经修饰的胸腺素β4在治疗脑缺血再灌注损伤方面的用途的制作方法

本发明涉及疾病治疗领域。具体而言，本发明涉及经修饰的胸腺素β4用于在受试者（例如，人）中治疗脑缺血再灌注损伤的用途，以及在制备用于在受试者（例如，人）中治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗脑缺血再灌注损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用所述经修饰的胸腺素β4的步骤。

背景技术

脑缺血是脑血管疾病最主要的病种，在我国其死亡率仅次于恶性肿瘤，严重危害人类的健康。脑缺血再灌注损伤是脑梗塞患者血管再通治疗后常见的并发症之一，是缺血性损伤之后的一种继发性损伤。脑缺血后再灌注会发生一系列病理生理变化，包括炎症损害、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、凋亡、细胞内钙超载、自由基损伤等，可导致血脑屏障破坏，使其通透性增加，形成血管源性脑水肿，并导致继发性脑损伤，是急性脑梗塞患者治疗后主要致残与至死原因。一旦发生，临床上目前没有令人满意治疗措施。因此，脑缺血再灌注损伤防治是亟待解决的问题之一，本领域迫切需要开发新的可用于治疗脑缺血再灌注损伤的方法。已有的研究和文献表明，在发生脑梗塞的模型动物进行血管再通治疗后，施用胸腺素β4能够显著减少模型动物脑部因缺血导致的梗死体积比率，显著提高模型动物治疗后的神经功能评分（胸腺素β4对局灶性大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用.解剖科学进展,2015,21:156~158,162；treatmentoftraumaticbraininjurywiththymosininrats.jneurosurg，2011，114:102–115）。

技术实现要素：

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现，在脑梗塞的动物模型进行血管再通治疗后，施用经修饰的胸腺素β4同样能够显著减少模型动物脑部因缺血导致的梗死体积比率，显著提高模型动物治疗后的神经功能评分。且经与天然结构的胸腺素β4对比研究后，出人意料的发现，本发明采用的经修饰的胸腺素β4有效剂量仅为天然结构有效剂量的千分之一，能显著降低用药剂量。基于这一发现，本发明人开发了新的治疗脑缺血再灌注损伤的方法，这一发现对于减少脑梗塞治疗后的脑组织死亡脑细胞数量，以及治疗后脑功能的恢复具有重大意义。

本发明所提到的经修饰的胸腺素β4是，在天然人胸腺素β4的n末端添加上丙氨酸或是甘氨酸且n末端未进行乙酰化的人胸腺素β4衍生物。该序列来自发明人的另外一篇授权专利zl200680025339.0，如seqidno:1或2所示的氨基酸序列。

因此，在一个方面，本发明提供了经修饰的胸腺素β4用于制备在受试者脑梗患者血管再通治疗后，引起的缺血再灌注损伤治疗药物的用途；其中所述经修饰的胸腺素β4具有如seqidno:1或2所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述脑梗塞患者进行血管再通治疗后立即施用。

在某些实施方案中，可调整给药方案以获得最佳目的反应。例如，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述脑梗塞患者进行血管再通治疗之后1-3天（例如第1天，第2天或第3天）开始施用。

在某些实施方案中，所述脑部组织的缺血再灌注损伤是脑梗患者血管再通治疗后，由于血液的从新流入缺血组织引起的脑细胞死亡且脑功能部分丧失。

在某些实施方案中，患者脑梗后进行脑血管溶栓、脑血管搭桥术、脑血管安装支架及其任意组合治疗。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些示例性实施方案中，所述受试者将要经历溶栓治疗。

在某些示例性实施方案中，所述受试者将要经历脑血管搭桥术治疗。

在某些示例性实施方案中，所述受试者将要经历脑血管安装支架治疗。

在某些实施方案中，所述药物包含有效量的所述经修饰的胸腺素β4。在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4可以以单位剂量形式存在于所述药物中，以便于施用。

在某些实施方案中，所述药物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂（例如注射液、冻干粉剂）等形式。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。

在某些示例性实施方案中，所述药物为注射剂（例如注射液或冻干粉剂）。例如，可通过下述方法来制备无菌注射液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的如本文所述的经修饰的胸腺素β4，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。

在某些实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些示例性实施方案中，所述药物包含无菌可注射液体（如水性或非水性悬浮液或溶液）。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。

在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部（如，粉剂、药膏或滴剂），或鼻腔途径。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。

在某些示例性实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4通过胃肠外途径施用（例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射或肌内注射）。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗脑缺血再灌注损伤的方法，其包括向有此需要的受试者施用经修饰的胸腺素β4；其中所述经修饰的胸腺素β4具有如seqidno:1或2所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述脑梗塞患者进行血管再通治疗后立即施用。

在某些实施方案中，可调整给药方案以获得最佳目的反应。例如，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述脑梗塞患者进行血管再通治疗之后1-3天（例如第1天，第2天或第3天）开始施用。

在某些实施方案中，所述脑部组织的缺血再灌注损伤是脑梗患者血管再通治疗后，由于血液的从新流入缺血组织引起的脑细胞死亡且脑功能部分丧失。

在某些实施方案中，患者脑梗后进行脑血管溶栓、脑血管搭桥术、脑血管安装支架及其任意组合治疗。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，可以将如本文所述的经修饰的胸腺素β4作为药物组合物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含预防有效量的所述经修饰的胸腺素β4。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂（例如注射液、冻干粉剂）等形式。在某些示例性实施方案中，所述药物组合物为注射剂（例如注射液或冻干粉剂）。

在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些示例性实施方案中，所述药物组合物包含无菌可注射液体（如水性或非水性悬浮液或溶液）。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。

在某些实施方案中，可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用所述经修饰的胸腺素β4，例如通过口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部（如，粉剂、药膏或滴剂），或鼻腔途径等途径向受试者施用如本文所述的经修饰的胸腺素β4。在某些示例性实施方案中，通过胃肠外途径（例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射或肌内注射）施用所述经修饰的胸腺素β4。

在另一个方面，本发明提供了一种经修饰的胸腺素β4，其用于在受试者中治疗脑的缺血再灌注损伤，其中所述经修饰的胸腺素β4具有如seqidno:1或2所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述脑梗塞患者进行血管再通治疗后立即施用。

在某些实施方案中，可调整给药方案以获得最佳目的反应。例如，所述经修饰的胸腺素β4用于在所述脑梗塞患者进行血管再通治疗之后1-3天（例如第1天，第2天或第3天）开始施用。

在某些实施方案中，所述脑部组织的缺血再灌注损伤是脑梗患者血管再通治疗后，由于血液的从新流入缺血组织引起的脑细胞死亡且脑功能部分丧失。

在某些实施方案中，患者脑梗后进行脑血管溶栓、脑血管搭桥术、脑血管安装支架及其任意组合治疗。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，可以将如本文所述的经修饰的胸腺素β4作为药物组合物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含预防有效量的所述经修饰的胸腺素β4。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如，所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂（例如注射液、冻干粉剂）等形式。在某些示例性实施方案中，所述药物组合物为注射剂（例如注射液或冻干粉剂）。

在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些示例性实施方案中，所述药物组合物包含无菌可注射液体（如水性或非水性悬浮液或溶液）。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。

在某些实施方案中，可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用所述经修饰的胸腺素β4，例如通过口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部（如，粉剂、药膏或滴剂），或鼻腔途径等途径向受试者施用如本文所述的经修饰的胸腺素β4。在某些示例性实施方案中，通过胃肠外途径（例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射或肌内注射）施用所述经修饰的胸腺素β4。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“脑缺血再灌注损伤”是指，脑梗患者血管再通治疗后，由于血液从新流入缺血组织引起的脑细胞死亡且部分脑功能丧失。一般而言，脑缺血再灌注损伤是脑梗塞血管再通治疗后常见的并发症之一，脑缺血后再灌注会发生一系列病理生理变化，包括炎症损害、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、凋亡、细胞内钙超载、自由基损伤等，可导致血脑屏障破坏，使其通透性增加，形成血管源性脑水肿，并导致继发性脑损伤，是脑梗塞患者血管再通治疗后主要致残与至死原因。

如本文中所使用的，术语“治疗”是指，一种疾病或病症或与正在治疗的疾病或病症相关的症状的严重程度的缓解或减轻。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995），并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂等。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝），弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂）等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂是无菌可注射液体（如水性或非水性悬浮液或溶液）。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液（例如0.9%(w/v)nacl）、葡萄糖溶液（例如5%葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01%聚山梨醇20）、ph缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）、ringer氏溶液及其任意组合。

如本文中所使用的，术语“有效剂量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的用药剂量。例如，“治疗疾病有效剂量”是指，能够有效治疗，阻止，或延迟疾病（例如缺血再灌注损伤）的发生而食欲的药物剂量。测定这样的有效剂量完全在本领域技术人员的能力范围之内。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物（例如，小鼠或大鼠）、非人灵长类动物（例如，猕猴或食蟹猴）或人。在某些实施方案中，所述受试者还未暴露于放射线。在某些实施方案中，所述受试者具有暴露于放射线的风险。

发明的有益效果

脑缺血是脑血管疾病最主要的病种，在我国其死亡率仅次于恶性肿瘤，严重危害人类的健康。脑缺血再灌注损伤是脑梗塞患者血管再通治疗后常见的并发症之一，是脑梗塞患者治疗后主要致残与至死原因。一旦发生，临床上目前没有令人满意治疗措施。本发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现，在脑梗塞患者进行血管再通治疗后，施用经修饰的胸腺素β4能够显著减少模型动物脑部因缺血导致梗死体积比率，显著提高模型动物治疗后的神经功能评分。且经与天然结构的胸腺素β4对比研究后，出人意料的发现，本发明采用的经修饰的胸腺素β4的有效剂量仅为天然结构治疗剂量的千分之一，能显著降低用药剂量，从而大大提高胸腺素β4的临床安全性，大大提高胸腺素β4的成药性以及大大降低临床使用价格。因而，本发明的经修饰的胸腺素β4可低剂量的用于治疗脑缺血再灌注损伤，这一发现对于脑梗患者血管再通治疗后提高生存率与生存质量具有重大意义。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

附图说明

图1为c-tβ4和rh-tβ4对脑缺血再灌注损伤大鼠神经缺损程度评分的影响。

图2为c-tβ4和rh-tβ4对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响。

实施例

本实施例通过sd大鼠脑缺血再灌注损伤模型来评价修饰后的重组人胸腺素β4对治疗脑缺血再灌注损伤的效果。

1.材料与方法

1.1药物

天然人胸腺素β4，由上海肽仕生物科技有限公司化学合成获得（以下简称为c-tβ4），临用时用生理盐水配制成所需浓度。修饰后的重组人胸腺素β4（以下简称为rh-gly-tβ4和rh-ala-tβ4），北京诺思兰德生物技术股份有限公司提供，rh-gly-tβ4的序列如seqidno:1所示；rh-ala-tβ4的序列如seqidno:2所示；规格：均为100μg/支。临用时用生理盐水配制成所需浓度。

1.2实验动物及分组

健康成年雄性sd大鼠（3~5个月龄，体重260~300g）由北京维通利华公司提供。120只随机分为假手术组（20只）、模型组（20只）、c-tβ410mg/kg剂量组（20只）、c-tβ410ug/kg剂量组（20只）、rh-gly-tβ410ug/kg剂量组（20只）、rh-ala-tβ410ug/kg剂量组（20只）。

1.3脑缺血再灌注损伤造模方法

（线栓法致大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的制作及思考.医学综述，2011,17:3359~3361）

除了假手术组以外，其他3个组均采用颈外动脉插入线栓法制作模型：所有大鼠称重后，用10%水合氯醛按照350mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，5min后，将大鼠腹面朝上固定于手术操作台上，颈部备皮，75%酒精消毒后，颈部正中切口长约3~4cm，小心地钝性分离肌肉组织，暴露右侧迷走神经、颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。将提前准备好的丝线分别在颈总动脉近心端、颈外动脉远端挂线、动脉夹夹住颈总动脉近心端与颈内动脉远心端。沿着颈外动脉结扎两线间将其剪断，在颈外动脉距颈总动脉分叉处之间，距离短端2mm左右剪一小口。将提前准备好线栓沿小切口插入约5mm后，将预先放置在颈外动脉根部的丝线打结将其固定，打结的松紧以不易颈内动脉反流出血又可以顺利推进线栓为宜，然后松开颈内动脉远心端的动脉夹，将线栓缓慢地向颈内动脉入颅方向推进大约18~19mm后再将固定丝线收紧再次打结，防止大鼠出血，缝合皮肤，此刻即完成右侧mcao模型，记录此刻时间，栓塞颈内动脉120min后，拔出线栓，恢复脑血流。

于动物清醒时参照longaez等的神经缺陷5级4分法对大鼠行为学进行评分（reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcranio-ectomyinrats.stroke,1989,20:84~91），0分(正常):无功能障碍;1分(轻度神经行为学缺陷):不能完全伸展左前肢;2分(中度神经行为学缺陷):向左侧旋转；3分(重度神经行为学缺陷)；向左侧倾倒；4分(极重度神经行为学缺陷):无自主活动伴意识抑制。评分1分及以上作为实验对象，0分剔除。

1.4给药方法

c-tβ4的给药剂量分别为10mg/kg和10μg/kg，rh-gly-tβ4的给药剂量为10ug/kg，rh-ala-tβ4的给药剂量为10ug/kg，在制备模型完成后立即给药，每天给药1次，共计注射10次，模型组给予等量生理盐水，给药方式均为腹腔注射。

1.5大鼠神经缺损程度评分

各组大鼠于造模后的第19天，进行大鼠神经缺损程度评分。

1.6大鼠的脑梗死体积检测

各组大鼠于造模后的第20天，深麻醉下，大鼠直接断头，取脑，置于-20℃冰箱中20min，用于ttc染色法测定脑梗死体积：脑组织从冰箱中取出后，间隔2mm连续切成5个冠状切片，用2%ttc缓冲液避光染色30min，梗死部分被染成白色。数码相机拍照后应用ipp6.1图像分析软件，计算脑梗死区域的面积再乘以2mm后相加即为梗死体积。

1.7大鼠神经缺损程度评分结果

表1.c-tβ4和rh-tβ4对脑缺血再灌注损伤大鼠神经缺损程度评分的影响

（注：与假手术组相比，“*”示p＜0.05，“**”示p＜0.01；与模型组相比，“^#”示p＜0.05，“^##”示p＜0.01）

1.8脑梗死面积结果

表2.c-tβ4和rh-tβ4对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响

（注：与假手术组相比，“*”示p＜0.05，“**”示p＜0.01；与模型组相比，“^#”示p＜0.05，“^##”示p＜0.01）

综上，模型组的神经缺损程度评分以及脑梗死体积与假手术组相比，有明显差异＜0.01），表明造模成功。c-tβ410mg/kg、rh-gly-tβ410ug/kg和rh-ala-tβ410ug/kg剂量组的神经缺损程度评分以及脑梗死体积与模型组相比均有明显降低（p＜0.01），而c-tβ410ug/kg治疗结果与模型组比较没有差异，表明c-tβ4组只有在1000倍剂量时才表现出与rh-gly-tβ4和rh-ala-tβ4组同等治疗效果。由此，rh-gly-tβ4和rh-ala-tβ4在对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗效果方面，出乎意料地优于c-tβ4。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>北京诺思兰德生物技术股份有限公司

<120>经修饰的胸腺素β4在治疗脑缺血再灌注损伤方面的用途

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>44

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

glyserasplysproaspmetalagluileglulyspheasplysser

151015

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202530

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3540

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