本发明涉及有效成分提取
技术领域：
，具体涉及一种蛹虫草提取液及其制备方法。
背景技术：
蛹虫草，又名北冬虫夏草、北虫草等，分类学上属于麦角菌科、虫草属，是一味传统中药，具有巨大的药用价值。蛹虫草中含有多种化学成分，具有多种药用功效，与冬虫夏草的药理功能和临床效果相似，但价格却低于冬虫夏草，因此蛹虫草逐渐成分冬虫夏草的替代品，具有极大的潜在市场。目前，对蛹虫草本身直接进行活性物质的提取方法包括水提法、水提醇沉法、醇提法等，但上述提取过程单一，存在提取效率低、提取过程对活性物质破坏严重的问题。因此，对蛹虫草的开发利用，多是以发酵方式或在发酵基础上进行活性物质的提取，然而，发酵的过程延长了提取时间、降低了提取的效率。因此，亟需开发一种新的蛹虫草活性物质的提取方法，以提高提取效率，减少提取过程对活性物质的破坏，并缩短提取时间。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种蛹虫草提取液及其制备方法。本发明的制备方法能够快速有效的提高提取蛹虫草中的活性成分，减少提取过程对活性物质的破坏。由本发明制备方法制备的蛹虫草提取液中，虫草素、虫草多糖和虫草腺苷的含量较高，具有显著的抗肿瘤活性和降尿酸的作用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种蛹虫草提取液的制备方法，包括以下步骤：将蛹虫草原料干燥至含水量为15-25％，然后进行真空低温膨化处理；将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：15-20混合，调节ph为4-6，然后依次进行超高压处理和超声提取；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物；将沉淀进行超临界提取，收集提取液作为第二中间产物；将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩，即得蛹虫草提取液。优选的，所述蛹虫草原料包括：蛹虫草、蛹虫草子实体、蛹虫草子实体菌块或蛹虫草菌丝体。优选的，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度50-60℃；抽放真空次数为3-5次，膨化时间为1-2小时。真空低温膨化是将样品置于压力罐中，通过加热和加压，使样品内部压力和外部压力平衡，然后突然减压放真空，使物料内部水分突然汽化、闪蒸，使样品细胞膨化，通过反复的抽、放真空处理可以使样品内部细胞组织间隙变增大，通透性变好，更易于和提取溶剂相接触，从而提高了有效成分的提取率。而且真空低温膨化的加工温度低、时间短，基本不会对破坏原料中的有效物质。本发明研究发现，在真空低温膨化处理过程中，含水量过低的蛹虫草缺乏柔性，在加压过程中易碎；而水分含量过高时会影响蛹虫草的膨化效果。经多次试验发现，蛹虫草原料含水量为15-25％时膨化效果较为理想。优选的，所述超高压处理的条件为：超高压处理压力400-600mpa，处理时间为100-200s。优选的，所述超声提取的条件为：温度40-60℃，时间10-20min，功率80-120w。优选的，所述超临界提取的条件为：超临界提取压力为25-30mpa、提取温度为25-30℃、提取时间为1-2h，以95％乙醇作为夹带剂。本发明的第二方面，提供上述方法制备的蛹虫草提取液。所述蛹虫草提取液中，虫草素的含量不低于2600mg/l，虫草多糖的含量不低于2800mg/l，虫草腺苷的含量不低于128mg/l。本发明的第三方面，提供上述蛹虫草提取液在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的第四方面，提供上述蛹虫草提取液在制备降低尿酸浓度、改善痛风病症的药物中的应用。本发明的有益效果：本发明的制备方法能够快速有效的提高提取蛹虫草中的活性成分，减少提取过程对活性物质的破坏。由本发明制备方法制备的蛹虫草提取液中，虫草素、虫草多糖和虫草腺苷的含量较高，具有显著的抗肿瘤活性和降尿酸的作用，可用于制备抗肿瘤药物以及制备降低尿酸浓度、改善痛风病症的药物。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
背景技术：
部分所介绍的，现有的蛹虫草活性物质的提取方法存在提取效率低、提取过程对活性物质破坏严重的问题。基于此，本发明的目的是提供一种提取效率高、提取过程基本无活性物质损失的蛹虫草提取液的制备方法，及其制备的蛹虫草提取液。在本发明的一种实施方案中，给出的蛹虫草提取液的制备方法，其具体步骤如下：(1)将蛹虫草原料干燥至含水量为15-25％，然后进行真空低温膨化处理，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度50-60℃；抽放真空次数为3-5次，膨化时间为1-2小时。(2)将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：15-20混合，调节ph为4-6，然后依次进行超高压处理和超声提取，超高压处理的条件为：超高压处理压力400-600mpa，处理时间为100-200s；超声提取的条件为：温度40-60℃，时间10-20min，功率80-120w；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀进行超临界提取，超临界提取压力为25-30mpa、提取温度为25-30℃、提取时间为1-2h，以95％乙醇作为夹带剂，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩，即得蛹虫草提取液。本发明的上述制备方法中，各步骤均是针对如何从蛹虫草中有效提取活性成分而设计的，各步骤相辅相成，具有显著的协同促进作用。其中：原料中的水分含量会对膨化率有影响，膨化率最初随含水量增加而增大，但当含水量达到一定值后，膨化率又会随含水量的增大而减小。因此，本发明在膨化处理前，对原料中的水分含量进行了优化控制，经多次试验发现，原料中的水分含量为15-25％，其膨化效果最优。通过对原料进行膨化处理，可以使得蛹虫草原料组织更加疏松，细胞间隙增大，通透性变好，更易于与浸提溶剂相接触；同时，为了避免传统的高温膨化处理对活性成分的影响，本发明采用的是真空低温膨化技术，其膨化温度低、膨化时间短，从而有效保留了原料中的活性成分。将膨化处理后的原料，再加入水作为溶剂进行提取，可以使溶剂与原料的细胞组织能够充分的接触，有利于虫草多糖成分的提取。调节ph为4-6，有利于虫草腺苷的提取。为了对原料中的活性成分进行充分的提取，本发明进一步的进行超高压处理、超声提取；其中，超高压处理可以在极高的静压下影响蛹虫草原料细胞的结构，还能破坏氢键等弱结合键，使基本物性变异，提高虫草多糖、虫草腺苷等活性物质的析出；超声波处理所产生的热效应、机械作用和空化效应可以使原料细胞壁快速破碎，促进提取溶剂进入细胞内与目标成分充分混合，加速胞内物质溶出、扩散和释放，有助于提取效率的提高。将处理后的固体原料再经超临界进行萃取，可以有效地将虫草素等活性物质析出。上述提取方法可以实现对蛹虫草原料的充分提取。综上，本发明的蛹虫草提取液的制备方法中，各步骤是一个有机的整体，改变或减少其中任一步骤，都会影响蛹虫草种活性物质的提取效果，导致活性成分提取率的降低。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例和对比例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例和对比例中所使用的蛹虫草子实体原料为同一产地、同一时间收获的蛹虫草，其有效成分的含量无显著差别。实施例1：(1)以蛹虫草子实体为原料，将1kg蛹虫草原料干燥至含水量为20％，然后进行真空低温膨化处理，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度55℃；抽放真空次数为4次，膨化时间为1.5小时。(2)将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：18混合，调节ph为5，然后依次进行超高压处理和超声提取，超高压处理的条件为：超高压处理压力500mpa，处理时间为150s；超声提取的条件为：温度50℃，时间15min，功率100w；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀进行超临界提取，超临界提取压力为28mpa、提取温度为28℃、提取时间为1.5h，以95％乙醇作为夹带剂，夹带剂用料为沉淀重量的5％，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩定容至15l，即得蛹虫草提取液。实施例2：(1)以蛹虫草子实体为原料，将1kg蛹虫草原料干燥至含水量为15％，然后进行真空低温膨化处理，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度50℃；抽放真空次数为5次，膨化时间为2小时。(2)将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：15混合，调节ph为4，然后依次进行超高压处理和超声提取，超高压处理的条件为：超高压处理压力400mpa，处理时间为200s；超声提取的条件为：温度40℃，时间20min，功率80w；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀进行超临界提取，超临界提取压力为25mpa、提取温度为30℃、提取时间为1h，以95％乙醇作为夹带剂，夹带剂用料为沉淀重量的5％，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩定容至15l，即得蛹虫草提取液。实施例3：(1)以蛹虫草子实体为原料，将1kg蛹虫草原料干燥至含水量为25％，然后进行真空低温膨化处理，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度60℃；抽放真空次数为3次，膨化时间为1小时。(2)将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：20混合，调节ph为6，然后依次进行超高压处理和超声提取，超高压处理的条件为：超高压处理压力600mpa，处理时间为100s；超声提取的条件为：温度60℃，时间10min，功率120w；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀进行超临界提取，超临界提取压力为30mpa、提取温度为25℃、提取时间为1h，以95％乙醇作为夹带剂，夹带剂用料为沉淀重量的5％，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩定容至15l，即得蛹虫草提取液。对比例1：(1)以蛹虫草子实体为原料，将1kg蛹虫草原料干燥至含水量为20％，然后与水以质量比1：18混合，依次进行超高压处理和超声提取，超高压处理的条件为：超高压处理压力500mpa，处理时间为150s；超声提取的条件为：温度50℃，时间15min，功率100w；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀与95％乙醇按质量比1：10混合后进行提取、提取温度为28℃、提取时间为1.5h，过滤，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩定容至15l，即得蛹虫草提取液。对比例2：(1)以蛹虫草子实体为原料，将1kg蛹虫草原料干燥至含水量为20％，然后进行真空低温膨化处理，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度55℃；抽放真空次数为4次，膨化时间为1.5小时。(2)将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：18混合，调节ph为5，然后进行超声提取，超声提取的条件为：温度50℃，时间15min，功率100w；经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀与95％乙醇按质量比1：10混合后进行提取、提取温度为28℃、提取时间为1.5h，过滤，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩定容至15l，即得蛹虫草提取液。对比例3：(1)以蛹虫草子实体为原料，将1kg蛹虫草原料干燥至含水量为20％，然后进行真空低温膨化处理，所述真空低温膨化处理的条件为：膨化温度55℃；抽放真空次数为4次，膨化时间为1.5小时。(2)将真空低温膨化处理后的原料与水以质量比1：18混合后进行提取、提取温度为28℃、提取时间为1.5h，经离心，得沉淀与液体，收集液体作为第一中间产物。(3)将沉淀进行超临界提取，超临界提取压力为28mpa、提取温度为28℃、提取时间为1.5h，以95％乙醇作为夹带剂，夹带剂用料为沉淀重量的5％，收集提取液作为第二中间产物。(4)将第一中间产物和第二中间产物混合，浓缩定容至15l，即得蛹虫草提取液。试验例1：采用高效液相色谱法检测实施例1-实施例3、对比例1-对比例3制备的蛹虫草提取液中虫草素和虫草腺苷的含量(色谱柱为watersnovpak-c18，检测波长为259nm，流动相为四氢呋喃-0.1％甲醇-磷酸盐缓冲液(1：2：97)。采用苯酚硫酸法测定实施例1-实施例3、对比例1-对比例3制备的蛹虫草提取液中虫草多糖含量，结果见表1。表1：本发明实施例和对比例蛹虫草提取液质量对比组别虫草素含量虫草腺苷含量虫草多糖含量实施例12704mg/l136mg/l2894mg/l实施例22612mg/l128mg/l2824mg/l实施例32605mg/l130mg/l2811mg/l对比例11142mg/l32mg/l1215mg/l对比例21328mg/l45mg/l1402mg/l对比例31250mg/l38mg/l1387mg/l由表1可以看出，采用本发明的提取方法可以显著提高蛹虫草中有效成分的提取率。另外经协同性分析可知，本发明提取方法中的各步骤具有协同促进作用。试验例2：采用mtt法检测本发明实施例和对比例制备的蛹虫草提取液的体外抑制细胞增殖活性。取人白血病k562细胞株、人肺癌a549细胞、人前列腺癌pc-3细胞株，均采用常规培养。实验时均用对数生长期细胞。取上述细胞的细胞悬液于倒置显微镜下计数细胞数目，加入培养基调整细胞数目至1×105/ml。取96孔细胞培养板进行细胞接种和药物实验，周边孔不用(充填无菌pbs)，设立空白对照组、阴性对照组、实验1组-实验4组，其中空白对照组只加入细胞培养液150μl/孔，阴性对照组接种细胞悬液100μl/孔并且加入细胞培养液50μl/孔，实验1组-实验4组接种细胞悬液100μl/孔并且分别加入实施例1、对比例1-3制备的蛹虫草提取液50μl/孔，加入完毕后，将96孔细胞培养板于37℃、5％co2和饱和湿度条件下培养48h，每孔加入10μl0.5％的mtt染色液，继续孵育4h后，2500rpm，离心30min，然后抛弃板孔中培养基，每孔加入100μl的dmso，在平板振荡器上振荡15min，使formazan结晶溶解完全。用酶标仪于波长570nm处测定各孔的od值，细胞生长抑制率按下面公式计算：结果见表2。表2：对肿瘤细胞的增殖抑制活性结果(ic50(μm))celllines实验1组实验2组实验3组实验4组k56213.48±1.76>20048.54±4.8562.16±5.23a54945.24±5.20>200102.28±8.51114.06±9.48pc-325.12±2.42>20075.74±6.8386.25±5.64试验例3：取70只雄性spf昆明小鼠(20±2g)，随机分为7组：正常对照组、高尿酸血症模型对照组、阳性对照组、试验1组、试验2组、试验3组和试验4组。除正常对照组腹腔注射和灌胃生理盐水外，其他组按照100mg/kg/d的剂量腹腔注射氧嗪酸钾盐，同时灌胃600mg/kg/d剂量的次黄嘌呤造模。造模前一个小时禁食不禁水，造模后1小时，阳性对照组灌胃5mg/kg/d剂量的别嘌呤醇，试验1组灌胃50mg/kg/d剂量的实施例1制备的蛹虫草水提液，试验2组灌胃50mg/kg/d剂量的对比例1制备的蛹虫草水提液，试验3组灌胃50mg/kg/d剂量的对比例2制备的蛹虫草水提液，试验4组灌胃50mg/kg/d剂量的对比例3制备的蛹虫草水提液，正常对照组和高尿酸血症模型对照组则灌胃相同体积的生理盐水，连续7天。第7天灌胃给药1小时后，麻醉摘眼球取血，使用离心机在3500r/min速度下离心10min分离得到血清，检测血清中尿酸浓度，结果见表3。表3：血清中尿酸浓度测定结果组别血清尿酸浓度(μmol/l)正常对照组105模型对照组256阳性对照组94试验1组98试验2组194试验3组168试验4组182由表3可以看出，与对比例1-3制备的蛹虫草提取液相比，本发明实施例1制备的蛹虫草提取液具有非常好的降尿酸效果，其降尿酸效果可以使高尿酸模型组血液尿酸浓度降低到正常小鼠尿酸水平。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12