗透量明显高于5-氨基酮戊酸的累积渗透量。在1h时，与单有5-氨基酮戊酸的实验组相比，透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的渗透量倍量增加，这表明透明质酸在经皮吸收上有非常好的促渗作用。透明质酸接枝5-氨基酮戊酸的实验组中，不同的投料比获得的材料的累积渗透量也是不相同的，其中透明质酸与5-氨基酮戊酸的质量比为2:1时，其透皮效果最佳。

实施例5：细胞毒性测定

将实施例1制备得到的透明质酸接枝5-氨基酮戊酸，经过滤灭菌后按照一定的浓度梯度(10、100、250、500μg/ml)加入到融合度达70％的大鼠成纤维细胞(购于广州第一军区医院)中共培养。24h后，采用cck-8法测定材料的细胞毒性，结果如图3所示，在样品浓度到达500μg/ml时，细胞的存活率仍然保持在80％以上。对比5-氨基酮戊酸的实验组，样品的细胞存活率明显较高。图3的结果表明，透明质酸修饰的5-氨基酮戊酸明显降低了5-氨基酮戊酸的细胞毒性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。