污水中生长微藻采收模型的建立方法与流程

本发明属于生物质能源技术领域，涉及一种污水中生长微藻采收模型的建立方法，特别涉及一种基于改性天然纳米纤维素的污水中生长微藻采收模型的建立方法。

背景技术：

微藻(microalgae)作为生产生物燃料、化学品、食品和饲料来源以及其他增值产品的原料具有巨大潜力。与陆地原料相比，微藻生长速度快，不竞争耕地和淡水资源，可全年采收，并可以吸收大量二氧化碳。为得到高浓度的微藻量，需要对藻液进行采收，但微藻采收在经济、技术以及环保上仍存在挑战。选择微藻采收技术时，降低采收成本并同时降低对微藻和培养基污染的风险是两个主要考虑的因素。目前，凝结/絮凝法被认为是相对有效和效益较高的，因其快速且简单，对能量需求小。其中通常使用的是阳离子凝结/絮凝剂，这些凝结/絮凝剂附着在带负电荷的微藻细胞(通常直径为2-20μm)上，然后形成更大的聚集体，团块和絮状物，沉淀到容器底部，留下清澈的上清液，从而达到采收微藻的目的。经证明，用凝结/絮凝剂采收的微藻，其收集和脱水过程所需要的能量是最少的。

目前，天然聚合物表现出可以提高采收过程的效益和环境可持续性的潜力，可与其他常用的凝结剂(阳离子无机盐和阳离子合成盐，聚合物，纳米颗粒)竞争。比如，源自存在于甲壳类动物、贝类(虾，蟹，龙虾)、昆虫、真菌和一些藻类的外骨骼和细胞壁中的几丁质的壳聚糖已经在采收微藻中表现出优异的性能。最丰富的天然生物聚合物-纤维素和纤维素基材料如结晶纳米纤维素(cnc)，在经过阳离子处理后可以有效得与微藻相互作用并将其从培养基中有效得采收出来。

1-(3-氨基丙基)咪唑改性的cnc(cnc-apim)在水中可以实现交替的分散和聚集，通过向混合液中交替通入co2和空气可显著改变cnc-apim的表面电荷，而这一过程是没有任何化学品加入的。基于co2响应的cnc-apim可以在co2存在时吸附微藻，在通入空气去除co2的时候形成更大的絮凝体有利于微藻的采收，随后进行解吸，再循环cnc-apim絮凝剂。微藻经过采收后，原先用于培养微藻的培养基也可重复使用，并且对随后的微藻培养没有显示出不利影响(ges,cchanpagnep,wangh,etal.microalgaerecoveryfromwaterforbiofuelproductionusingco2-switchablecrystallinenanocellulose[j].environmentalscience&technology,2016,50(14):7896-7903.)。因此从水，能源和环境方面来看，cnc-apim是更环保，更可持续的微藻絮凝/凝结剂。

然而，cnc-apim采收过程中涉及到多个参数，这些参数的优化是必不可少的，并且需要进一步提高cnc-apim对微藻的采收能力和降低使用cnc-apim进行微藻采收的成本。此外，目前在许多采收微藻的研究中所使用的微藻，是在商业培养基上培养的，如改良的bbm(ges,agbakpem,wuz,etal.influencesofsurfacecoating,uvirradiationandmagneticfieldonthealgaeremovalusingmagnetitenanoparticles[j].environmentalscience&technology,2014,49(2):1190-1196.)和bg-11(shiw,zhul,chenq,etal.synergyofflocculationandflotationformicroalgaeharvestingusingaluminiumelectrolysis[j].bioresourcetechnology,2017,233:127-33.)。由于废水中的环境和物质多样复杂，因此这些从商业培养基中培养的微藻观察到的采收性能可能不适用于在废水中生长的微藻，利用废水培养出的微藻可能产生不同的生物质组成(即蛋白质，脂质和碳水化合物)和性质(即表面电荷)，这些都可能极大地影响凝结/絮凝过程。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种污水中生长微藻采收模型的建立方法。该建立方法充分考量了cnc-apim采收微藻过程中涉及的四因素，即cnc-apim与微藻的质量比，通入co2的时间，通入空气的时间及流量，应用实验设计(doe)驱动响应面方法(rsm)来建立污水中生长微藻采收模型。

本发明的技术方案如下：

污水中生长微藻采收模型的建立方法，具体步骤如下：

步骤1，在室温下，采用box-behnken设计设置cnc-apim与微藻干重的质量比、通入co2时间、通入空气时间和通入空气流量的实验组，将cnc-apim溶液与藻液进行混合，通入co2，使表面带负电的微藻与表面带正电的cnc-apim结合，随后通入空气除去混合液中的co2，并促进cnc-apim和微藻间的网捕和吸附架桥作用，而后静置，使絮凝体沉降，完成微藻采收，计算各实验组的采收率(he)和回收能力(rc)，采收率和回收能力的计算公式分别为，he(％)＝[1-ca/cb]x100％，rc(g·微藻/g·cnc-apim)＝(cb-ca)v/m，式中cb和ca分别是微藻采收前上清液中的微藻浓度(g/l)和微藻采收后上清液中的微藻浓度(g/l)，v是微藻悬浮液体积(l)，m是加入cnc-apim的质量(g)；

步骤2，以两个因素的影响作为因变量，其他因素保持在中心水平，采用响应面分析，分别构建两因素相互作用对采收率和回收能力的影响的响应面函数关系；

步骤3，分别构建各单因素对采收率和回收能力的影响的响应面函数关系；

步骤4，根据两因素相互作用对采收率和回收能力的影响的响应面函数关系及各单因素对采收率和回收能力的影响的响应面函数关系，构建采收模型的采收率和回收能力的响应面方程，确定最佳的各采收因素。

优选地，步骤1中，cnc-apim与微藻干重的质量比设置范围为0.01～0.08，通入co2时间为5～60s，通入空气的时间为1～10min，通入空气的流量为5～50ml/min。

优选地，采用二次多项式模型对步骤1得到的数据进行检验。

优选地，步骤4中，采收率的响应面方程为y＝80.5+25.8a+9.2c+4.4d-9.3a²-7.2c²-3.4d²，a为cnc-apim与微藻干重的质量比，b为通入co2时间，c为通入空气时间，d为通入空气流量。

优选地，步骤4中，回收能力的响应面方程为y＝18.97-15.1a+3.0c+1.5d-2.92ac+7.8[a]²，a为cnc-apim与微藻干重的质量比，b为通入co2时间，c为通入空气时间，d为通入空气流量。

利用本发明方法构建的数学模型，可以预测cnc-apim采收污水中的微藻过程中的不同采收条件下的采收率和回收能力。本发明优化了cnc-apim微藻采收技术，缩小基础研究和实际应用之间的差距，确保cnc-apim微藻采收技术适用于污水培养的微藻，并对其生物质生产的细胞成分(油脂，蛋白质和多糖)没有不利影响。

附图说明

图1使用响应面方法分析he与cnc-apim与微藻干重的质量比和通入co2的函数关系(a)，he与cnc-apim与微藻干重的质量比和通入空气时间的函数关系(b)，he与cnc-apim与微藻干重的质量比和通入空气流量的函数关系(c)，he与通入co2时间和通入空气时间的函数关系(d)，he与通入co2时间和通入空气流量的函数关系(e)，he与通入空气时间和通入空气流量的函数关系(f)。

图2he对每个单独因子响应的扰动分析。a-cnc-apim与微藻干重的质量比，b-通入co2时间，c-通入空气时间，d-通入空气流量。

图3rc对每个单独因子响应的扰动分析。a-cnc-apim与微藻干重的质量比，b-通入co2时间，c-通入空气时间，d-通入空气流量。

图4使用响应面方法分析rc与cnc-apim与微藻干重的质量比和通入co2的函数关系(a)，rc与cnc-apim与微藻干重的质量比和通入空气时间的函数关系(b)，rc与cnc-apim与微藻干重的质量比和通入空气流量的函数关系(c)，rc与通入co2时间和通入空气时间的函数关系(d)，rc与通入co2时间和通入空气流量的函数关系(e)，rc与通入空气时间和通入空气流量的函数关系(f)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。

实施例1：使用cnc-apim对污水中生长的chlorellavulgarisutex2714絮凝采收(1)微藻的驯化和培养

本实例所需污水于南京城东污水处理厂取得。在4l的烧瓶中分别采用灭菌(20min120℃,0.103mpa)的初沉池后的污水和30％浓缩污水(3:7，二沉池出水：污泥脱水上清液)驯化培养c.vulgarisutex2714小球藻(chlorellavulgarisutex2714，购买于美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心)。在室温条件下(23-25℃)，用白色荧光灯持续照射所有烧瓶，光强度为(100-150)μmol/(m²·s)，使用带气石的气泵进行曝气。驯化时间大约2个月，6个生长周期。驯化完成后，分别接种两种污水条件下生长的c.vulgarisutex2714小球藻，在2l的烧瓶中进行培养，接种培养所用污水种类与驯化时的污水种类一致，灭菌及其他条件均与驯化培养时一致。

(2)微藻的采收

对生长在30％浓缩污水中的微藻使用cnc-apim进行采收实验。总的来说，在室温下(23-25℃)将35ml分布均匀的cnc-apim溶液与20ml藻液进行混合，通入co2(1atm,5-60s)，使表面带负电的微藻(-18.5～-23.4mv)与表面带正电的cnc-apim(29.7～35.2mv)结合，随后通入空气除去混合液中的co2(1atm,1-10min,5-50ml/min)，并促进cnc-apim和微藻之间的网捕和吸附架桥作用，而后静置10分钟，使絮凝体沉降，完成微藻采收。使用cnc-apim对微藻进行采收的过程中所有步骤的参数组合如表1所示，共进行了30次实验。

表1响应面实验设计和变量水平

每次实验完成后，于液面下1cm处采集水样，于680nm波长处测定其吸光度，按照以下公式计算其采收率和回收能力：

he(采收率)(％)＝[1-ca/cb]x100％，

rc(回收能力)(g·微藻/g·cnc-apim)＝(cb-ca)v/m，

式中cb和ca分别是微藻采收前上清液中的微藻浓度(g/l)和微藻采收后上清液中的微藻浓度(g/l)，v是微藻悬浮液体积(l)，m是加入cnc-apim的质量(g)。

如表1所示，cnc-apim与微藻干重的质量比，通入co2时间，通入空气时间及其流量大小是本发明所需要优化的。根据30次实验所得到的he和rc结果，运用四种不同的数学模型(线性模型，双因子相互作用模型，二次和三次多项式模型)对实验结果进行检查和最佳化处理。如表2所示，线性和二次多项式模型的p值小于0.0001，二次多项式模型缺乏拟合p值更高，标准偏差最低，决定系数最高，因此，选择二次多项式模型并将其视为显着性模型的更高阶，其具有不显著的缺乏拟合和可接受水平的模型精度。

表2使用四种数学模型对he和rc分析时的方差分析

图1显示了对he综合影响的三维响应面，其中对两个因素的影响作为因变量进行了研究，而其他因素则保持在其中心水平。

如图1a、b、c所示，无论通入空气的时间和流量以及通入co2的时间如何变化，cnc-apim与微藻干重的质量比越大he越高，在cnc-apim与微藻干重的质量比较低时此趋势更为明显，当cnc-apim与微藻干重的质量比大于0.07时，he趋于稳定。如图1a、b、f所示，对于所研究的特定范围内的通入空气的时间和流量，观察到不太显著的正面效果，当通入空气的时间大于8分钟流量大于40ml/min时，he甚至会有略微下降。此外，如图1c、d、e所示，在所研究的通入co2时间范围(5-60s)内，he几乎不受通入co2时间的影响。

图2提供了he对每个单独因子响应的扰动分析。

由图2可以明显看出，不同的co2通入时间(因素b)在整个研究范围内的扰动曲线是平坦的，对he几乎没有影响。但he对空气通入时间(因素c)及流量(因素d)是有响应的，但这响应不像he和cnc-apim与微藻干重的质量比(因素a)之间那样敏感，呈现出明显的增长趋势。因此，在扣除依赖因子(通入co2时间，p>0.05)后，根据编码因子反映单个因素的定量影响及其相互作用对he响应的预测模型在方程(1)中表示：

y＝80.5+25.8a+9.2c+4.4d-9.3a²-7.c²-3.4d²方程(1)

图3提供了rc对每个单独因子响应的扰动分析。

如图3所示，cnc-apim与微藻干重的比例(因素a)，通入空气的时间(因素c)及流量(因素d)被认为是重要的模型项，在这其中cnc-apim与微藻干重的比例(因素a)是影响rc最重要的因素。

图4显示了对he综合影响的三维响应面，其中对两个因素的影响作为因变量进行了研究，而其他因素则保持在其中心水平。

如图4a所示，当co2通入时间(32.5s)和空气流量(40ml/min)固定时，cnc-apim与微藻干重的质量比对rc有很大影响，在通入空气时间较长时(5-10min)这一影响尤其明显。如图4f所示，当通入空气的时间固定时，低cnc-apim与微藻干重的质量比(0.01-0.04g-cnc/g-微藻)比高cnc-apim与微藻干重的质量比(0.04-0.08g-cnc/g-微藻)对rc的影响更显著，且通入空气时间的长短与rc之间有正比例关系。然而，图4b表示与cnc-apim与微藻干重的质量比相比，通入空气的流量对rc的影响相对较小。如图四e和f所示，通入co2的时间和通入空气的时间及流量对rc都有轻微的正比例影响。图4c、d、e表明，当通入co2时间和其他三个因素的协同效应被研究时，通入co2时间与rc的显著变化不一致。图1至图4都表明，cnc-apim与微藻干重的质量比才是影响采收过程(he,rc)最重要的因素。在忽略不重要的系数(p>0.05)后，rc对各个影响因子的响应如方程(2)所示：

y＝18.97-15.1a+3.0c+1.5d-2.92ac+7.8[a]²方程(2)。

用响应面设计，得出的所有实验的预测和实际结果，如表3所示。

表3响应面实验设计和变量水平，以及he和rc的结果

基于表3，本发明可在以下最优化条件同时达到cnc-apim采收污水生长的c.vulgaris的最大hes(86.5％)和最高rc(38.5g-微藻/g-cnc)：0.02g-cnc/g-微藻，通入co25s，以50ml/min通入空气8min。

实施例2：cnc-apim采收污水生长的chlorellavulgarisutex2714对其生理特性的影响

在生长周期的稳定期，使用传统的离心法和实施例1中最优化的cnc-apim采收条件对在初沉池后污水以及30％浓缩污水中生长的c.vulgaris进行采收。

采收后的c.vulgaris用去离子水洗净并于60℃烘干，取100mg干藻粉加入3ml去离子水，于3000rpm下涡旋混匀30s，接着在90℃水浴20分钟，待溶液冷却至室温后，加入3ml油脂提取溶剂(甲醇/氯仿，1：2)，再将所得混合液于3000rpm下涡旋混匀30s，静置过夜，随后加入1ml去离子水，5000xg下离心10分钟，将下层有机相转移至预先烘至恒重的称皿中，并在50℃下将氯仿挥发，通过重量法测定c.vulgari中的油脂含量。

此外，以牛血清蛋白为标准溶液绘制标准曲线，使用bio-raddc蛋白质测定c.vulgari中的蛋白质含量，使用蒽酮-硫酸法测定c.vulgari中的多糖含量。利用直接酯基转移作用对湿藻进行处理从而进行利用气相色谱分析c.vulgari的脂肪酸组成。实现直接酯基转移作用的条件如下：加入20ml甲醇和2ml100％乙酰氯到重量为0.1g的湿藻中，90℃下加热过夜，同时以500rpm搅拌。获得的脂肪酸甲酯通过配备有火焰离子化检测器和db5-ms柱的agilent7890a气相色谱仪进行分析。烘箱温度在50℃保持5分钟，以7℃/min的速率升至260℃并在260℃下保持5分钟。进样器和检测器温度为260℃。用氦气作载气。通过将它们的保留时间与标准品的保留时间进行比较来鉴定样品中的脂肪酸甲酯峰。如表四和表五所示，cnc-apim采收后的c.vulgaris的多糖、蛋白质、油脂以及脂肪酸组成与传统离心法采收的c.vulgaris的多糖、蛋白质、油脂以及脂肪酸组成没有统计学上的差异(p>0.05)。

表4通过离心或基于cnc-apim的絮凝采收的c.vulgaris的细胞组成

表5不同采收处理中pw和30-cw培养的藻类生物量的脂肪酸谱

因此，cnc-apim能够作为合适的生物絮凝剂，对污水中微藻进行采收。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。