一种多功能纳米囊泡及其制备方法与流程

本发明涉及纳米材料的技术领域，特别是一种多功能纳米囊泡及其合成方法。

背景技术

将诊断和治疗这两个临床上独立的过程集成在一个纳米粒子上，实现即时精确诊断病情的同时又能同步进行治疗，是近年广受关注的诊疗一体化技术。诊疗一体化纳米体系在实现即时精确诊断和同步治疗的同时，还能够通过监控疗效以便及时调整给药方案，达到最佳的治疗效果，并且减少毒副作用。目前，临床上存在多种非介入式成像方式，然而，由于各种成像技术的成像原理与方法不同，诊断价值与限度也各不相同，这便会产生由单一成像模式无法解决的诊断问题。将两种或多种成像模式有效结合起来，使其既具有高分辨率、高灵敏度，也具备较好的组织穿透能力，是医学成像技术未来发展的方向。

荧光成像具有灵敏度高，单细胞成像和亚细胞级别的分辨率等优点，是一种有效的肿瘤诊断方式。目前主要的成像探针为有机小分子染料和荧光纳米材料，但是有机小分子染料存在稳定性差，水溶性差，光不稳定性以及酸不稳定性等缺点，此外还具有一定的生物毒性。但是，纳米载体的出现，可有效解决这些问题。此外，纳米材料表面易修饰，可同时包载多种功能分子，同时提高材料的生物相容性，是一种理想的载体。

磁共振成像模式具有高空间分辨率和深组织穿透能力，但其灵敏度却相对较低，无法实现细胞级别的成像。因此，为了提高临床诊断的精确性和准确性，磁共振成像是与荧光成像构建双模态成像结合的最佳合作伙伴。目前磁共振成像造影剂主要包括两类，一类是含钆(gd)配合物或其衍生物，其能促进磁共振纵向(t1)成像效果增强，作为t1阳性造影剂；另一类是超顺磁性材料，其能促使磁共振横向(t2)成像效果减弱，作为t2阴性造影剂。因此，通过配位键直接将荧光成像小分子与磁共振造影剂螯合在一起并且制备成纳米粒子，是一种十分简便有效的制备荧光/磁共振双模态成像探针的方法。

随着纳米材料和纳米技术的不断发展，许多无创有效的癌症治疗技术应运而生，其中光动力治疗被认为是一种高效、安全、无创和精确的治疗技术。光敏剂作为光动力治疗的关键因素，是一种能将光能转移到周围氧分子的化学物质，生成具有活性的氧自由基，如单线态氧(¹o2)，氧自由基能够不可逆地破坏细胞膜结构，导致病变组织细胞死亡。

光敏剂作为光动力治疗的关键因素，其选择至关重要。目前常用的光敏剂主要包括有机小分子染料和无机纳米颗粒，无机纳米颗粒主要为上转换纳米粒子、稀土量子点等。上转换纳米粒子以及稀土量子点稳定性高，具有可跨紫外区和可见光区较宽的吸收谱，但是其主要原材料为非生物体元素的稀土元素，其生物毒性以及代谢问题严重限制其应用。然而，有机小分子染料的主要组成元素为碳、氮、氢和氧等，与生物体组成元素一致，具有更为广阔的应用前景。

综上所述，上述的技术存在的问题在于：无法使用简单有效的手段构建出生物毒性小、制备简单化、功能多样化的多模态成像指导的光动力治疗的纳米材料。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种多功能纳米囊泡及其合成方法，该方法通过简单的制备方法合成出生物毒性小、功能多样化的纳米粒子。

在阐述本发明的方案之前，对以下英文简称予以解释：fl：荧光；mr：磁共振；petct：正电子发射计算机断层扫描；pdt：光动力治疗；tcpp：中-四(4-羧基苯基)卟吩；edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；nhs:n-羟基丁二酰亚胺；mpeg-nh2:氨基修饰的聚乙二醇；γ-pga：聚谷氨酸；pei：聚乙烯亚胺。

其具体方案为：一种多功能纳米囊泡，包括核层、壳层和设置在壳层外的水化层；所述的核层、壳层和水化层通过静电吸附的方式组装形成纳米囊泡；

所述的核层为中-四(4-羧基苯基)卟吩；所述的壳层为聚乙烯亚胺，所述的水化层为聚乙二醇水化层；

所述的壳层修饰有用于与特定的目标物特异性结合后发荧光的功能基团，或，所述的核层螯合有磁共振造影离子或正电子发射计算机断层扫描成像离子。

在上所述的多功能纳米囊泡中，所述的功能基团包括但不局限于锌离子识别基团或铜离子识别基团，所述的功能基团和壳层通过共价键连接。

同时，本发明还公开了一种如上所述的多功能纳米囊泡的制备方法，将中-四(4-羧基苯基)卟吩、聚乙烯亚胺、聚谷氨酸修饰的聚乙二醇三者在室温下混合搅拌一段时间即可；

所述的中-四(4-羧基苯基)卟吩螯合有磁共振造影离子或正电子发射计算机断层扫描成像离子，或所述的聚乙烯亚胺的支链修饰有用于与特定的目标物特异性结合后发荧光的功能基团。

在上述的多功能纳米囊泡的制备方法中，所述的混合搅拌时间为5-24小时。

在上述的多功能纳米囊泡的制备方法中，所述的功能基团为锌离子识别基团或铜离子识别基团，所述的功能基团和壳层通过共价键连接。

在上述的多功能纳米囊泡的制备方法中，所述的磁共振造影离子或正电子发射计算机断层扫描成像离子为gd³⁺、⁶⁴cu或mn²⁺。

在上述的多功能纳米囊泡的制备方法中，还包括透析步骤：在混合搅拌结束后进行透析纯化。

本发明的有益效果在于：

本发明聚乙烯亚胺分子量比较小，分子量范围8000-12000，分子毒性小。

更为重要的是，本发明合成方法温和简单，不会导致聚乙烯亚胺表面共价连接的功能基团断裂。其有利于尽量以最少的功能基团并以最大可能性地连接在亲水性的聚乙烯亚胺的表面。

为了进一步提高本发明的聚乙烯亚胺表面离子识别基团的功效，本发明的方法合成得到的颗粒为球型纳米颗粒，纳米颗粒表面的离子识别基团能够尽可能与溶液中离子直接接触，且表面能高，导致检测效率显著提高。

本发明的合成方法简单温和，克服了传统技术中普遍存在的合成难度大的技术难点。

本发明的另外一个优点在于：tcpp本身具有荧光效应，当pei表面修饰用于与特定的目标物特异性结合后发荧光的功能基团后，那么tcpp的荧光可作为内标，由于功能基团呈现另外一种荧光颜色，通过功能基团的荧光和内标荧光的比值，可以消除光漂白、探针负载和留存及设备因素(激发光稳定性)引起的数据失真，能有效地提高检测精度，尤其是细胞内检测。

附图说明

图1为本发明实施例1的透射电子显微镜照片；

图2为本发明实施例1的荧光激发和发射光谱图；

图3为本发明实施例1的不同浓度溶液t1信号强度图；

图4为本发明实施例1的不同浓度溶液与t1^-1值的相关曲线图；

图5为本发明实施例1的不同浓度溶液的细胞毒性测试；

图6为本发明实施例1的不同浓度溶液的溶血性测试；

图7为本发明的采用基于静电自组装的多功能纳米囊泡的自组装过程以及其两种不同的用途。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

为了更加清楚的对本发明进行说明，列举如下实施例来说明本发明的优越性。

实施例1

荧光(fl)/磁共振(mr)双模态成像指导下的光动力治疗(pdt)纳米囊泡(gd-pnps)的制备：

a、gd-tcpp的制备：在一个250ml的三颈烧瓶中加入6g咪唑、8mgtcpp和过量无水gdcl3(27mg)。在220℃的温度下和n2环境下搅拌反应2h，然后将产物溶解在10ml的甲醇中，在4℃冰箱中避光保存备用。在反应过程中，咪唑在瓶颈处逐渐重新结晶析出；

b、mpeg-pga的制备：γ-pga，mpeg-nh2，edc和nhs溶解在5ml磷酸盐缓冲液pbs(ph＝8.5)中，其中摩尔比为1:3.5:3.85:3.85，混合物在室温下搅拌24h。产物由去离子水透析纯化2天后然后冷冻干燥，放在干燥器中保存备用；

c、取上述合成的gd-tccp溶液0.3ml与5mlpei水溶液(0.5mg·ml^-1)混合，搅拌12h，然后加入1mlmpeg-pga(1mg·ml^-1)，将混合溶液搅拌1h。最后纯化用去离子水透析24h，得到纯化后的gd-pnps。

tcpp：中-四(4-羧基苯基)卟吩；edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；nhs:n-羟基丁二酰亚胺；mpeg-nh2:氨基修饰的聚乙二醇；γ-pga：聚谷氨酸；pei：聚乙烯亚胺。

edc、nhs一起活化羧基，促进pga上的羧基与mpeg-nh2上的氨基发生反应。

在加入反应过程中，gd³⁺可以通过配位键螯合在tcpp的四吡咯结构内，在自组装反应过程中，由于亲水性的pei中含有大量带正电荷的氨基，疏水性的gd-tcpp含有带负电的羧基，通过静电吸附以及亲疏水作用形成纳米囊泡；在现有技术中，有个别案例在有机溶剂中，将tcpp和pei进行基于酰胺化反应的组装，这种组装技术方案复杂，且对于接枝的功能基团影响较大。

在本实施例中，亲水性的pei组装在纳米囊泡的表面，疏水性的gd-tcpp组装在纳米囊泡内部。gd³⁺的存在可使得制备的纳米粒子具有磁共振纵向(t1)造影能力，同时tcpp可作为荧光成像分子以及pdt光敏剂，因此所制备的纳米囊泡具有荧光/磁共振双模态成像功能以及pdt效果，是一种诊疗一体化的多功能纳米囊泡。

透射电子显微镜结果

透射电子显微镜图像(图1)中可以看出实施例1所制备的gd-pnps粒径约为180nm，且颗粒大小均匀，分散良好。

荧光性能结果

在荧光激发和发射光谱图(图2)中可以观察到，其最大发射峰在660nm，较好的抗生物背景荧光干扰能力和组织穿透能力，使本发明具有应用于临床上荧光定位病灶部位引导手术和免疫荧光病理分析的潜力和前景。

弛豫率结果

不同浓度梯度gd-pnps溶液的t1图(图3，其中横坐标为gd³⁺浓度，纵坐标为弛豫时间的倒数)显示实施例1所制备的gd-pnps具有信号强度随浓度升高而增强的性质。通过不同浓度gd-pnps与t1^-1的相关曲线图(图4)可以得到其t1弛豫率为16.157mm^-1·s^-1。

下表1列出了实施例1所制备的gd-pnps与三种商业对比剂的弛豫率。

表1四种对比剂的弛豫率(单位：mm^-1·s^-1)

由上表的对比结果显示这种新型聚合物纳米颗粒的含钆对比剂弛豫率是三种商品化对比剂弛豫率的4倍，可以推断在达到相同造影信号的条件下该新型对比剂用量会降低至四分之一，对比剂用量减少可以降低对比剂肾病的发生率，因此此新型对比剂的研制具有实际应用价值。

生物相容性结果

不同浓度gd-pnps的细胞毒性测试(图5，其中横坐标为纳米囊泡浓度，纵坐标为细胞活度)中可以看出在浓度高达约400μg·ml^-1下细胞的存活率依旧在90％以上，因此可以断定其细胞毒性较低。与此同时，不同浓度gd-fpnps的溶血性测试(图6，其中横坐标为纳米囊泡浓度，纵坐标为细胞溶血率)中也可以看出，在浓度高达400μg·ml^-1的条件下，溶液中的血红细胞依旧没有明显的破坏，证明其溶血性较低，具有良好的血液相容性。

通过在纳米囊泡表面修饰生物相容性较好的聚乙二醇(peg)，显著降低了材料的生物毒性，提高其生物相容性。

本发明还通过中-四(4-羧基苯基)卟吩(tcpp)与gd³⁺的配位键将gd³⁺螯合在tcpp上，使其同时具备荧光成像以及磁共振成像功能。

具体来说，由于钆含有7个未配位电子，可以跟tcpp结构中的四吡咯环生成配位键连接在一起形成金属卟啉螯合物。tcpp除了是一种荧光成像探针，也是一种良好的光动力治疗的光敏剂，将钆与tcpp螯合在一起，可以使其功能增强，具有荧光/磁共振双模态成像能力。同时配位键的形式，也使得gd³⁺不易产生泄露。

本发明通过上述的改进，使得所制备的纳米囊泡不仅具有荧光/磁共振双模态成像能力，还具有光动力治疗效果。同时，纳米囊泡的形式，使得其具有良好的纳米材料性质。聚乙二醇的修饰，使得其生物相容性大大提高。综上所述，我们制备得到一种集荧光成像、磁共振成像、光动力治疗于一体的多功能纳米囊泡。

实施例2

荧光(fl)/正电子发射计算机断层扫描(petct)双模态成像指导下的光动力治疗(pdt)纳米囊泡(gd-pnps)的制备：

a.mpeg-pga的制备：γ-pga，mpeg-nh2，edc和nhs溶解在5ml磷酸盐缓冲液pbs(ph＝8.5)中，其中摩尔比为1:3.5:3.85:3.85，混合物在室温下搅拌24h。产物由去离子水透析纯化2天后然后冷冻干燥，放在干燥器中保存备用。

b.取tccp的甲醇溶液0.3ml(0.8mg·ml^-1)与5mlpei水溶液(0.5mg·ml^-1)混合，搅拌5h，然后依次加入一定量的⁶⁴cu²⁺溶液，1mlmpeg-pga(1mg·ml^-1)，将混合溶液搅拌1h。最后纯化用去离子水透析24h，得到纯化后的⁶⁴cu-pnps。

tcpp：中-四(4-羧基苯基)卟吩；edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；nhs:n-羟基丁二酰亚胺；mpeg-nh2:氨基修饰的聚乙二醇；γ-pga：聚谷氨酸；pei：聚乙烯亚胺。

在自组装反应过程中，由于亲水性的pei中含有大量带正电荷的氨基，疏水性的tcpp含有带负电的羧基，通过静电吸附以及亲疏水作用形成纳米囊泡，亲水性的pei组装在纳米囊泡的表面，疏水性的tcpp组装在纳米囊泡内部。另外，⁶⁴cu²⁺可以通过配位键螯合在tcpp的四吡咯结构内，⁶⁴cu²⁺的存在可使得制备的纳米粒子具有petct造影能力，同时tcpp可作为荧光成像分子以及pdt光敏剂，因此所制备的纳米囊泡具有荧光/正电子发射计算机断层扫描双模态成像功能以及pdt效果，是一种诊疗一体化的多功能纳米囊泡。

实施例3

荧光(fl)/磁共振(mr)双模态成像指导下的光动力治疗(pdt)纳米囊泡(mn-pnps)的制备：

a.mpeg-pga的制备：γ-pga，mpeg-nh2，edc和nhs溶解在5ml磷酸盐缓冲液pbs(ph＝8.5)中，其中摩尔比为1:3.5:3.85:3.85，混合物在室温下搅拌24h。产物由去离子水透析纯化2天后然后冷冻干燥，放在干燥器中保存备用；

b.取tccp的甲醇溶液0.3ml(0.8mg·ml^-1)与5mlpei水溶液(0.5mg·ml^-1)混合，搅拌24h，然后依次加入一定量的mn²⁺溶液，1mlmpeg-pga(1mg·ml^-1)，将混合溶液搅拌1h。最后纯化用去离子水透析24h，得到纯化后的mn-pnps。

tcpp：中-四(4-羧基苯基)卟吩；edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；nhs:n-羟基丁二酰亚胺；mpeg-nh2:氨基修饰的聚乙二醇；γ-pga：聚谷氨酸；pei：聚乙烯亚胺。

在自组装反应过程中，由于亲水性的pei中含有大量带正电荷的氨基，疏水性的tcpp含有带负电的羧基，通过静电吸附以及亲疏水作用形成纳米囊泡，亲水性的pei组装在纳米囊泡的表面，疏水性的tcpp组装在纳米囊泡内部。另外，mn²⁺可以通过配位键螯合在tcpp的四吡咯结构内，mn²⁺可作为磁共振横向成像造影剂，其存在可使得制备的纳米粒子具有mr造影能力，同时tcpp可作为荧光成像分子以及pdt光敏剂，因此所制备的纳米囊泡具有荧光/磁共振双模态成像功能以及pdt效果，是一种诊疗一体化的多功能纳米囊泡。

实施例4

锌离子(zn²⁺)/ph比率荧光检测纳米探针(q-pnps)的制备：

a.8-(2-氯乙酰胺)喹啉(q)的制备：先将2.88g8-氨基喹啉、3ml三乙胺、10ml二氯甲烷加入50ml三颈烧瓶中，再将烧瓶置于冰浴中，接着，缓慢滴加5.31ml氯乙酰氯和5ml二氯甲烷的混合液，反应2h。然后，使用碳酸氢钠调节溶液的ph至7。调节完ph后，用漏斗直接过滤，收集滤液，然后减压蒸发滤液，把所得的棕黑色固体用少量二氯甲烷溶解，接着使用柱层析法分离出8-(2-氯乙酰胺)喹啉溶液。最后，减压蒸发，即可获得8-(2-氯乙酰胺)喹啉的固体；

b.peiq的制备：将0.5gpei、0.2g8-(2-氯乙酰胺)喹啉、0.092gki、0.14gk2co3溶解在20ml乙腈中，并且在80℃油浴中加热回流过夜，从而得到peiq粗品，再通过减压蒸发溶剂，用乙醚共沉淀3次，最后用纯水透析纯化；

c.mpeg-pga的制备：γ-pga，mpeg-nh2，edc和nhs溶解在5ml磷酸盐缓冲液pbs(ph＝8.5)中，其中摩尔比为1:3.5:3.85:3.85，混合物在室温下搅拌24h。产物由去离子水透析纯化2天后然后冷冻干燥，放在干燥器中保存备用；

d.取tccp的甲醇溶液0.3ml(0.8mg·ml^-1)与5mlpeiq水溶液(0.8mg·ml^-1)混合，搅拌24h，然后加入1mlmpeg-pga(1mg·ml^-1)，将混合溶液搅拌1h。最后纯化用去离子水透析24h，得到纯化后的q-pnps。

tcpp：中-四(4-羧基苯基)卟吩；edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；nhs:n-羟基丁二酰亚胺；mpeg-nh2:氨基修饰的聚乙二醇；γ-pga：聚谷氨酸；pei：聚乙烯亚胺。

在自组装反应过程中，由于亲水性的peiq中含有大量带正电荷的氨基，疏水性的tcpp含有带负电的羧基，通过静电吸附以及亲疏水作用形成纳米囊泡，亲水性的peiq组装在纳米囊泡的表面，疏水性的tcpp组装在纳米囊泡内部。另外，q可以特异性与zn²⁺结合，其会产生绿色荧光，并且随着zn²⁺含量增加，其荧光强度增强，可作为zn²⁺检测探针，另外pei也可作为水质子检测探针，所制备的q-pnps对ph具有响应性能，可作为ph检测探针。因此所制备的纳米囊泡能检测zn²⁺和ph，是一个双元检测纳米探针。

此外，在本实施例中，tcpp本身显示红色荧光，而8-(2-氯乙酰胺)喹啉和zn²⁺特异性结合后会显示绿色荧光。在检测过程中，通过两种不同颜色的荧光比值，红色荧光可以作为内标，在tcpp浓度已知的情况下，可以将红色荧光设置为标准1，然后通过不同颜色荧光的强度比值，可以精准的计算得到zn²⁺的浓度，无需经过其他步骤进行校准和纠正，准确度高。

实施例5

铜离子(zn²⁺)/ph比率荧光检测纳米探针(r-pnps)的制备：

a.peir的制备：将0.5gpei、0.6g罗丹明6g(r)溶解在20ml乙醇中，并且在80℃油浴中加热回流过夜，从而得到peir粗品，通过纯水透析纯化；

b.mpeg-pga的制备：γ-pga，mpeg-nh2，edc和nhs溶解在5ml磷酸盐缓冲液pbs(ph＝8.5)中，其中摩尔比为1:3.5:3.85:3.85，混合物在室温下搅拌24h。产物由去离子水透析纯化2天后然后冷冻干燥，放在干燥器中保存备用；

c.取tccp的甲醇溶液0.3ml(0.8mg·ml-1)与5mlpeir水溶液(0.8mg·ml-1)混合，搅拌16h，然后加入1mlmpeg-pga(1mg·ml-1)，将混合溶液搅拌1h。最后纯化用去离子水透析24h，得到纯化后的r-pnps。

tcpp：中-四(4-羧基苯基)卟吩；edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；nhs:n-羟基丁二酰亚胺；mpeg-nh2:氨基修饰的聚乙二醇；γ-pga：聚谷氨酸；pei：聚乙烯亚胺。

在自组装反应过程中，由于亲水性的peir中含有大量带正电荷的氨基，疏水性的tcpp含有带负电的羧基，通过静电吸附以及亲疏水作用形成纳米囊泡，亲水性的peir组装在纳米囊泡的表面，疏水性的tcpp组装在纳米囊泡内部。另外，r可以特异性与cu²⁺结合，其会产生蓝色荧光，并且随着cu²⁺含量增加，其荧光强度增强，可作为cu²⁺检测探针，另外pei也可作为水质子检测探针，所制备的r-pnps对ph具有响应性能，可作为ph检测探针。因此所制备的纳米囊泡能检测cu²⁺和ph，是一个双元检测纳米探针。

图7示出了采用基于静电自组装的多功能纳米囊泡的自组装过程以及其两种不同的用途。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。