MTHFD1L抑制剂在制备舌鳞癌治疗药物中的用途的制作方法

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及mthfd1l抑制剂在制备舌鳞癌治疗药物中的用途。

背景技术：

舌鳞状细胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma,tscc)简称舌鳞癌，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度较高，生长快，浸润性强，容易发生颈淋巴结转移，预后较差。随着外科手术水平及放化疗技术的进步，舌鳞癌的5年生存率已经有所提高。但是，总体预后仍然不理想。

肿瘤的原发部位、大小、病理分级、临床分期等因素均可对患者预后产生影响，对有较高复发率和淋巴结转移倾向的舌鳞癌进行早期预测，并制定有效的治疗计划是提高舌鳞癌患者生存率和生存质量的关键。临床常用的tnm分期不能完整体现肿瘤的遗传学和生物学特征，深入研究与肿瘤发生、发展相关的分子机制以及肿瘤标记物，将有助于提高该肿瘤早期诊断的准确率，制定个性化的辅助治疗方案，更有效地判断患者的预后。

5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolatedehydrogenase(nadp+dependent)1like，mthfd1l)基因编码一种具有甲酸四氢叶酸合成酶活性的蛋白，参与细胞内线粒体四氢叶酸(thf)的合成，对维持生物体内叶酸循环有重要作用。研究表明，mthfd1l的某些突变体与神经管缺陷有关，但是mthfd1l在肿瘤增殖和凋亡过程中的具体机制，目前尚无明确报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供mthfd1l抑制剂在制备舌鳞癌治疗药物中的用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了mthfd1l抑制剂用于制备舌鳞癌治疗药物的用途。

一种实施方式中，所述舌鳞癌治疗药物至少具有以下功用之一：

抑制舌鳞癌细胞增殖；促进舌鳞癌细胞凋亡；抑制舌鳞癌细胞克隆；抑制舌鳞癌肿瘤生成。

一种实施方式中，所述mthfd1l抑制剂是指对mthfd1l具有抑制效果的分子。

对于mthfd1l具有抑制效果包括但不限于：抑制mthfd1l活性，或者抑制mthfd1l基因转录或表达。

所述mthfd1l抑制剂可以为sirna、shrna、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述mthfd1l抑制剂可以为sirna或shrna。所述sirna的靶序列或shrna的靶序列如seqidno.1所示。

所述舌鳞癌治疗药物必然包括mthfd1l抑制剂，并以mthfd1l抑制剂作为前述功用的有效成分。

所述舌鳞癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为mthfd1l抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，mthfd1l抑制剂为所述舌鳞癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述舌鳞癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述舌鳞癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述舌鳞癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供了一种治疗舌鳞癌的方法，为向对象施用mthfd1l抑制剂。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的舌鳞癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述舌鳞癌细胞可以为离体舌鳞癌细胞。

所述对象可以是罹患舌鳞癌的患者或者期待治疗的舌鳞癌的个体。或者所述对象为舌鳞癌患者或者期待治疗舌鳞癌的个体的离体舌鳞癌细胞。

所述mthfd1l抑制剂可以在接受舌鳞癌治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供一种舌鳞癌治疗药物，包括有效剂量的mthfd1l抑制剂。

进一步地，所述舌鳞癌治疗药物，包括有效剂量的mthfd1l抑制剂及药用载体。

所述舌鳞癌治疗药物必然包括mthfd1l抑制剂，并以mthfd1l抑制剂作为前述功用的有效成分。

所述舌鳞癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为mthfd1l抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，mthfd1l抑制剂为所述舌鳞癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述舌鳞癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述舌鳞癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述舌鳞癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第四方面，提供一种舌鳞癌联合治疗药物组合，包括有效量的mthfd1l抑制剂和至少一种其他舌鳞癌治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将mthfd1l抑制剂和其他舌鳞癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他舌鳞癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他舌鳞癌治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将mthfd1l抑制剂和其他舌鳞癌治疗药物配置成复方制剂，在将mthfd1l抑制剂和其他舌鳞癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第五方面，提供一种治疗舌鳞癌的方法，为向对象施用有效量的mthfd1l抑制剂以及向对象施用有效量的其他舌鳞癌治疗药物和/或向对象实施其他舌鳞癌治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的mthfd1l抑制剂和至少一种有效量的其他舌鳞癌治疗药物。

基于mthfd1l为本发明首次发现的舌鳞癌治疗靶点，在与mthfd1l抑制剂以外的其他舌鳞癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于舌鳞癌的治疗作用。

其他的舌鳞癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述mthfd1l抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他舌鳞癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

本发明的第六方面，提供mthfd1l抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：抑制舌鳞癌细胞增殖；促进舌鳞癌细胞凋亡；抑制舌鳞癌细胞克隆；抑制舌鳞癌肿瘤生成。

本发明的第七方面，提供mthfd1l在制备和筛选舌鳞癌治疗药物中的用途。

一种实施方式中，mthfd1l作为作用靶标。

一种实施方式中，所述用途具体是指：将mthfd1l作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到mthfd1l抑制剂，作为潜在的舌鳞癌治疗药物。

一种实施方式中，所述用途具体是指：将mthfd1l基因作为作用靶标筛选能降低舌鳞癌细胞中mthfd1l基因的表达水平的双链rna或shrna作为舌鳞癌治疗药物。

一种实施方式中，所述双链rna或shrna的靶序列如seqidno:1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，mthfd1l可作为舌鳞癌治疗靶点。mthfd1l抑制剂可抑制舌鳞癌细胞增殖；促进舌鳞癌细胞凋亡；抑制舌鳞癌细胞克隆；抑制舌鳞癌肿瘤生成，治疗舌鳞癌，为舌鳞癌治疗开辟新的方向。

附图说明

图1：a和b慢病毒感染cal27和tca-8113细胞荧光图片，上部图片为感染shctrl慢病毒组，下部为感染shmthfd1l感染慢病毒组，左侧为明场照片，右侧为荧光照片。

图2：shmthfd1l敲减效率检测，a、shmthfd1l慢病毒显著抑制cal27和tca-8113细胞中mthfd1l基因在mrna水平的表达量，柱状结果以平均值±标准差显示，**表示p<0.01，b、westernblot图示，干扰靶点对mthfd1l的外源表达在蛋白水平有敲减作用。

图3：celigo细胞计数法验证mthfd1l基因对细胞增殖影响，a、cal27组细胞celigo连续5天记录细胞图片；shrna慢病毒感染cal27细胞，shmthfd1l组与shctrl对照组细胞数目随时间变化的曲线；shrna慢病毒感染cal27细胞，shmthfd1l组与shctrl对照组细胞数量的变化倍数随时间变化的对比；b、tca-8113组细胞celigo连续5天记录细胞图片；shrna慢病毒感染tca-8113细胞，shmthfd1l组与shctrl对照组细胞数目随时间变化的曲线；shrna慢病毒感染tca-8113细胞，shmthfd1l组与shctrl对照组细胞数量的变化倍数随时间变化的对比。

图4：mtt法检测mthfd1l基因对细胞增殖活力的影响，a.shrna慢病毒感染cal27细胞，培养5天后，经mtt处理4小时，shmthfd1l组与shctrl对照组在酶标仪对波长490nm的光的吸收率随时间变化的对比，od490在这里反映了具有活力的细胞的数量；shrna慢病毒感染cal27细胞，培养5天后，经mtt处理4小时，shmthfd1l组与shctrl对照组在酶标仪对波长490nm的光的吸收率变化倍数随时间变化的对比。od490在这里反映了具有活力的细胞的数量；b.shrna慢病毒感染tca-8113细胞，培养5天后，经mtt处理4小时，shmthfd1l组与shctrl对照组在酶标仪对波长490nm的光的吸收率随时间变化的对比，od490在这里反映了具有活力的细胞的数量；shrna慢病毒感染tca-8113细胞，培养5天后，经mtt处理4小时，shmthfd1l组与shctrl对照组在酶标仪对波长490nm的光的吸收率变化倍数随时间变化的对比，od490在这里反映了具有活力的细胞的数量。

图5a：annexinv-apc流式细胞凋亡检测shmthfd1l对cal27细胞凋亡的影响，左侧为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示，**表示p<0.01。

图5b：annexinv-apc流式细胞凋亡检测shmthfd1l对tca-8113细胞凋亡的影响，左侧为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示，**表示p<0.01。

图6a：细胞克隆形成法检测mthfd1l基因对细胞增殖能力的影响，shrna慢病毒感染cal27细胞，培养11天后，观察克隆数，左侧为数码相机记录图，右侧柱状结果以细胞克隆数平均值±标准差显示，**表示p<0.01。

图6b：细胞克隆形成法检测mthfd1l基因对细胞增殖能力的影响，shrna慢病毒感染tca-8113细胞，培养11天后，观察克隆数，左侧为数码相机记录图，右侧柱状结果以细胞克隆数量平均值±标准差显示，**表示p<0.01。

图7a：动物成瘤实验检测mthfd1l敲减对细胞成瘤能力的影响，shctrl对照组和shmthfd1l实验组注射tca-8113瘤细胞后第8、10、13、16、20、23、27天测量肿瘤体积的折线图。

图7b：动物成瘤实验检测mthfd1l敲减对细胞成瘤能力的影响，柱状结果以切取肿瘤重量平均值±标准差显示，*表示p<0.05。

图7c：动物成瘤实验检测mthfd1l敲减对细胞成瘤能力的影响，shctrl对照组和shmthfd1l实验组注射tca-8113瘤细胞后第27天动物瘤体对比图。

图8a：mthfd1l缺失抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的分子机制研究，mthfd1l敲减抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡的分子调控网络图。

图8b：mthfd1l缺失抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的分子机制研究，mthfd1l的缺失可能通过影响myc的表达水平，westernblot检测myc蛋白。

具体实施方式

评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、克隆形成能力、凋亡等。本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性mthfd1l基因的表达，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，并验证其在舌鳞癌发生与发展中的作用，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因mthfd1l，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。

我们的研究发现设计针对mthfd1l基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对mthfd1l基因进行敲减后，会显著影响舌鳞癌细胞tca-8113和cal27细胞的增殖，影响细胞克隆形成能力，并促进细胞的凋亡。同时我们也通过了基因芯片并结合生信分析，结果发现mthfd1l能够通过myc分子来调控肿瘤细胞的生长和分化，通过wb实验，在细胞tca-8113中检测到myc目的条带。表明该基因可能是通过myc分子来调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点。

mthfd1l

5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolatedehydrogenase(nadp+dependent)1like，mthfd1l)基因编码一种具有甲酸四氢叶酸合成酶活性的蛋白。

mthfd1l抑制剂

指对于mthfd1l具有抑制效果的分子。对于mthfd1l具有抑制效果包括但不限于：抑制mthfd1l活性，或者抑制mthfd1l基因转录或表达。所述mthfd1l抑制剂包括但不限于sirna、shrna、抗体、小分子化合物。

抑制mthfd1l活性是指使mthfd1l活力下降。优选地，相比抑制前，mthfd1l活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制mthfd1l基因转录或表达是指：使mthfd1l的基因不转录，或降低mthfd1l的基因的转录活性，或者使mthfd1l的基因不表达，或降低mthfd1l的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对mthfd1l的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰rna等。

mthfd1l的基因转录或表达的抑制可以通过pcr及westernblot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，mthfd1l基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地mthfd1l基因完全没有表达。

小分子化合物

本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。

mthfd1l抑制剂制备药物

以mthfd1l抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与mthfd1l抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将mthfd1l抑制剂和其他舌鳞癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

二)将mthfd1l抑制剂和其他舌鳞癌治疗药物配置成复方制剂，在将mthfd1l抑制剂和其他舌鳞癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。sirna、shrna、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

可以同步地或顺序地给予有效量的mthfd1l抑制剂和至少一种有效量的其他舌鳞癌治疗药物。

使用时，可将有效量的mthfd1l抑制剂和有效量的其他舌鳞癌治疗药物同时使用，也可将有效量的mthfd1l抑制剂和有效量的其他舌鳞癌治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1

(一)实验方法

1、针对mthfd1l基因的干扰慢病毒制备

针对mthfd1l基因，设计了特异性靶点干扰序列，针对mthfd1l的shrna记为shmthfd1l，所述shmthfd1l所针对的靶序列如seqidno.1所示，具体为：

5’-attccagttcctgtatgat-3’(psc-1,psc28333)。shmthfd1l所对应的sirna的序列如seqidno.2所示，具体为：5’-auuccaguuccuguaugau-3’所述shmthfd1l自身的序列如seqidno.3所示，具体为：

5’-attccagttcctgtatgatctcgagatcatacaggaactggaat-3’。阴性对照(shctrl)的靶序列如seqidno.4所示，具体为：5’-ttctccgaacgtgtcacgt-3’。

根据靶点序列设计shrna干扰序列，分别构建至hu6-mcs-cmv-egfp质粒载体中，与phelper1.0载体和phelper2.0载体质粒，共转染293t细胞，在转染48-72h获得未纯化的细胞上清，并对上清进行纯化浓缩获得高滴度的慢病毒。

2、rt-pcr检测目的基因敲减效率

针对mthfd1l基因进行引物设计。抽提对照组shctrl以及shmthfd1l干扰慢病毒感染组细胞，分别抽提rna，反转录获得cdna，以gapdh为内参，通过rt-pcr检测mthfd1l的mrna表达情况。

3、westernblot外源验证靶点有效性

将构建含有融合flag标签的mthfd1l表达克隆质粒和针对mthfd1l干扰靶点的rnai病毒载体质粒，共转染至293t细胞中，48h后，收集蛋白并定量，运用flag抗体进行westernblot检测蛋白敲减效率。

4、celigo细胞计数法检测细胞生长

对cal27和tca-8113细胞进行慢病毒感染4天后，传代接种于96孔板中，铺板24h后，通过celigo仪器读取表达egfp荧光的细胞并拍照，通过软件处理计算孔板中不同组别的细胞数目，连续检测5天后，绘制细胞的生长曲线图，分析细胞生长情况。

5、mtt检测细胞活力

对cal27和tca-8113细胞进行慢病毒感染4天后，传代接种与96孔板中，铺板24h后，培养终止前4h加入20μl5mg/ml的mtt溶液，4h后加入100μldmso溶液，进行酶标仪检测。

6、annnexinv-apc流式细胞凋亡检测

对cal27和tca-8113细胞进行慢病毒感染4天后，传代铺板，待细胞融合度达85％后，消化收集细胞，加入annnexinv-apc染色处理，使用流式细胞仪对细胞进行检测，并运用guavaincyte流式细胞仪分析软件进行分析。

7、细胞克隆实验

对cal27和tca-8113细胞进行慢病毒感染5天后，传代接种于6孔板中，将接种好的细胞持续培养11天，中间每隔3天进行换液并观察细胞状态，加入1ml4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，然后加入洁净、无杂质500μlgiemsa染液，染细胞10-20min，处理完毕后数码相机拍照。

8、裸鼠成瘤实验

对tca-8113细胞进行慢病毒感染4天后，传代铺板，待细胞融合度达85％后，消化收集，然后完全培养基重悬成细胞悬液，调整浓度至5×10⁶个细胞/ml,使用一次性无菌注射器，注射至动物皮下，每只200μl，注射后第8、10、13、16、20、23、27天分别测量肿瘤体积，注射后第27天，安乐死处理动物后，取出肿瘤称重，记录数据。

9、人基因表达谱芯片patharraytm生物信息分析

在基因组学中，通过基因芯片技术产生的海量数据代表了生物体内发生的全部过程及其变化。从这些庞大而复杂的实验数据中寻找生物体的改变以及引起这些改变的源头和机制。使用genechipprimeviewhuman人基因表达谱芯片patharray^tm进行分析，使用信号强度分布、信号强度归一化、相关性分析、主成分分析对芯片质量进行控制，然后使用差异分析及统计检验、火山图、散点图、聚类分析进行显著性分析，基于ipa进行差异基因功能分析，包括经典通路分析、上游调控分析、疾病和功能分析、调控效应分析、相互作用网络分析，寻找出myc可为关键分子，并进行wb验证，在细胞tca-8113中检测到myc目的条带。

(二)实验结果

1、mthfd1l基因干扰慢病毒干扰及敲减效率验证

运用构建好的shmthfd1l干扰慢病毒以及shctrl对照慢病毒以moi20感染cal27和tca-8113细胞，72小时后在荧光显微镜下观察egfp荧光并拍照，结果显示细胞感染效率达到80％以上，细胞状态良好(如图1中的a和b)。

确认感染效果后，通过qpcr实验验证shmthfd1l慢病毒的干扰效率。qpcr结果显示shmthfd1l显著抑制了cal27和tca-8113细胞中mthfd1l基因在mrna水平的表达量(p<0.05)，敲减效率达95.1％和80.6％。(如图2中的a)。通过将含有融合flag标签的shctrl过表达质粒与shmthfd1l干扰质粒共转染293t细胞，westernblot检测flag标签，结果显示干扰靶点对mthfd1l的外源表达在蛋白水平有敲减作用，因而是有效靶点(如图2的b)。

2、mthfd1l基因干扰抑制cal27和tca-8113细胞增殖

通过celigo细胞计数法对shmthfd1l干扰组以及shctrl对照组cal27和tca-8113细胞进行连续5天的拍照记录，结果显示，mthfd1l基因干扰可显著影响cal27和tca-8113细胞的生长增殖。cal27细胞shctrl对照组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天相比与第1天的增殖倍数分别为1.33±0.03，2.03±0.06，3.40±0.08，5.05±0.06，而shmthfd1l干扰组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天相比与第1天的增殖倍数分别为1.10±0.03，1.31±0.02，1.62±0.02，1.77±0.09；tca-8113细胞shctrl对照组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天相比与第1天的增殖倍数分别为1.73±0.11，3.19±0.14，5.46±0.63，9.79±0.74，而shmthfd1l干扰组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天相比与第1天的增殖倍数分别为1.91±0.04，2.34±0.03，2.41±0.18，2.86±0.19，生长倍数显著被抑制(如图3中的a和b)。

此外，运用mtt检测方法同样验证了mthfd1l基因对细胞活力的影响。mtt实验结果显示，cal27细胞组shctrl对照组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天与第一天相比的细胞活力倍数分别为1.75±0.15，2.72±0.21，4.04±0.02，5.27±0.14，而shmthfd1l干扰组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天与第1天相比的细胞活力倍数分别为1.37±0.02，1.71±0.03，2.21±0.02，2.61±0.05；tca-8113细胞组shctrl对照组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天与第一天相比的细胞活力倍数分别为2.46±0.06，3.77±0.05，5.35±0.28，6.65±0.09，而shmthfd1l干扰组细胞贴壁生长后第2天，第3天，第4天，以及第5天与第1天相比的细胞活力倍数分别为1.71±0.07，2.06±0.02，2.34±0.03，2.55±0.05，显示shmthfd1l组细胞增殖明显减缓(如图4中的a和b)。

3、mthfd1l基因干扰促进cal27和tca-8113细胞凋亡

接下来我们通过流式检测shmthfd1l对细胞凋亡的影响，流式检测annexinv标记的细胞结果显示，shmthfd1l组的细胞凋亡率显著增加，由cal27细胞shctrl对照组的4.42±0.1728％上升至26.52±1.442％(p<0.01)，由tca-8113细胞shctrl对照组的4.58±0.2169％上升至12.21±0.3443％(p<0.01)表明mthfd1l基因干扰显著促进了cal27和tca-8113细胞凋亡(如图5a和图5b)。

4、mthfd1l基因干扰抑制cal27和tca-8113细胞克隆

通过细胞克隆方法验证了mthfd1l基因对细胞增殖能力的影响。细胞克隆实验结果显示，观察克隆数，实验组cal27和tca-8113细胞组shmthfd1l干扰组细胞集落数目显著减少，cal27细胞shctrl对照组的集落数目从737±8个减少至8±1个(p<0.01)，表明mthfd1l基因干扰显著抑制了cal27细胞克隆形成能力；tca-8113细胞shctrl对照组的集落数目从421±3个减少至12±1个(p<0.01)，表明mthfd1l基因干扰显著抑制了tca-8113细胞克隆形成能力(如图6a和图6b)。

5、mthfd1l基因干扰能够抑制裸鼠肿瘤的生成

此外，我们建立了balb/c裸鼠模型，验证了mthfd1l基因对肿瘤生成的影响。动物成瘤实验结果显示，shmthfd1l实验组较shctrl对照组肿瘤生成能力显著降低，瘤体体积小，瘤体重量轻。shctrl对照组注射tca-8113瘤细胞后第8、10、13、16、20、23、27天测量肿瘤体积分别为25.61±10.68mm³、71.80±30.66mm³、201.45±53.88mm³、428.54±141.35mm³、892.38±188.35mm³、1238.36±216.65mm³、1902.99±351.62mm³，注射后第27天测得的肿瘤重量为1.964±0.38g；shmthfd1l实验组注射瘤细胞后第8、10、13、16、20、23、27天测量肿瘤体积分别为0、0、1.85±2.50mm³、5.46±6.28mm³、23.74±26.80mm³、53.83±50.35mm³、175.24±154.42mm³，注射后第27天测得的肿瘤重量为0.221±0.155g。提示mthfd1l基因干扰抑制了裸鼠肿瘤的生成(如图7a、7b和7c)。

6、mthfd1l缺失抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的分子机制研究。基因芯片结果显示，mthfd1l的缺失可能通过影响myc的表达水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡。研究表明，mthfd1l能与myc(mycproto-oncogene，bhlhtranscriptionfactor)发生直接相互作用，c-myc可通过间接活化细胞周期蛋白e/cdk2以促进e2f与dna的结合，或通过直接转录激活上调e2f表达来促进细胞增殖，还可通过其下游靶点铁传递蛋白受体(tfrc1)调节细胞的增殖；此外，myc可通过抑制内源启动子的转录降低ddit3(dnadamageinducibletranscript3)基因的表达，ddit3高表达可通过抑制bcl2诱导凋亡，还可通过与促凋亡死亡受体5(dr5)基因5’端结合而增加dr5蛋白的表达，dr5通过激活caspase通路诱导细胞的程序性死亡，因此，mthfd1l缺失也可能通过myc介导的转录调控，影响ddit3的表达，从而诱导细胞凋亡并且抑制肿瘤细胞的增殖。mthfd1l能与maged(magefamilymemberd1)发生直接相互作用，而maged能增强jun(junproto-oncogene,ap-1transcriptionfactorsubunit)的磷酸化水平，促进jun的表达，因此，mthfd1l缺失也可能通过maged影响jun的表达，从而诱导细胞凋亡并且抑制肿瘤细胞的增殖。我们通过wb实验，在细胞tca-8113中检测到myc目的条带。本研究表明，mthfd1l缺失是能够通过myc抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的(r如图8a和8b)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110>徐州市中心医院

<120>mthfd1l抑制剂在制备舌鳞癌治疗药物中的用途

<130>183692

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

attccagttcctgtatgat19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

auuccaguuccuguaugau19

<210>3

<211>44

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

attccagttcctgtatgatctcgagatcatacaggaactggaat44

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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