替普瑞酮及其衍生物作为制备预防和治疗卵巢癌药物的应用的制作方法

本发明涉及替普瑞酮及其衍生物作为制备预防和治疗卵巢癌药物的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

卵巢癌是妇科肿瘤中恶性程度较高的疾病之一。据统计，2012年，全球卵巢癌新确诊患者为239000例，死于卵巢癌的患者为152000例(pratj.，franceschis.cancersofthefemalereproductiveorgans[m]//stewartbw，wildcp.worldcancerreport2014.lyon：internationalagencyforresearchoncancer，2014：467)。卵巢癌临床症状隐匿，缺乏有效的筛查手段，约75％的患者确诊时已属中晚期，晚期卵巢癌的治疗包括外科手术及以铂类和紫杉醇类药物为基础的术后辅助化疗。尽管大部分卵巢癌患者手术和一线化疗后获得临床缓解，但由于疾病复发或者耐药，晚期卵巢癌的总生存期(os)仍处在较低水平[jelovacd.，armstrongdk.cacancerj.clin.2011，61(3)：183-203.]。传统的化疗药物具有特异性低、不良反应多等缺点，而新的化疗药物对这些患者的效果并不满意，因此寻找更有效的预防和治疗卵巢癌的方法迫在眉睫。

替普瑞酮[geranylgeranylacetone(gga)，eisai股份有限公司产品]，即6，10，14，18-四甲基-5，9，13，17-十九烷四烯-2-酮的全反式和单顺式异构体的混合物(重量比为3∶2)，是一种非环状的类异戊二烯化合物，它具有类视色素的骨架，现已被广泛地应用于消化道溃疡的治疗中。据报道，替普瑞酮能够保护各种器官的细胞，如眼睛、脑、心脏(见ishiiy.，etal.invest.ophthalmol.vis.sci.2003，44：1982-92；tanitom.，etal.j.neurosci.2005，25：2396-404；fujikim.，etal.，j.neurotrauma.2006，23：1164-78；yasudah.，etal.，brainres.2005，1032：176-82；ooiet.，etal.，circulation2001，104：1837-43；andsuzukis.，etal.，kidneyint.2005，67：2210-20)。也有报道(日本专利jp-8-133967)将替普瑞酮作为干眼症、眼睛疲劳或眼睛干涩之预防或治疗剂的有效成分。日本专利jp-2000-319170公开了一种含有替普瑞酮、磷脂质、合成表面活性剂和水的澄清的滴眼剂。还有一种已知的由eisai股份有限公司生产的治疗视网膜疾病的药物，是以未知混合比例的顺式-反式替普瑞酮为活性成份。

研究发现gga可以诱导热休克蛋白70(heatshockprotein70，hsp70)和硫氧还蛋白(thioredoxin，trx)的表达(tsurumat.，etal.transplantproc.1999，31(1-2)：572-573；hirotak.，etal.biochem.biophys.res.commun2000，275：825-830)。hsp70是一种广泛存在的应激蛋白，其合成能提供生物体对各类有害因素(例如：缺血、缺氧和重金属等)的耐受性，使细胞处于应激状态，快速激活与抗毒有关的蛋白质基因，从而起到保护细胞和生物体的作用。trx是细胞内一种有效的抗氧化剂，能保护细胞、减轻氧化应激所致的损伤。trx能抑制p38mapk和凋亡信号调节激酶i的活性，增强细胞的抗凋亡能力(saitom.，etal.embo1998，17：2596-2606；hashimotos.，etal.biochem.biophys.res.commun.1999，258：443-447)。

据报道，eisai股份有限公司生产的用于治疗消化系统溃疡的替普瑞酮，即全反式和单顺式异构体的混合物(混合比例为3∶2)，能够引起hl-60癌症细胞的凋亡(okadas.etal.cellstruct.funct.1999，24：161-168；kannot.，etal.physiol.chem.phys.med.nmr2002，34：1-15).又据hashimoto等报道，gga通过抑制rhogtp酶和ras-mapk酶能够抑制卵巢癌的进展(hashimotos.，etal.cancer2005，103：1529-1536；hashimotos.，etal.biochem.biophys.res.commun.2007，356：72-77)。

众所周知，由eisai股份有限公司生产的替普瑞酮是一种(5e，9e，13e)-替普瑞酮和(5z，9e，13e)-替普瑞酮的混合物[重量比例为3∶2[见wo2004/047822，jp-9-169639a，jp-4621326，jp-2006-89393a，thejapanesepharmacopoeia(16thedition)，和抗溃疡药施维舒(selbex)的包装说明书].由其它公司出售的替普瑞酮也是(5e，9e，13e)-替普瑞酮和(5z，9e，13e)-替普瑞酮的3∶2混合物(例如，见msdscat.no.202-1s733；wakapurechemicalindustries，ltd.)。因此，hashimoto等的报道仅限于eisai股份有限公司生产的包含全反式和单顺式两种异构体的替普瑞酮混合物，而且全反式和单顺式两种异构体的比例为3∶2。而对其它比例的两种异构体的混合物和每一种异构体单独使用的研究则没有报道。由于两种异构体的药理作用和毒副作用可能不同，有必要对全反式替普瑞酮(5e-gga)、单顺式替普瑞酮(5z-gga)、以及其它比例的两种异构体的混合物在预防和治疗卵巢癌中的作用分别进行研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种全反式替普瑞酮及其衍生物作为制备预防和治疗卵巢癌药物的应用。

本发明所述的全反式和单顺式异构体是指在如下结构式(i)中，与r基团相连的双键为反式或顺式，而其它双键的结构如结构式(i)所示。当与r连接的双键是反式时，整个分子被称为全反式异构体(5e-gga)；当与r连接的双键是顺式时，整个分子被称为单顺式异构体(5z-gga)。

r选自于下面的四种基团：

其中，

x是c，或s；

y是o，或nr⁶；

r¹是h，烷基，环烷基，烷氧基，或nr⁷r⁸；

r²是烷基，环烷基，芳香基，oh，nr⁷r⁸，或烷氧基；

r³是h，烷基，环烷基，芳香基，或烷氧基；

r⁴和r⁵分别是h，烷基，或烷氧基；r⁴和r⁵的末端可以连接而形成一个环状化合物；

r⁶，r⁷，和r⁸分别为h，烷基，oh，或烷氧基。

本发明所述的全反式和单顺式替普瑞酮的比例是指两者之间的重量比例。

本发明所述的替普瑞酮及其衍生物的用途，是将其全反式、单顺式异构体，或两种异构体的混合物作为活性成分制备成预防和治疗卵巢癌的药物。

本发明所述的全反式替普瑞酮和单顺式替普瑞酮的制备，是将市售的替普瑞酮混合物(全反式异构体∶单顺式异构体＝3∶2)在硅胶柱上用适当比例的正己烷/乙酸乙酯或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，将每个组分在旋转蒸发仪上浓缩以除去溶剂，获得全反式替普瑞酮和单顺式替普瑞酮。

本发明所述的全反式替普瑞酮也可以通过文献报道的方法获得[bull.koreanchem.soc.2009，30(9)：215-217]。该文献报道的one-pot合成方法如反应式一：

反应式一、

本发明所述的其它替普瑞酮衍生物的制备，可以参考有关文献的合成方法，利用常规的有机合成反应。一些具体化合物的合成见实施方式部分；图2罗列了一些代表性的化合物。

本发明所述的替普瑞酮的用途，全反式异构体的活性显著地高于单顺式异构体的活性，也高于两种异构体混合物的活性。

本发明所述的预防和治疗卵巢癌的药物的成份(或有效成份)为单一的替普瑞酮异构体或两种异构体的混合物(全反式和单顺式比例为3∶2的混合物除外)，还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，以改善药物的吸收效果或便于服用，如制成胶囊、丸剂、粉剂、喷雾剂、片剂、膏剂、贴剂，口服液和注射液等。

本发明所述的辅料包括药学领域中常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。

本发明提供了替普瑞酮及其衍生物的一种新用途，即在制备预防和治疗卵巢癌药物中的应用。生物试验结果显示：全反式替普瑞酮能够更好地抑制人卵巢癌细胞caov-3的侵袭和增殖，其效果显著地优于单顺式替普瑞酮，也优于两种异构体的混合物。

全反式替普瑞酮(5e-gga)用于预防和治疗卵巢癌具有以下的优点：(1)疗效更好；(2)安全性高。

由于全反式替普瑞酮和高比例的反式/顺式(重量比例为3∶2的混合物除外)替普瑞酮混合物在预防和治疗卵巢癌药物中的应用属首次发现，因此，无论全反式替普瑞酮被单独作为活性成份制成药剂，还是与其他活性成份配伍制成药剂而用于上述预防和治疗卵巢癌，均在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1替普瑞酮及其衍生物的化学结构通式。

图2罗列了一些代表性的化合物。

图3是各种替普瑞酮制剂对人卵巢癌细胞caov-3的增殖抑制试验结果。*p＜0.01相对于只用溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid，lpa)处理过的癌细胞(对照组)。

具体实施方式

本发明用于测试化合物的nmr和质谱的仪器信息如下：

nmr：

仪器产家名称：bruker

仪器型号(model)：avanceii400

仪器频率：400mhz

测试常用的氘代试剂：cdcl3，d6-dmso

lc-ms：

仪器产家名称：waters

仪器型号(model)：uplc-sqd

测试常用的溶剂a：0.1％甲酸+水

测试常用的溶剂b：0.1％甲酸+乙氰。

除非有特别说明，本研究的细胞抑制试验是按照常规的mtt试验进行的。实施例中的一些主要的仪器及耗材如下：

caov-3人卵巢癌细胞atcc产品

溶血磷脂酸(lpa)sigma产品

dmem培养基gibco产品

胎牛血清(fbs)：gibco产品

96孔细胞培养板corning产品

celltiter96aq试剂盒promega产品

multidrop384细胞分液器thermo产品

enspire多功能读板器perkinelmer产品

实施例1：全反式和单顺式替普瑞酮的制备

将市售的替普瑞酮混合物(5e-gga∶5z-gga＝3∶2)在硅胶柱上用适当比例的正己烷/乙酸乙酯或石油醚/乙酸乙酯混合溶剂洗脱，将每个组分在旋转蒸发仪上浓缩除去溶剂，获得全反式替普瑞酮和单顺式替普瑞酮，lcms：ms(m/z)：331.3(mh+)；353.3(m+na)。由h-nmr(cdcl3)确定是全反式，还是单顺式异构体。

实施例2：全反式替普瑞酮的合成(反应式一)

反应式一、

全反式-替普瑞酮也可以通过文献报道的方法合成[bull.koreanchem.soc.2009，30(9)：215-217]。该文献报道的one-pot合成方法如下(反应式一)：在一圆底烧瓶中加入香叶基芳樟醇(r-1)(0.30ml，0.91mmol)、化合物r-2(0.39g，2.28mmol)，对-二甲苯(4.63ml)和异丙氧基铝(0.019g，0.09mmol)。将反应瓶放入160℃的油浴中，搅拌加热6小时。然后将反应物冷却至室温，旋转蒸发掉溶剂。向残余物中加入饱和碳酸钠水溶液，用二氯甲烷萃取。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤浓缩，用硅胶柱层析，洗脱液为正己烷∶乙酸乙酯(40∶1v/v)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)δ1.60(s，12h，20，21，22，23-ch3)，1.68(s，3h，19-ch3)，2.01(m，12h，7，8，11，12，15，16-ch2)，2.14(s，3h，1-ch3)，2.26(m，2h，3-ch2)，2.45(m，2h，4-ch2)，5.09(m，4h，5，9，13，17-ch)。

实施例3：各种重量比例的全反式和单顺式替普瑞酮混合物的制备

将上述制备的全反式替普瑞酮和市售的替普瑞酮以不同的比例混合而制备成所需要的重量比的替普瑞酮异构体混合物，如全反式/单顺式异构体的比例为7∶3，8∶2，9∶1，9.5∶0.5，9.8∶0.2，9.9∶0.1等。在受试的三个替普瑞酮样品中，全反式和单顺式异构体的比例分别为10∶0(5e-gga)，3∶2，0∶10(5z-gga)。

实施例4：5e，9e，13e-替普瑞酮-2-醇(3)的制备(反应式二)

反应式二、

在一圆底烧瓶中放入5e-gga(1)(1.66g，5mmol)和甲醇(10ml)，氮气保护。将反应瓶放入冰浴中，搅拌下分批加入nabh4(0.19g，5mmol)。然后继续搅拌1小时。向反应瓶中加入40ml蒸馏水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取。有机相拥无水硫酸钠干燥。旋转蒸发掉溶剂后得到3；lcms：ms(m/z)：333.3(mh⁺)。

实施例5：化合物4的制备(反应式三)

反应式三、

在一充氮气的反应瓶中放入丙烯醇r-3(87mg，0.3mmol)，三乙基胺(0.062ml，0.45mmol)和二氯甲烷(1ml)，搅拌冷却至0℃。向反应瓶中滴加1m浓度的乙酰氯/二氯甲烷溶液(0.42ml，0.042mmol)。滴加完毕后，反应液在室温下搅拌过夜。然后向反应瓶中加入碳酸氢钠水溶液，并用二氯甲烷萃取3次。合并后的有机相用水萃取一次，再用无水硫酸钠干燥。旋转蒸发掉溶剂后上硅胶柱层析，用乙酸乙酯∶正己烷(1∶99-2∶98)混合溶剂洗脱，得到一无色液体4。lcms：ms(m/z)：333.2(mh⁺)。

实施例6：替普瑞酮制剂对人卵巢癌细胞caov-3的增殖抑制实验

替普瑞酮制剂对人卵巢癌细胞caov-3的抑制是利用celltiter96aq试剂盒(promega)通过mtt试验来测定，具体步骤按照试剂盒的说明操作。将人卵巢癌细胞caov-3放入dmem培养基中，辅以10％(v/v)的胎牛血清(fbs)和青霉素(10u/ml)-链霉素(10u/ml)，放入充有95％的空气和5％co2，37℃的培养箱中培养。只限于使用15代以内的细胞。将三种替普瑞酮样品分别溶于dmso中，然后用pbs稀释至50μm。将细胞(3x10³/孔)转移到96孔板中，吸附4.5小时后，分别加入25μm溶血磷脂酸(lpa)和50μm的各种替普瑞酮溶液，然后在含有2％fbs的dmem培养基中培养24-72小时。然后向每一个孔中加入一定量的四唑化合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazoliuminnersalt，mts]溶液，1小时后，用enspire多功能读板器读取形成的甲臜溶液在590nm波长处的吸收度来算出细胞的存活数量，所有的试验都重复做四次。增殖结果则用gga处理过的细胞的吸收度和对照组细胞的吸收度的比值来表达。*p＜0.01相对于只用溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid，lpa)处理过的癌细胞(对照组)。(见图3)。