本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物(i)其药理活性和药学用途。该化合物可以用于预防和/或治疗各种因素引起的肿瘤或癌症等疾病。
背景技术
结肠癌是我国九大常见恶性肿瘤之一。在过去30多年的时间里，我国结肠癌发病率呈上升趋势。结肠癌死亡者，男性居恶性肿瘤死亡的第5位，女性居第6位。从流行病学的观点看，结肠癌的发病与社会环境、生活方式(尤其是饮食习惯、缺乏体力活动)、遗传因素有关。年龄、结直肠息肉史、溃疡性结肠炎及胆囊切除史也是结肠癌的高危因素。但总体而言，结肠癌的病因似不十分清楚。
结肠癌多见于中老年人，30～69岁占绝大多数，男性多于女性，发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。
结肠癌的治疗仍以外科手术为根治的基础，有手术适应证者仍以外科手术为首选治疗方式。有效的综合治疗或适当的辅助放疗、化疗是临床日益重视的方面，尤其是服用安全有效的抗结肠癌药物，可有效提高患者的生存质量。但是目前临床上可用的安全、低毒、有效的抗肿瘤药物非常少。因此，寻找高效、低毒、可选择性杀伤或抑制肿瘤细胞的新作用机制的新型抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物研发的重要方向。
二氯乙酸是一类线粒体丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂，可以丙酮酸脱氢酶(pdh)的活性，控制氧化应激之间的转换磷酸化和糖酵解。二氯乙酸类化合物可通过调控肿瘤细胞的代谢变化发挥抗肿瘤活性，近年来受到更多的关注。将二氯乙酸与缩胺基硫脲化合物结合，可有效提高化合物的生物学活性，提高化合物对氧化应激水平的调节，发挥更加优异的抗肿瘤活性。
本发明涉及二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物(i)在药物领域中的应用，现有技术中没有本发明提供的二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物(i)及其作为有效成分的药物的报道，也没有该化合物物或其药物组合物应用在制备或治疗各种因素引起的肿瘤等疾病药物中的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类即2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)药用用途，具体涉及在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤有关疾病的药物中的应用；
本发明所采用的2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)是本实验室化学合成所得，其化学结构式如下：
所述二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物为2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(2,2-dichloro-n-(2-(2,3-dibromo-4,5-dimethoxybenzylidene)hydrazinecarbonothioyl)acetamide)。
所述的二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物可以作为药物有效成分，用于制备抗肿瘤有关疾病的药物。
所述的抗肿瘤有关疾病为预防和/或治疗肿瘤、癌症等相关疾病和症状中的一种或二种以上，特别是指与肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤和/或癌症疾病中的一种或二种以上。
所述二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物的药物学上可接受的盐及二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物的化学等价物中的一种或二种以上可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
所述药物组合物含有0.1–99％，优选为0.5–90％的所述二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物的药物学上可接受的盐及二氯乙酰基溴酚缩氨基硫脲类化合物的化学等价物中的一种或二种以上，其余为药物学上可接受的药用载体和/或赋形剂。
药物学上可接受的盐为k盐和/或na盐。
本发明将上述2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)进行了抗肿瘤细胞增殖活性实验、细胞形态学观察实验、诱导肿瘤细胞凋亡实验、影响肿瘤细胞周期实验、影响细胞活性氧实验，实验结果表明，所述的2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡并能影响肿瘤细胞周期，并诱导肿瘤细胞产生活性氧，具有显著抗肿瘤活性。
所述的2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)可以作为药物有效成分，加以药学上可接受的载体，制备抗肿瘤药物组合物。尤其用于制备抗肿瘤有关疾病的药物。
本发明具有如下优点：
本发明经抗肿瘤活性实验证明化合物可显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞周期，显著诱导肿瘤细胞产生活性氧。具有显著抗肿瘤活性。
附图说明
图1为2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116增值抑制作用图。
图2为2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116凋亡作用的影响。
图3为2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116细胞周期的影响图。
图4为2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116活性氧的影响。
图5为2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116凋亡蛋白的影响。
具体实施方式
实施例1化合物的合成及结构鉴定
本发明2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺的制备步骤如下：称取1mmol2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)氨基硫脲和1mmol2,2-二氯乙酰氯(97μl)置于反应瓶中，再加入30ml二氯甲烷，然后加入500μlnaoh(2m)室温搅拌约12小时，后加入30毫升冰水，过滤得沉淀，冰水洗沉淀(30ml分三次)得化合物i。1h-nmr(500mhz,dmso-d6)δ:11.62(1h,s)，8.44(1h,s),8.34(1h,s),8.20(1h,s),7.80(1h,s),5.92(s,2h),3.91(3h,s),3.76(3h,s)；13c-nmr(125mhz,dmso-d6)δ:178.5,165.7,153.0,148.9,142.1,131.2,121.6,117.5,110.6,66.160.7,57.
实施例22,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对细胞增值活性的研究
1.实验药品
2,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)由本实验室合成制备，采用dmso助溶，配置成20mm储存液长期保存，实验用最大浓度为20μm。
2.细胞株
人结肠癌细胞(hct-116)购自中国科学院上海细胞库。用含质量浓度10％胎牛血清的dmem培养基在37℃、体积分数为5％co2、完全饱和湿度条件下空气中常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，3-4d传代1次，实验选用对数生长期细胞。
3.细胞活性检测
采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测化合物(i)对结肠癌细胞hct-116细胞增值活性的影响。取对数期的结肠癌细胞hct-116，胰酶消化重悬，调整细胞浓度为3×105/ml，以100μl/孔接种96孔板，贴壁生长24h后，吸弃培养基，加入不同浓度的化合物(i)(2.5,5,10,20μm)，每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的pbs溶媒对照及无细胞调零组。细胞在37℃、5％co2条件下培养48h，然后加入20μl，5mg/ml的mtt，于37℃、5％co2条件下孵育4h，吸弃上清，每孔加入150μldmso，震荡10分钟，酶标仪490nm波长下检测od值。并计算细胞抑制率和半数抑制浓度(ic50)。
结果显示：化合物(i)对结肠癌细胞hct-116具有较强的增殖抑制作用，其ic50为7.19μm。细胞增殖抑制活性见下图1。
实施例32,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116凋亡的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
细胞凋亡检测采用annexinv/pi染色法。取对数期结肠癌细胞hct-116，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h，加入不同浓度浓度的化合物(i)(5,10,20μm)，作用48h，同时设定空白组(pbs)。细胞用不含edta的胰酶消化，pbs洗涤三次，收集1～5×105细胞，加入500μl的bindingbuffer悬浮细胞成细胞悬液后加入5μlannexinv-fitc和5μlpropidiumiodide，混匀后室温避光反应15min，于流式细胞仪进行检测。
结果显示，化合物(i)可诱导结肠癌细胞hct-116发生凋亡，高浓度组凋亡比例可达59％，其促凋亡作用呈剂量依赖性，其抑制活性见下图2。
实施例42,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对a549细胞周期的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
对细胞周期的分析采用pi单染的方法。取对数期hct-116细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的化合物(i)(5,10,20μg/ml)，作用48h，同时设定空白组(pbs)。离心收集细胞，pbs洗涤两次，细胞用75％的冷乙醇重悬并置于-20℃过夜。细胞离心并用pbs洗涤两次，用pbs重悬细胞加入20μg/ml的rnasea于37℃孵育30min，然后细胞加入50μg/ml的pi室温避光孵育30min后于流式细胞仪进行检测。
结果显示，化合物(i)可诱导hct-116细胞发生g1期周期阻滞，其对a549周期阻滞见下图3。
实施例52,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对结肠癌细胞hct-116活性氧的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
取对数期a549细胞调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的化合物(i)(5,10,20μg/ml)，作用48h，同时设定空白组(pbs)。去除细胞培养液，加入1ml浓度为10μm的荧光探针dcfh-da，放入培养箱中孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内荧光探针dcfh-da。细胞用0.25％的胰酶消化离心，细胞沉淀用500μl的pbs重悬后于流式细胞仪进行检测。
结果显示，化合物(i)刺激hct-116细胞后，诱导细胞产生活性氧，与空白对照组相比，高浓度的化合物(i)可使细胞内活性氧浓度升高240.67％。结果见图4。
实施例62,2-二氯-n-(2-(2,3-二溴-4,5-二甲氧基苯亚甲基)肼硫代羰基)乙酰胺(i)对hct-116细胞凋亡蛋白的研究
1.实验细胞：
同实施例1
2.实验药物：
同实施例1
3.实验方法：
取对数期hct-116细胞调整细胞浓度为5×105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的化合物(i)(5,10,20μm)，作用48h，同时设定空白组(pbs)，用ripa强裂解液提取各组细胞总蛋白。sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶80v，分离胶120v)及转膜，转移蛋白至pvdf膜，将pvdf膜浸润在含5％脱脂奶粉的tbst中封闭1h，加入特异性一抗parp,bcl-2,bax,caspase-3(1:1000)。4℃过夜，tbst缓冲液洗膜3次，加入hrp标记的二抗(1:10000)室温孵育1h，tbst缓冲液洗膜3次，最后用ecl显色，x感光片感光后，显影定影。β-actin作为内参蛋白。
结果显示，化合物(i)刺激hct-116细胞后，诱导bax蛋白表达上调而下调bcl-2的表达，同时激活parp和caspase-3。结果见图5。