兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法，属于免疫
技术领域：
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背景技术：
兔病毒性出血症(rabbithemorrhagicdiease，rhd)是由兔出血症病毒(rabbithemorrhagicdiseaseviurs，rhdv)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，俗称“兔瘟”。本病常呈暴发性流行，发病率和病死率极高，死亡率高达90％左右。兔多杀性巴氏杆菌病(pasteurellosis)又称兔出血性败血症(hemorrhagicsepticaemia，hs)是由兔多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida，pm)引起的一种急性、败血性传染病。该病可以分为鼻炎型、肺炎型、中耳炎型等多种病型，各种病型病变不一致，但往往有两种及两种以上病型联合发生。我国分别将兔出血症病毒和巴氏杆菌列为二类病原微生物和三类病原微生物。兔出血症和多杀性巴氏杆菌病是严重危害家兔健康养殖的主要疫病，当前的防控措施主要是疫苗免疫。国内虽然已有“兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗”，其抗原成分是兔出血症组织毒和多杀性巴氏杆菌。但是该疫苗存在有重大缺陷，主要表现在用于制备兔出血症病毒的动物个体差异较大，不利于疫苗抗原的规模化生产，质量控制难以进行，最重要的是疫苗制备过程容易造成强毒扩散，生物安全性差。另外，多杀性巴氏杆菌制备工艺不够稳定，批次间抗原免疫原性差异较大，效力检验中攻毒保护率较低。以上缺陷严重地影响了疫苗质量，制约了企业生产效率。当前细胞规模化悬浮培养和细菌高密度发酵培养可以实现疫苗的规模化生产，有利于疫苗质量控制、降低成本、简化生产工艺。本申请以国家一类新兽药“兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗(bac-vp60株)”为基础，通过技术改进，提升疫苗抗原生产工艺，增强原有疫苗免疫效力，研制兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，突破传统疫苗的技术瓶颈，不仅有利于疫苗的生产和质量稳定，也将加快疫苗的更新换代。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法，该方法更加容易规模化生产，质量可控、制备工艺稳定、生物安全性好。该疫苗相对于现有疫苗在安全性、免疫攻毒保护率、免疫期和保存期等方面都有了实质性的提高。为解决上述技术问题，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原成分为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒和多杀性巴氏杆菌。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原成分为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒载体细胞培养物和多杀性巴氏杆菌。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原成分为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒载体全悬浮培养细胞培养物和多杀性巴氏杆菌。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原成分为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒载体细胞培养物和多杀性巴氏杆菌发酵菌液。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原成分为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒载体全悬浮培养细胞培养物和多杀性巴氏杆菌发酵菌液。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二联疫苗是由重组兔出血症病毒vp60杆状病毒细胞培养物和多杀性巴氏杆菌发酵菌液灭活后制备获得。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述重组兔出血症病毒vp60杆状病毒细胞培养物在病变细胞达约85％以上时收获。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述多杀性巴氏杆菌发酵菌液采用多杀性巴氏杆菌c51-17株冻干菌为菌种。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述多杀性巴氏杆菌发酵菌液采用固体培养后的多杀性巴氏杆菌c51-17株冻干菌为一级种子。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述一级种子于2～8℃保存，使用期不超过7日。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述多杀性巴氏杆菌发酵菌液采用固体培养和液体培养后的多杀性巴氏杆菌c51-17株冻干菌为二级种子。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述二级种子于2～8℃保存，使用期不超过4日。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，对所述二级种子进行了纯粹检验。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述多杀性巴氏杆菌发酵菌液为通气培养的发酵菌液。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述多杀性巴氏杆菌发酵菌液在发酵培养后进行了纯粹检验。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，抗原按每毫升疫苗中含灭活前的vp60蛋白血凝效价不低于1:256进行配苗。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，抗原按每毫升疫苗中含灭活前多杀性巴氏杆菌菌数不低于7.5×109cfu标准进行配苗。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，抗原按每毫升疫苗中含灭活前的vp60蛋白血凝效价不低于1:256，多杀性巴氏杆菌菌数不低于7.5×109cfu标准进行配苗。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液置2～8℃保存，不超过6个月。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，所述多杀性巴氏杆菌灭活液置2～8℃保存，不超过6个月。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，在配苗前已对兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液进行了灭活检验。进一步地，本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗，在配苗前已对多杀性巴氏杆菌灭活液进行了灭活检验。优选的，所述兔出血症病毒杆状病毒载体为重组兔出血症病毒vp60杆状病毒bac-vp60株，于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccv201833；多杀性巴氏杆菌为c51-17株（pasteurellamultocidac51-17），于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为：cctccm2018401。优选的，所述二联灭活疫苗含有佐剂。优选的，所述佐剂为氢氧化铝胶，抗原与氢氧化铝胶的比例为9:1。本发明提供一种兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液的制备：将重组兔出血症病毒vp60杆状病毒接种细胞进行培养，对收获的细胞培养物进行灭活处理；(2)多杀性巴氏杆菌灭活液的制备：对多杀性巴氏杆菌进行发酵罐通气培养，对发酵菌液进行灭活处理；(3)兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的配制：抗原含量按每毫升疫苗中含灭活前的vp60蛋白血凝效价不低于1:256，多杀性巴氏杆菌菌数不低于7.5×109cfu标准进行配苗，加入佐剂并充分混匀。进一步地，对所述重组兔出血症病毒vp60杆状病毒进行悬浮培养。进一步地，上述二联疫苗制备方法步骤(1)中接种细胞为sf9细胞，所用培养基为昆虫细胞培养基，重组兔出血症病毒vp60杆状病毒接种量为培养基总量的1％，培养条件为温度27～28℃、ph值为6.0～6.2、溶氧(do)50％～60％、搅拌转速50～70r/min；当病变细胞达85％以上即可收获细胞培养物。进一步地，所述sf9细胞培养时的转速与其接种重组兔出血症病毒vp60杆状病毒后的培养速度相同或不同。进一步地，在sf9细胞达到2×106个/ml左右时接种重组兔出血症病毒vp60杆状病毒。进一步地，当病变细胞达90％以上时收获细胞培养物。进一步地，当病变细胞达95％以上时收获细胞培养物。进一步地，所述步骤(1)获得兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物之后，需进行血凝效价测定，细胞培养物对1％人“o”型红细胞凝集效价应不低于1:512。进一步地，所述步骤(1)中，使用甲醛对收获的细胞培养物进行灭活处理；并对灭活后的兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液进行灭活检验：灭活液接种细胞后无细胞病变，红细胞凝集测定无血凝性。进一步地，所述步骤(1)中，使用终浓度为0.2％的甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理。进一步地，所述步骤(1)中，使用甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理时进行搅拌。进一步地，所述步骤(1)中，使用甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理时的搅拌速度与重组兔出血症病毒vp60杆状病毒培养时的搅拌速度相同或不同。进一步地，所述步骤(1)中，使用甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理时的培养温度与重组兔出血症病毒vp60杆状病毒培养时的培养温度不同。进一步地，所述步骤(1)中，使用甲醛溶液对收获的细胞培养物进行灭活处理时的培养温度高于重组兔出血症病毒vp60杆状病毒培养时的培养温度。进一步地，所述步骤(1)中，灭活检验针对灭活的重组兔出血症病毒vp60杆状病毒载体细胞培养物进行。进一步地，所述步骤(1)中，灭活检验时细胞培养物的培养温度与重组兔出血症病毒vp60杆状病毒培养时的培养温度相同。进一步地，所述步骤(2)中，对多杀性巴氏杆菌进行发酵罐通气培养，具体步骤为：将多杀性巴氏杆菌单菌落接种于含有血清和裂解全血的马丁琼脂斜面，培养获得多杀性巴氏杆菌一级种子；将一级种子接种于含有血清的马丁肉汤，培养获得二级多杀性巴氏杆菌种子；按发酵罐容积装入60％～70％发酵培养基及0.01％～0.02％消泡剂，对培养基进行灭菌处理，按培养基量的5％～10％接种二级种子，同时加入血清，搅拌转速200～300r/min，ph值7.2～7.6，通气培养，收获培养菌液；每ml培养菌液含活菌数应不低于1.2×1010cfu。进一步地，所述步骤(2)中，对多杀性巴氏杆菌c51-17株冻干菌进行发酵罐通气培养。进一步地，所述步骤(2)中，所述一级种子于2～8℃保存，使用期不超过7日。进一步地，所述步骤(2)中，所述二级种子于2～8℃保存，使用期不超过4日。进一步地，所述步骤(2)中，对所述二级种子进行纯粹检验。进一步地，步骤(2)中采用甲醛对收获的培养菌液进行灭活处理，并进行灭活检验，灭活后取样接种含4％血清和0.1％裂解全血的马丁琼脂和多杀性巴氏杆菌发酵培养基进行培养，应无菌生长。进一步地，所述步骤(2)中采用0.4％甲醛对收获的培养菌液进行灭活处理。进一步地，所述步骤(2)中采用甲醛对收获的培养菌液进行灭活处理时的培养温度与多杀性巴氏杆菌发酵培养时的培养温度相同。进一步地，所述步骤(2)中采用甲醛对收获的培养菌液进行灭活处理时的搅拌速度与多杀性巴氏杆菌发酵培养时的搅拌速度不同。进一步地，所述步骤(2)中采用甲醛对收获的培养菌液进行灭活处理时的搅拌速度低于多杀性巴氏杆菌发酵培养时的搅拌速度。进一步地，所述步骤(3)中采用铝胶为佐剂。进一步地，所述步骤(3)中兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液和多杀性巴氏杆菌灭活液充分混匀后加入佐剂。进一步地，所述步骤(3)中兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液和多杀性巴氏杆菌灭活液充分混匀时10～30r/min搅拌。进一步地，所述步骤(3)中兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液和多杀性巴氏杆菌灭活液充分混匀后，加入佐剂继续混匀。进一步地，所述步骤(3)中兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液和多杀性巴氏杆菌灭活液充分混匀后加入佐剂，30～50r/min搅拌。本发明的有益效果是，与现有技术相比，兔出血症病毒抗原生产采用全悬浮细胞培养技术，生产过程不使用强毒，制备的抗原血凝效价高、免疫原性好、生产工艺先进，可在gmp车间大规模生产；多杀性巴氏杆菌抗原发酵培养工艺更加成熟，不同批次之间制备的抗原免疫原性更加稳定，攻毒效力检验保护率比现有技术制备的同类疫苗有进一步提高。兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗制备程序更加简单，易于大规模生产和产品质量控制，生物安全性良好，产品质量更优，生产成本进一步降低。按照此方法制备的疫苗安全性更好，免疫攻毒保护率更高，免疫期和保存期也优于现有技术制备的同类疫苗。附图说明图1为根据本发明实施方式的兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗制备方法的流程图。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本发明，发明人提供了如下实施例，但下述实施例并不用于限制本发明，本发明中所描述的特征、步骤可以进行任意的组合，并可以以不同的顺序执行，而不限于下列描述的那些。毒种和菌种的来源：重组兔出血症病毒vp60杆状病毒(bac-vp60株)，以下简称重组杆状病毒，已于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccv201833；多杀性巴氏杆菌为c51-17株，于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为：cctccm2018401。实施例1重组兔出血症病毒vp60蛋白抗原细胞培养罐悬浮培养方法将悬浮培养的sf9细胞，27～28℃，以90～120r/min培养24～48小时，连续传代扩增，传代比例为1:2～1:4，接种细胞培养罐，首先达到该培养罐的最低培养容量，之后继续培养并添加昆虫细胞培养基，在用细胞培养罐培养细胞过程中，控制细胞培养罐各参数在正常范围：温度27～28℃、ph值为6.0～6.2、溶氧(do)50％～60％、搅拌转速50～70r/min。待细胞培养罐中细胞达到一定密度(约为2×106个/ml)，按1％比例接种重组杆状病毒进行病毒维持培养，控制温度、ph值、do、搅拌转速等参数在合适范围。接毒后4～5日，当病变细胞达约85％以上，即可收获细胞培养物。经过上述多次培养实验，对培养产物进行1％人“o”型红细胞凝集效价测试，培养产物血凝效价结果如表1所示，细胞培养产物血凝效价(ha)均不低于1:1024。表1重组兔出血症病毒vp60杆状病毒细胞培养罐培养产物血凝效价(ha)结果培养基体积(升)收毒时间(日)ha(log2)5510551164106511404104051150511实施例2兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液的制备向上述制备的重组兔出血症病毒vp60杆状病毒细胞培养物中加入终浓度为0.2％的甲醛溶液，混匀，换罐后置37℃灭活18～24小时，搅拌转速50～70r/min；或换瓶后置37℃灭活24小时，期间每2～3小时振摇一次，每次3分钟，获得兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液，灭活液置2～8℃保存，应不超过6个月。灭活检验时，取兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液，按总量的1％接种生长良好的sf9细胞，置27～28℃培养，连续观察5日，无细胞病变，收获细胞培养物，置-20℃以下反复冻融3次，盲传一代，接种生长良好的sf9细胞，培养5日，细胞无病变，细胞液无血凝性。实施例3多杀性巴氏杆菌发酵培养方法3多杀性巴氏杆菌发酵液的制备3.1一级种子繁殖与鉴定用灭菌生理盐水将多杀性巴氏杆菌c51-17株冻干菌做适当稀释，然后划线接种于含4％血清和0.1％裂解全血的马丁琼脂平板，置37℃培养18～22小时，选取至少5个典型菌落，分别接种于含4％左右血清和0.1％左右裂解全血的马丁琼脂斜面若干支，置37℃培养18～22小时，作为一级种子。于2～8℃保存，使用期不超过7日。3.2二级种子繁殖与鉴定取一级种子接种于含0.5％血清的马丁肉汤，置37℃，200r/min，振荡培养14～18小时，取样进行纯粹检验，合格后作为二级种子，于2～8℃保存，使用期不超过4日。3.3菌液培养采用发酵罐进行通气培养，按发酵罐容积装入30％～70％发酵培养基及0.01％～0.02％消泡剂，培养基蒸汽高压灭菌后，待温度降至37℃左右时，按培养基量的5％～10％接种二级种子液，同时按培养基量的0.5％加入血清，通气量稳定在15lpm，搅拌转速200～300r/min，ph值7.2～7.6，溶氧(do)最低为0，37℃通气培养10小时左右，收获培养菌液。进行纯粹检验，同时进行活菌计数，每ml培养菌液含活菌数应不低于1.2×1010cfu。不同接种剂量和发酵时间细菌计数结果如表2所示，约10小时活菌数最多，均可达到1.2×1010cfu/ml以上。表2不同接种剂量发酵细菌计数结果实施例4多杀性巴氏杆菌灭活液的制备按多杀性巴氏杆菌液总量的0.4％加入甲醛溶液，混匀，换罐后置37℃灭活30～36小时，搅拌转速50～70r/min，制得多杀性巴氏杆菌液灭活液。灭活液置2～8℃保存，应不超过6个月。灭活检验：灭活后取样接种含4％左右血清和0.1％左右裂解全血的马丁琼脂和多杀性巴氏杆菌发酵培养基，37℃培养24小时，应无菌生长。实施例5二联疫苗抗原配比计算及配制根据实际生产的细胞培养物(vp60蛋白)血凝效价和巴氏杆菌菌液细菌含量，按每ml疫苗中含灭活前的vp60蛋白血凝效价为1:256，含兔多杀性巴氏杆菌c51-17株菌数为7.5×109cfu标准进行疫苗各组分配比计算。然后将检验合格的兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液和多杀性巴氏杆菌灭活液按上述配比混合，低速(10～30r/min)搅拌10～20分钟，再按抗原与铝胶9:1的比例加入氢氧化铝胶佐剂，30～50r/min搅拌10～20分钟，充分混匀，获得兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗。定量分装，加塞密封，贴签。表3所示为检验合格的兔出血症病毒杆状病毒载体细胞培养物灭活液与检验合格的多杀性巴氏杆菌灭活液进行不同配比的疫苗配制，获得的4批次兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗。表3疫苗各组分配比及疫苗配制(每毫升)实施例6兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的无菌检验对上述4批次的灭活疫苗进行随机抽样并注意代表性，每批按瓶数的百分之一抽样，但不少于5瓶，最多不超过10瓶，每瓶分别进行检验。将待检疫苗摇匀后不做处理，直接取1.0ml接种50ml硫乙醇酸盐培养基(tg)，置35～37℃培养，3日后吸取培养物，接种tg小管2支，每支0.2ml，1支置35～37℃培养，1支置23～25℃培养，另取0.2ml，接种1支胰酪大豆胨液体培养基(tsb)小管，置23～25℃培养，均培养7日。每批抽检的样品均无菌生长。实施例7兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的安全性检验将上述疫苗充分摇匀，取35～42日龄健康家兔5只作为试验组，选择家兔颈部皮肤疏松的部位，以75％酒精棉球对注射部位进行消毒，各注射疫苗2.0ml。同时以相同条件家兔5只作为对照，不接种疫苗，连续观察14日，记录两组的精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等。结果显示，所有试验兔均健活，精神状态、饮食、粪便，注射部位吸收良好，无肿块，说明疫苗安全性良好。实施例8兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的效力检验8.1将上述制备的兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗充分摇匀，取2～3月龄健康易感家兔(兔出血症病毒抗体hi效价不高于1:2，体重1.75～2.0kg)12只，各注射疫苗1.0ml，同时设立对照组家兔12只。8.2兔出血症病毒部分攻毒免疫14日后，取免疫兔6只，连同对照家兔6只，各颈部皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒(病毒含量104ld50/ml)1.0ml，连续观察7日。8.3多杀性巴氏杆菌毒力测定挑取复苏后的菌种的单个典型菌落接种于含马丁肉汤，37℃，培养12～16小时，取细菌培养物1.0ml用灭菌生理盐水10倍系列稀释进行细菌计数。24小时后，根据计数结果，将菌液用灭菌生理盐水进行稀释，分别使每毫升稀释液中约含菌数为4、6、8、10个，每个剂量颈部皮下注射试验兔6只，1.0ml/只。在接种试验兔的同时对攻毒用菌液进行细菌计数，计数结果为实际攻毒菌数。连续观察7日，并记录试验兔死亡数量。8.4攻毒菌准备根据毒力测定结果，挑取复苏后的菌种的单个典型菌落接种于马丁肉汤，37℃，培养12～16小时，取细菌培养物1.0ml用灭菌生理盐水10倍系列稀释进行细菌计数。24小时后，根据计数结果，将菌液用灭菌生理盐水进行稀释，调整多杀性巴氏杆菌c51-17株为一个最小致死量(mld)。在接种试验兔的同时对攻毒用菌液进行细菌计数，计数结果为实际攻毒菌数。8.5多杀性巴氏杆菌部分攻毒免疫21日后，取免疫兔6只，连同对照家兔6只，各颈部皮下注射一个最小致死剂量的多杀性巴氏杆菌c51-17株强毒菌液1.0ml(细菌含量5～10cfu/ml)，连续观察7日。8.6结果兔出血症病毒部分：对照兔全部死亡，免疫兔全部健活；多杀性巴氏杆菌部分：对照兔全部死亡，免疫兔至少5只健活。实施例9兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的最小免疫剂量9.1将上述制备的兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗充分摇匀，分别以1.0ml、0.5ml、0.25ml、0.125ml颈部皮下注射2～3月龄健康易感家兔(兔出血症病毒抗体hi效价不高于1∶2，体重1.75～2.0kg)；同时设立对照组家兔。9.2兔出血症病毒攻毒检验免疫后14日，分别取每批次疫苗不同剂量免疫兔各6只，连同相同条件对照兔6只，分别颈部皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒(病毒含量104ld50/ml)1.0ml，连续观察7日。结果显示，3批疫苗免疫剂量为0.25ml/只及以上免疫兔，以兔出血症病毒进行攻毒，免疫兔均全部健活，0.125ml/只的免疫兔，至少4/6健活，对照兔全部死亡，死亡兔出现兔病毒性出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液做人“o”型红细胞凝集试验，均为阳性(表4)。表4不同剂量二联灭活疫苗兔出血症病毒皖阜株肝毒攻毒保护试验结果9.3兔多杀性巴氏杆菌攻毒检验免疫后21日，分别取每批次疫苗不同剂量免疫兔各6只，连同相同条件对照兔6只，分别颈部皮下注射一个最小致死量(mld)的多杀性巴氏杆菌c51-17株强毒菌液1.0ml，连续观察7日。结果显示，3批疫苗免疫剂量为1.0ml/只及0.5ml/只的免疫兔以兔多杀性巴氏杆菌进行攻毒，免疫兔至少5/6健活，免疫0.25ml/只及0.125ml/只的免疫兔至少2/6健活，对照兔全部死亡，死亡兔出现兔多杀性巴氏杆菌病典型的病理变化，对死亡兔肝脏细菌进行分离鉴定，均为兔多杀性巴氏杆菌(表5)。表5不同剂量二联灭活疫苗兔多杀性巴氏杆菌c51-17株攻毒保护试验结果9.4结论兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗最小免疫剂量测定结果表明，当疫苗免疫为0.25ml/只及以上剂量时，即可保护免疫兔抵抗兔出血症病毒强毒攻击；当疫苗免疫为0.5ml/只及以上剂量时，至少保护5只免疫兔抵抗兔多杀性巴氏杆菌c51-17株攻击，说明0.5ml/只(含灭活前vp60蛋白的血凝效价为1∶128，多杀性巴氏杆菌菌数为3.75×109cfu)是该灭活疫苗最小免疫剂量。由于疫苗在保存期内可能有抗原损失(效价降低)及保证疫苗在较长免疫期内可以有效预防兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病，在实际应用中将兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗(bac-vp60株+c51-17株)的免疫剂量定为1.0ml/只(含灭活前vp60蛋白的血凝效价为1:256，多杀性巴氏杆菌菌数为7.5×109cfu)。实施例10兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的免疫期10.1疫苗免疫将3批次兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗(批号：201501、201502、201503)和1批次市售兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗(批号：2015004)，分别免疫35～42日龄健康家兔，颈部皮下注射，1.0ml/只；同时设立对照组家兔。10.2攻毒及观察10.2.1兔出血症病毒攻毒检验免疫后第3、4、5、6、7个月，分别取每批疫苗免疫兔6只，连同相同条件对照兔6只，分别颈部皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒(病毒含量104ld50/ml)1.0ml，连续观察7日，记录死亡与保护的动物数量，对死亡兔进行剖检观察并取肝脏进行人“o”型红细胞凝集试验。结果显示，3批疫苗免疫后免疫兔以兔出血症病毒进行攻毒，免疫兔均全部健活，同类产品免疫兔在免疫后7个月死亡1只，对照兔全部死亡(表6)，死亡兔出现兔病毒性出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液做人“o”型红细胞凝集试验，均为阳性。表6疫苗免疫持续期试验结果(兔出血症病毒攻毒)10.2.2兔多杀性巴氏杆菌攻毒检验免疫后第3、4、5、6、7个月，分别取每批疫苗免疫兔6只，连同相同条件对照兔6只，分别颈部皮下注射一个最小致死量(mld)的多杀性巴氏杆菌c51-17株强毒菌液1.0ml，连续观察7日，记录死亡与保护的动物数量，对死亡兔进行剖检观察并进行细菌分离鉴定。结果显示，以兔多杀性巴氏杆菌c51-17株攻毒时，免疫后第3、4、5、6个月攻毒的免疫兔至少5/6健活，免疫后第7个月攻毒的免疫兔至少4/6健活，同类产品免疫兔在免疫期攻毒时均发生死亡，第7个月攻毒死亡4只，已经不能产生足够的保护，对照兔均6/6死亡，死亡兔出现兔多杀性巴氏杆菌病典型的病理变化，对死亡兔肝脏细菌进行分离鉴定，均为兔多杀性巴氏杆菌(表7)。表7疫苗免疫持续期试验结果(兔多杀性巴氏杆菌攻毒)10.2.3血清抗体效价测定家兔免疫前及免疫后第1、2、3、4、5、6、7个月，连同对照组家兔，分别采集血液，分离血清，测定兔出血症病毒hi抗体效价和兔多杀性巴氏杆菌抗体od450值。将第7个月攻毒家兔的第1～7个月所有血清的抗体检测结果进行统计分析。结果显示，免疫后1个月，家兔血清中兔出血症病毒平均hi抗体效价达到1:23.17，免疫后3个月，家兔血清中兔出血症病毒hi抗体效价达到高峰，此后逐渐下降，注射疫苗后7个月其血清中平均抗体水平仍维持在1:23以上，而对照组家兔血清抗体平均hi效价在1:20～1:20.33之间；免疫后1个月，家兔血清中兔多杀性巴氏杆菌抗体elisa检测od450值达到0.423，免疫后3个月，家兔血清中兔多杀性巴氏杆菌抗体elisa检测od450值达到高峰，此后逐渐下降，注射疫苗后6个月其血清中平均抗体elisa检测od450值仍在0.4以上，而对照组家兔血清抗体平均elisa检测od450值在0.140～0.159之间(表8、表9)。综上可知，兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗对兔病毒性出血症的免疫期可达7个月，对兔多杀性巴氏杆菌病的免疫期可达6个月。表8疫苗免疫期兔出血症病毒hi抗体效价结果表9疫苗免疫期兔多杀性巴氏杆菌抗体elisa检测结果实施例11二联疫苗的保存期对2～8℃保存的疫苗分别在3、6、9、12、15、18、21个月后进行安全检验和效力检验。结果显示，保存不同时间的3批次疫苗对35～42日龄健康家兔进行超剂量安全试验，对保存12个月以前的1批次同类产品进行超剂量安全试验，连续观察14日，所有家兔均健活。结果表明，3批次兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗保存21个月后安全性良好，同类产品保存12个月后安全性良好。用保存不同时间的3批次疫苗和1批次同类产品分别免疫健康易感家兔12只，免疫后14日，分别取免疫兔6只，连同相同条件对照兔6只，进行兔出血症病毒攻毒效力检验；免疫后21日，分别取免疫兔6只，连同相同条件对照兔6只，进行多杀性巴氏杆菌攻毒效力检验。结果显示，3批疫苗免疫后免疫兔以兔出血症病毒进行攻毒，免疫兔均全部健活(表10)，对照兔全部死亡；免疫兔以多杀性巴氏杆菌进行攻毒，免疫兔至少5/6健活，对照兔6/6死亡(表11)。结果说明兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗于2～8℃保存，保存期至少为18个月，市售兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗于2～8℃保存期为12个月。表10疫苗保存期效力检验结果(兔出血症病毒攻毒)-：未进行试验。表11疫苗保存期效力检验结果(兔多杀性巴氏杆菌攻毒)-：未进行试验。以上结果说明，兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的保存期已超过国内相应同类产品的水平。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12