一种纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的制备方法和应用与流程

本发明涉及一种纳米药物载体的制备方法和应用，属于纳米复合材料技术领域，特别涉及一种纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的制备方法和应用。

背景技术：

美国甲型h1n1流感爆发事件虽已过去，但时至今日，依然还有很多人因为h1n1流感病毒而失去生命，h1n1流感病毒的传播感染给人类社会带来严重的隐患和灾难。接种流感病毒疫苗可以降低高危人群流感发病率和死亡率，但现有的疫苗对新型病毒株的预防缺乏特异性，导致临床上流感病毒的预防或治疗不佳。

流感病毒突变后，新亚型引起感染，不易有效控制。流感病毒的感染难以得到控制，主要是由于流感病毒表面的两种糖蛋白，血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)蛋白，抗原性弱且容易发生抗原变异和耐药性突变从而导致新亚型的出现。流感爆发期间特异性流感病毒疫苗不能满足全球需求量，因此，运用流感病毒药物进行抗病毒治疗尤为重要。

h1n1流感病毒对抗病毒药物金刚烷胺产生耐药性，给临床上抗病毒药物治疗带来困扰。人体必需的微量元素硒可以通过维持机体免疫力和氧化还原平衡等多种途径参与到病毒性疾病的发生和发展过程。

基于上述技术现状，如何提高流感病毒药物的抗病毒活性，进行抗病毒药物增敏治疗是一个亟待研究的课题。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的制备方法，获取分散均匀稳定的纳米硒运载金刚烷胺载药体系。该药物载体具有良好的抗病毒作用，纳米硒负载金刚烷胺能够协同抑制h1n1流感病毒复制。

另一方面，本发明的目的是提供纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体在抑制h1n1流感病毒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)取抗氧化溶剂逐滴加入到亚硒酸钠溶液中，加入去离子水，得到纳米硒初溶液；

(2)磁力搅拌2h，经透析获取纯化后的纳米硒溶液；

(3)取上述纳米硒溶液，加入金刚烷胺溶液，得到纳米硒-金刚烷胺初溶液；

(4)磁力搅拌1h，反应后的溶液经过透析，10000rpm离心10min，去离子水洗三遍，样品冷冻干燥后得到纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体。

进一步地，步骤(1)中，所述抗氧化溶剂为维生素c溶液，浓度为50mm；所述亚硒酸钠溶液的浓度为0.1m；

进一步地，步骤(1)中，所述纳米硒初溶液的浓度为1mm。

进一步地，步骤(2)中，所述透析为选用1000截留分子量的透析袋，透析24h；

进一步地，步骤(3)中，所述纳米硒-金刚烷胺初溶液中纳米硒含量为125μm，金刚烷胺含量为0.1μm；

进一步地，步骤(4)中，所述透析为选用1000截留分子量的透析袋，透析24h。

本发明提供如上所述制备方法制备得到的纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体。

进一步地，所得纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体中，按质量浓度比，纳米硒：金刚烷胺＝1250：1；

进一步地，所得纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体中，纳米硒与金刚烷胺的作用方式是由于生成se-n键。

进一步地，所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的载药率为25％；

进一步地，所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的粒径大小为70nm；

进一步地，所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的电位为-36.9mv；

进一步地，所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体中，按质量浓度计算，se元素占72％，c、n来源于金刚烷胺分别为20％和8％。

本发明提供如上所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体在制备抑制h1n1流感病毒药物中的应用。

本发明提供如上所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体在制备抑制h1n1流感病毒感染细胞的凋亡信号通路药物中的应用。

进一步地，所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体通过以下任一种或多种方法实现抑制h1n1流感病毒：

a)所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体是通过抑制h1n1流感病毒的神经氨酸酶活性而实现的；

b)所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体是通过抑制病毒感染细胞的caspase-3活性而实现的；

c)所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体是通过抑制病毒感染细胞的ros活性而实现的；

d)所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体是通过抑制病毒感染细胞的akt磷酸化而实现的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本项目采用纳米硒负载金刚烷胺协同抑制h1n1流感病毒复制，制备得到纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体并研究其分子机制。通过对纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的合成及表征，确定纳米硒负载金刚烷胺结合方式、稳定性及载药率。通过细胞存活率验证其抗流感病毒效果；实验研究得出其通过抑制h1n1流感病毒的神经氨酸酶活性、通过抑制病毒感染细胞的caspase-3活性、通过抑制病毒感染细胞的ros活性、通过抑制病毒感染细胞的蛋白表达水平而实现对h1n1流感病毒抑制，为开阔临床抗病毒药物机制研究提供参考。

纳米硒作为药物载体具有良好的抗病毒活性，纳米硒负载金刚烷胺得到的纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体抑制h1n1感染细胞作为抗病毒药物增敏治疗具有重要的学术意义，本发明为临床抗病毒增敏治疗提供新的用药途径和科学依据。

附图说明

图1为实施例2中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的基本物理特性；

图2为实施例2中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的粒径图及电位图；

图3为实施例2中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体形貌变化的透射电镜图；

图4为实施例2中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的元素分析图；

图5为实施例2中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的红外光谱和x射线光电子能谱；

图6为实施例3中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对mdck细胞存活率检测分析图；

图7为实施例4中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对na的抑制效果分析图；

图8为实施例5中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对caspase-3活性的检测分析图；

图9为实施例6中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对ros活性的检测分析图；

图10为实施例7中westernbolt检测凋亡信号通路分析图

现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

人体必需的微量元素硒可以通过维持机体免疫力和氧化还原平衡等多种途径参与到病毒性疾病的发生和发展过程。宿主细胞内的硒含量会影响许多入侵病毒的突变、复制和毒力。纳米技术的出现给病毒耐药治疗带来曙光。纳米硒作为药物载体具有高生物活性、低毒性等特点。

本发明所得纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体采用纳米硒运载金刚烷胺，协同抑制h1n1流感病毒的复制。本发明通过对纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的合成及表征，确定纳米硒负载金刚烷胺的结合方式、稳定性及载药率，从而较全面了解纳米体系的组成结构信息；通过细胞存活率验证纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的抗流感病毒效果；以及通过神经氨酸酶活性(na)、活性氧(ros)产生凋亡信号通路探索纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体抑制病毒感染细胞的分子机制及信号通路。

本发明的具体内容如下：

1)纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体载药体系的制备及表征

探索制备纳米硒运载金刚烷胺的最佳物质比例及载药率；利用纳米粒度电位仪(nano-zs)检测纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的粒径电位；利用透射电镜(tem)观察纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的形貌变化；利用元素分析(edx)检测纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的元素组成；利用红外光谱(ir)和x射线光电子能谱(xps)观察纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的结合方式。

2)纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体在细胞水平抑制流感病毒活性

分别检测单独纳米硒、单独金刚烷胺、纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对病毒感染后细胞的活性。

3)纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体抑制流感病毒的分子机制研究

检测单独纳米硒、单独金刚烷胺、纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对病毒神经氨酸酶活性(na)的抑制效果；检测药物处理病毒感染细胞后活性氧(ros)的产生；检测药物处理病毒感染细胞后的相关凋亡信号通路。

下面通过具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释，但是本发明的技术方案不以具体实施例为限。

实施例1纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体载药体系的制备

取2ml储备溶液为50mm维生素c溶液逐滴加入到0.25ml浓度为0.1m亚硒酸钠(na2seo3)溶液中，加入去离子水使终体积为25ml。磁力搅拌2h，经透析后获取纯化后的纳米硒溶液。透析选用1000截留分子量的透析袋，透析24h。取上述纳米硒溶液10ml，加入0.8ml储备液为1μm的金刚烷胺溶液，磁力搅拌1h，反应后的溶液经过透析，透析为选用1000截留分子量的透析袋，透析24h，10000rpm离心10min，去离子水洗三遍，样品冷冻干燥得到纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体载药体系。

所得纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体中，按质量浓度比，纳米硒：金刚烷胺＝1250：1；所述纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的载药率为25％。

实施例2纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体载药体系的表征

纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的基本物理特性

从颜色外观及丁达尔效应区分金刚烷胺(am)、纳米硒(senps)和纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(se@am)。

如图1所示，a图是金刚烷胺(am)、纳米硒(senps)和纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(se@am)的颜色对照。am是澄清透明，senps比se@am颜色深，这可能是se@am中引入am的结果；b和c图是se@am的丁达尔效应；从图上可以看出se@am区别于senps和am。

利用纳米粒度电位仪(nano-zs)检测纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的粒径及电位

如图2所示，a和b分别是senps和se@am的粒径分布，从图中可以看出，senps平均粒径为200nm，se@am平均粒径为70nm。功能化后的纳米硒比单独纳米硒粒径小，更容易进入细胞。c是senps和se@am的电位分布，从图中可以看出，senps的电位为-23.5mv，se@am的电位为-36.9mv。从电位的数据分析，se@am电位的绝对值比senps大，说明稳定性比senps好。d是se@am的稳定性测定，从图中可以看出，se@am在30天左右粒径基本没有变化，稳定性良好。

利用透射电镜(tem)观察纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的形貌变化

如图3所示，a和b分别是senps和se@am的透射电镜图，从图中可以看出未经修饰的纳米硒容易出现团聚，功能化后的纳米硒比单独纳米硒分散均匀。

利用元素分析(edx)检测纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的元素组成

如图4所示，是纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的元素分析，其中se元素占72％，c、n来源于am分别为20％和8％。元素分析显示得到功能化的纳米硒。

利用红外光谱(ir)和x射线光电子能谱(xps)观察纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的结合方式

se@am的红外光谱采用kbr压片法处理。

结果如图5，a中从上到下依次是am、senps和se@am红外光谱图。其在am红外光谱图中2903cm^-1是-ch2伸缩振动峰，1264cm^-1是-nh2的伸缩振动峰，739cm^-1是c-n吸收峰。这些特征峰在se@am谱图中的消失，说明am通过化学键和纳米硒发生作用。

xps光谱验证am和senps之间的相互作用方式。

如图中b所示，在se@am的谱图中，可以看到n1s的特征结合能峰，说明am成功结合在senps的表面。xps证明am与senps的作用方式是由于生成se-n键。

实施例3纳米硒运载金刚烷胺对mdck细胞的毒性测定(mtt)

mtt法测不同药物组分对mdck细胞处理后的作用效果：正常细胞对照组(control)、病毒感染细胞组(virus)、病毒感染细胞+纳米硒组(virus+am)、病毒感染细胞+金刚烷胺组(virus+senps)、病毒感染细胞+纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(virus+se@am)。

步骤如下：用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞3min制成单细胞悬液，在96孔培养板以4×10⁴个细胞/孔接种，置于培养箱中(37℃，5％co2)预培养24h后，加入h1n1病毒孵育2h，然后加入含有不同浓度药物组的培养基各100μl，继续培养24h。往培养板加入mtt(5mg/ml)20μl/孔，37℃孵育5h后吸弃培养板孔中的液体，加入dmso150μl/孔，振荡10min，紫色结晶物充分溶解后，测定各孔od570值。

以对照组od570为100％，计算药物处理组细胞存活率。细胞存活率(％)＝(od570实验组/od570对照组)×100％。

结果如图6所示，a显示病毒感染细胞后，细胞存活率为32.34％，相对于正常细胞对照组明显下降。病毒感染细胞后，分别加金刚烷胺和纳米硒处理后，细胞存活率分别为53.23％和58.87％，相对于正常细胞对照组有所上升。纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体处理病毒感染细胞后，存活率上升到79.26％，相对于其它组分明显上升。b是对应加药组细胞形貌变化，从图中可以看出，单独病毒感染后的细胞，形貌发生明显变化，纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体有效抑制病毒感染细胞。

实施例4纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对神经氨酸酶活性(na)的抑制实验

h1n1流感病毒的神经氨酸酶活性可以通过神经氨酸酶抑制实验检测。

将h1n1流感病毒液在室温条件下分别于不同药物作用，按试剂盒操作，加入荧光酶作用底物充分混匀，37℃孵育，设定激发波长和发射波长，测定荧光强度值并计算神经氨酸酶抑制率：病毒感染细胞组(virus)、病毒感染细胞+纳米硒组(virus+am)、病毒感染细胞+金刚烷胺组(virus+senps)、病毒感染细胞+纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(virus+se@am)。

如图7所示，是检测各组分神经氨酸酶活性。神经氨酸酶糖蛋白的主要功能为协助病毒颗粒穿过呼吸道粘液及促进子代病毒体脱离于感染细胞。从图中可以看出，纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体的神经氨酸酶活性最低，以上结果提示，纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体可以作用流感病毒na来抑制流感病毒感染宿主细胞。

实施例5纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对caspase-3活性作用的检测

荧光法检测药物激活caspase-3活性：正常细胞对照组(control)、病毒感染细胞组(virus)、病毒感染细胞+纳米硒组(virus+am)、病毒感染细胞+金刚烷胺组(virus+senps)、病毒感染细胞+纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(virus+se@am)。

步骤如下：以3×10⁵个细胞/孔接种在12cm培养皿，预孵育24h，加入h1n1病毒孵育2h，然后加入不同组药物处理24h，去掉培养基，预冷pbs清洗3次，细胞刮刀刮取细胞，离心收集(1500rpm，5min)，然后用预冷的pbs清洗2次，每管加入150μl细胞裂解液，-20℃放置过夜；次日，冰浴2h，期间每隔5min震荡一次，离心(13000rpm，4℃，20min)。bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白提取液中蛋白的浓度，步骤按照试剂盒说明书操作。荧光法检测caspase-3活性，荧光酶标仪设置激发波长为380nm，发射波长为440nm，检测荧光强度，以对照组作为100％，计算处理组caspase-3相对活性。

天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)是一类介导细胞凋亡的蛋白水解酶，在凋亡过程中，caspase-3是凋亡信号通路中关键执行者。如图8所示，病毒感染细胞组明显激活caspase-3活性。病毒感染细胞组经过药物处理后caspase-3活性得到抑制，其中纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体抑制效果最明显，能够有效抑制病毒感染细胞后caspase-3活性。

实施例6纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体对活性氧(ros活性)作用的检测

dcfh-da法检测胞内活性氧的相对水平：正常细胞对照组(control)、病毒感染细胞组(virus)、病毒感染细胞+纳米硒组(virus+am)、病毒感染细胞+金刚烷胺组(virus+senps)、病毒感染细胞+纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(virus+se@am)。

步骤如下：在96孔板内接种4×10⁴cells/孔细胞，预培养24h，去掉培养基并用pbs洗涤3次，加入dcfh-da探针，使终浓度达10μm，孵育30min，加入h1n1病毒孵育2h，然后加入药物在37℃培养箱中孵育30min，在荧光显微镜(nikoneclipse80i)下观察，采集信息。

线粒体是多种凋亡信号整合的位点，线粒体呼吸链是细胞内活性氧(ros)的主要来源，细胞代谢过程中过量的ros会损伤dna。我们从细胞超微结构变化的角度验证病毒对线粒体结构损伤作用。如图9所示，是检测不同药物组ros的产生情况，从a和b可以看出，病毒感染细胞组明显促进细胞产生大量ros，而纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体可以明显抑制h1n1病毒感染mdck细胞产生ros。

实施例7westernbolt检测纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体抑制h1n1病毒复制的机制

westernbolt检测抑制h1n1病毒复制的机制：正常细胞对照组(control)、病毒感染细胞组(virus)、病毒感染细胞+纳米硒组(virus+am)、病毒感染细胞+金刚烷胺组(virus+senps)、病毒感染细胞+纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体(virus+se@am)。

细胞接种以8×10⁴个细胞/孔接种10cm培养皿，孵育24h，加入h1n1病毒孵育2h，然后加入不同组分的药物处理24h，离心收集细胞(1500rpm，5min)，用预冷的pbs清洗细胞3次，每管加入150μl细胞裂解液，-20℃放置过夜；次日，冰浴2h，期间每隔5min震荡一次，离心(12000rpm，4℃，10min)。混匀后在预热至95℃的微孔板孵育/振荡器中煮5min，取出后于-20℃保存备用。浓缩胶70v电压电泳约30min，分离胶110v电压电泳约70min。转膜、室温封闭1h。一抗1：1000比例稀释4℃过夜。二抗室温孵育2h。采用ecl试剂盒进行化学发光显影。

苏氨酸蛋白激酶(akt)及其下游信号的持续激活，影响着凋亡相关的关键分子活化，进而调节细胞增殖、分化、凋亡等。如图10所示，从a和b可以看出，病毒感染细胞组能显著引起caspase-3激活和akt磷酸化。纳米硒-金刚烷胺复合纳米药物载体能有效抑制h1n1病毒感染细胞后的蛋白水平变化。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。