VEGFR抑制剂治疗肿瘤的方法与流程

本发明涉及vegfr抑制剂治疗肿瘤的方法。
背景技术：
：近年来，癌症治疗取得了显著的进展，抑制肿瘤血管生成和癌细胞生长内在驱动因子的分子靶向疗法，以及增强患者抗肿瘤免疫力的免疫调节疗法相继获得监管机构的批准。酶氨酸激酶血管内皮生长因子(vegf)及其受体(vegfr)在肿瘤的新生血管生成中具极其重要的作用，是阻断肿瘤新生血管生成中的重要靶点。wo2005000232a公开的小分子酪氨酸激酶抑制剂阿帕替尼(apatinib)具备高度选择性竞争细胞内vegfr-2的atp结合位点，阻断下游信号转导，抑制肿瘤新生血管的生成，最终达到治疗肿瘤的目的，阿帕替尼的结构式如式(i)所示。cn101676267a公开了阿帕替尼的一系列盐，例如甲磺酸盐、盐酸盐、马来酸盐等。目前市售的阿帕替尼为阿帕替尼甲磺酸盐，每日口服一次，一次剂量为850mg。程序化死亡分子-1(pd-1)的单克隆抗体，它通过阻断pd-l1/pd-1之间结合，最大限度地提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。目前有多家跨国制药公司在研发针对pd-1/pd-l1信号通路的单克隆抗体，其中已经上市的药物有nivolumab和pembrolizumab，给药频率为两周一次或三周一次。本发明提供的抗pd-1抗体，wo2017054646a公开了该抗体的序列和制备方法，该抗pd-1抗体已处于临床ⅲ期，安全性良好，已报到的临床研究结果已经显示出其具有一定的抗肿瘤作用(journalofclinicaloncology[j].35(2017):e15572-e15572)。吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶(indoleamine-pyrrole-2,3-dioxygenase，ido)是一种含铁血红素单体蛋白，ido抑制剂作为药物在医药行业具有良好的应用前景，专利申请pct/cn2016/079054(申请日2016.04.12，公开号wo2016169421a1)中提供了一种结构新型的高效低毒的选择性ido抑制剂化合物，具有优异的效果和作用，特别是优异的药代吸收活性，其化学名为(s)-2-(4-(4-(4-(6-氟-5h-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-基)哌啶-1-基)苯基)-1h-吡唑-1-基)乙醇，结构如下式(i)所示目前已有抗pd-1抗体联合vegfr抑制剂联合治疗癌症的临床研究正在开展中，例如cn106963948a公开了抗pd-1抗体和阿帕替尼联合治疗结肠癌的用途；cn105960415a公开了一种抗pd-1抗体与阿昔替尼联用治疗肾细胞癌的用途；wo2016141218a公开了一种抗pd-1抗体与乐伐替尼联用治疗甲状腺癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、恶性胶质瘤和黑色素瘤等的用途。但是还需要进一步优化联合治疗方案，以期进一步改善临床获益及安全性。技术实现要素：本发明提供一种给予患者有效量的vegfr抑制剂治疗肿瘤的给药方法，给药频率低于一天一次。在本发明的一个实施方案中，其中vegfr抑制剂的给药频率为两天一次、三天一次、四天一次、五天一次、六天一次、一周一次、每周给药三天一天一次、每周给药四天一天一次、每周给药五天一天一次或给药两周停药一周。在本发明的一个实施方案中，其中vegfr抑制剂的给药剂量选自100-800mg，优选自100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg。在本发明的一个实施方案中，其中所述vegfr抑制剂是vegfr-2抑制剂。在本发明的一个实施方案中，其中所述vegfr-2抑制剂选自：pan-90806、foretinib、他菲替尼(tafetinib)、康尼替尼(kanitinib)、阿帕替尼(apatinib)、tanibirumab、安罗替尼(anlotinib)、德立替尼(lucitanib)、vatalanib、西地尼布(cediranib)、西奥罗尼(chiauranib)、多韦替尼(dovitinib)、多纳非尼(donafenib)、法米替尼(famitinib)、sitravatinib、特拉替尼(telatinib)、l-21649、tas-115、卡博替尼(cabozantinib)、噻尔非尼(thiophenib)、呋喹替尼(fruquintinib)、布立尼布(brivanib)、索凡替尼(sulfatinib)、ramucirumab、glesatinib、尼达尼布(nintedanib)、普喹替尼(puquitinib)、阿西替尼(axitinib)、edp317、索拉非尼(sorafenib)、麦他替尼(metatinib)、tivozanib、瑞戈非尼(regorafenib)、midostaurin、培唑帕尼(pazopanib)、hlx-06、altiratinib、宁格替尼(ningetinib)、舒尼替尼(sunitinib)、al-8326、rebastinib或以上药物的可药用盐。在本发明的一个实施方案中，其中所述阿帕替尼可药用盐选自甲磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、二氟醋酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、萘磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、以及磷酸盐。在本发明的一个实施方案中，上述vegfr抑制剂还可以和免疫治疗剂联合给药。在本发明的一个实施方案中，上述免疫治疗剂选自针对以下靶点的治疗剂：pd-1、pd-l1、ctla-4、pd-l2、lag3、tim3、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd137、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、havcr2、hvem、ido1、ido2、icos、kir、lair1、light、marco(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、ps(磷脂酰丝氨酸)、ox-40、slam、tight、vista、vtcn1或其任何组合。在本发明的一个优选实施方案中，上述vegfr抑制剂和抗pd-1抗体或其抗原结合片段联合给药。在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段给药频率为一天一次、两天一次、三天一次、四天一次、五天一次、六天一次、一周一次、两周一次。在本发明的一个实施方案中，其中所述的抗pd-1抗体或其抗原结合片段剂量选自1-10mg/kg，优选自1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、10mg/kg，最优选3mg/kg。在本发明的一个实施方案中，其中所述的抗pd-1抗体或其抗原结合片段剂量选自50-600mg，优选自60mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、400mg、600mg，最优选200mg。在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段选自amp-224、gls-010、ibi-308、regn-2810、pdr-001、bgb-a317、pidilizumab、pf-06801591、genolimzumab、ca-170、medi-0680、js-001、tsr-042、camrelizumab、pembrolizumab、lzm-009、ak-103和nivolumab。在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3所述的抗pd-1抗体的重链可变区包含分别如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。其中，所述的各cdr序列如下表所示：名称序列编号hcdr1symmsseqidno：1hcdr2tisgggantyypdsvkgseqidno：2hcdr3qlyyfdyseqidno：3lcdr1lasqtigtwltseqidno：4lcdr2tatsladseqidno：5lcdr3qqvysipwtseqidno：6在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体为人源化抗体。在本发明的一个实施方案中，其中所述人源化抗体的轻链可变区序列为如seqidno:10所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为a43s的氨基酸变化。重链可变区序列为如seqidno:9所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为g44r的氨基酸变化。所述的人源化抗体重、轻链的可变区序列如下所示：重链可变区evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssseqidno：9轻链可变区diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikseqidno：10在本发明的一个实施方案中，其中所述人源化抗体轻链序列为如seqidno:8所示的序列或其变体；所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为a43s的氨基酸变化。重链序列为如seqidno:7所示的序列或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化；更优选为g44r的氨基酸变化。在本发明的一个实施方案中，其中所述的人源化抗体轻链序列为如seqidno:8所示的序列，重链序列为如seqidno:7所示的序列。前述的人源化抗体重、轻链的序列如下所示：重链evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkseqidno：7轻链diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno：8在本发明的一个实施方案中，上述vegfr抑制剂、抗pd-1抗体还可以和ido抑制剂联合给药，当联合给药时，vegfr抑制剂给药频率不限，可以是一天一次、两天一次、三天一次、四天一次、五天一次、六天一次、一周一次、每周给药三天一天一次、每周给药四天一天一次、每周给药五天一天一次或给药两周停药一周。在本发明的一个实施方案中，其中ido抑制剂为式(i)所示的化合物或其可药用的盐、溶剂化合物或其立体异构体，在本发明的一个实施方案中，其中所述ido抑制剂的给药频率为一天两次、一天一次、两天一次、三天一次、四天一次、五天一次、六天一次、一周一次。在本发明的一个实施方案中，其中所述ido抑制剂的剂量选自为50-2000mg，优选50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、750mg、800mg、900mg、1000mg、1200mg、1500mg、2000mg更优选100mg、200mg、400mg、800mg、1000mg、1200mg、1500mg。在本发明的一个治疗方案中，给予vegfr抑制剂治疗肿瘤，可以降低调节性t细胞(regulatorytcells，简称tregs)的数量，增加cd8+t细胞与treg的比值。在本发明的一个治疗方案中，给予抗pd-1抗体治疗肿瘤，可以降低调节性t细胞的数量，增加cd8+t细胞与treg的比值。在本发明的一个治疗方案，抗pd-1抗体或其抗原片段联合vegfr抑制剂治疗肿瘤，可以降低调节性t细胞的数量，增加cd8+t细胞与treg的比值。本发明所述肿瘤可选自胃癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、脑癌、皮肤癌、口腔癌、前列腺癌、骨癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、输卵管肿瘤、卵巢瘤、腹膜肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、肝细胞癌、乳突肾性瘤、头颈部肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或非小细胞肺癌；优选乳腺癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肾癌、黑素瘤或非小细胞肺癌。本发明还提供一种降低treg的方法，包括给予有需要的患者有效量的阿帕替尼。本发明还提供一种降低treg的方法，包括给予有需要的患者有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合片段。本发明还提供一种降低treg的方法，包括给予有需要的患者有效量的阿帕替尼和抗pd-1抗体或其抗原结合片段。在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3所述的抗pd-1抗体的重链可变区包含分别如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。其中，所述的各cdr序列如下表所示：名称序列编号hcdr1symmsseqidno：1hcdr2tisgggantyypdsvkgseqidno：2hcdr3qlyyfdyseqidno：3lcdr1lasqtigtwltseqidno：4lcdr2tatsladseqidno：5lcdr3qqvysipwtseqidno：6在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体为人源化抗体。在本发明的一个实施方案中，其中所述的人源化抗体重、轻链的可变区序列如下所示：重链可变区evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssseqidno：9轻链可变区diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikseqidno：10在本发明的一个实施方案中，其中所述人源化抗体重、轻链的序列如下所示：重链全长序列evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkseqidno：7轻链全长序列diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno：8本发明还提供一种药物包装盒，其包含有上述的有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合片段、vegfr抑制剂和ido抑制剂。本发明还提供一种药物组合物，其包含有上述的有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合片段、vegfr抑制剂和ido抑制剂，以及一种或多种可药用的赋型剂、稀释剂或载体。本发明还提供一种vegfr抑制剂、抗pd-1抗体和ido抑制剂联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明还提供一种vegfr抑制剂、抗pd-1抗体和ido抑制剂联合治疗肿瘤的方法。在本发明的一个实施方案中，其中所述vegfr抑制剂选自：pan-90806、foretinib、他菲替尼(tafetinib)、康尼替尼(kanitinib)、阿帕替尼(apatinib)、tanibirumab、安罗替尼(anlotinib)、德立替尼(lucitanib)、vatalanib、西地尼布(cediranib)、西奥罗尼(chiauranib)、多韦替尼(dovitinib)、多纳非尼(donafenib)、法米替尼(famitinib)、sitravatinib、特拉替尼(telatinib)、l-21649、tas-115、卡博替尼(cabozantinib)、噻尔非尼(thiophenib)、呋喹替尼(fruquintinib)、布立尼布(brivanib)、索凡替尼(sulfatinib)、ramucirumab、glesatinib、尼达尼布(nintedanib)、普喹替尼(puquitinib)、阿西替尼(axitinib)、edp317、索拉非尼(sorafenib)、麦他替尼(metatinib)、tivozanib、瑞戈非尼(regorafenib)、midostaurin、培唑帕尼(pazopanib)、hlx-06、altiratinib、宁格替尼(ningetinib)、舒尼替尼(sunitinib)、al-8326、rebastinib或以上药物的可药用盐。在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段选自amp-224、gls-010、ibi-308、regn-2810、pdr-001、bgb-a317、pidilizumab、pf-06801591、genolimzumab、ca-170、medi-0680、js-001、tsr-042、camrelizumab、pembrolizumab、lzm-009、ak-103和nivolumab。在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3所述的抗pd-1抗体的重链可变区包含分别如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。其中，所述的各cdr序列如下表所示：名称序列编号hcdr1symmsseqidno：1hcdr2tisgggantyypdsvkgseqidno：2hcdr3qlyyfdyseqidno：3lcdr1lasqtigtwltseqidno：4lcdr2tatsladseqidno：5lcdr3qqvysipwtseqidno：6在本发明的一个实施方案中，其中所述抗pd-1抗体为人源化抗体。在本发明的一个实施方案中，其中所述人源化抗体重、轻链的可变区序列如下所示：重链可变区evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssseqidno：9轻链可变区diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikseqidno：10在本发明的一个实施方案中，其中所述人源化抗体重、轻链的序列如下所示：重链全长序列evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssymmswvrqapgkglewvatisgggantyypdsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarqlyyfdywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkseqidno：7轻链全长序列diqmtqspsslsasvgdrvtitclasqtigtwltwyqqkpgkapklliytatsladgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqvysipwtfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno：8在本发明的一个实施方案中，其中ido抑制剂为式(i)所示的化合物或其可药用的盐、溶剂化合物或其立体异构体，本发明所述肿瘤可选自肺癌、胃癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、脑癌、皮肤癌、口腔癌、前列腺癌、骨癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、输卵管肿瘤、卵巢瘤、腹膜肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、肝细胞癌、乳突肾性瘤、头颈部肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤；优选乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肾癌、黑素瘤。本发明还提供一种阿帕替尼和免疫治疗剂联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明所述的免疫治疗剂可选自针对以下靶点的治疗剂：pd-1、pd-l1、ctla-4、pd-l2(b7-dc、cd273)、lag3、tim3、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd137、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、havcr2、hvem、ido1、ido2、icos、kir、lair1、light、marco(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、ps(磷脂酰丝氨酸)、ox-40、slam、tight、vista、vtcn1或其任何组合。所述治疗剂优选针对以下靶点的抗体：pd-1、pd-l1、ctla-4、pd-l2(b7-dc、cd273)、lag3、tim3、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、btla、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd137、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、havcr2、hvem、ido1、ido2、icos、kir、lair1、light、marco(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、ps(磷脂酰丝氨酸)、ox-40、slam、tight、vista、vtcn1或其任何组合。其中pd-1抗体不是轻链可变区包含分别如seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3和重链可变区包含分别如seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3的抗体。本发明所述肿瘤可选自肺癌、胃癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、脑癌、皮肤癌、口腔癌、前列腺癌、骨癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、输卵管肿瘤、卵巢瘤、腹膜肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、肝细胞癌、乳突肾性瘤、头颈部肿瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤；优选乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、结肠癌、肾癌、黑素瘤。在本发明中，vegfr抑制剂和抗pd-1抗体或其抗原结合片段联合用于肿瘤的治疗时，二者的给药次序没有任何限制，可以先给予抗pd-1抗体，再给与vegfr抑制剂或者先给予vegfr抑制剂，在给予抗pd-1抗体。在本发明中，vegfr抑制剂、抗pd-1抗体或其抗原结合片段和ido抑制剂联合用于肿瘤的治疗时，三者的给药次序没有任何限制。本发明所述联合的给药途径可分别选自经口给药、胃肠外给药、经皮给药，所述胃肠外给药包括但不限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射。发明详述一、术语为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。术语“人源化抗体(humanizedantibody)”，也称为cdr移植抗体(cdr-graftedantibody)，是指将小鼠的cdr序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共dna数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在“vbase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在kabat，e.a.等人，1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版中找到。在本发明一个优选的实施方案中，所述的pd-1人源化抗体小鼠的cdr序列选自seqidno:1，2，3，4，5，6。术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的fab片段，fab‘片段，f(ab’)2片段，以及与人pd-1结合的fv片段sfv片段；包含本发明所述抗体的选自seqidno:1至seqidno:6中的一个或多个cdr区。fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，fv抗体还包含在vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(singlechainantibody)或单链fv(sfv)。本发明的术语“与pd-1结合”，指能与人pd-1相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。附图说明图1.阿帕替尼和pd-1单独或联合给药对小鼠肿瘤体积的影响。图2.阿帕替尼和pd-1单独或联合给药对小鼠体重的影响。图3.阿帕替尼、pd-1和ido抑制剂单独或联合给药对小鼠肿瘤体积的影响图4.阿帕替尼、pd-1和ido抑制剂单独或联合给药对小鼠体重的影响具体实施方式以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。实施例11、实验目的：本实验在人pd-1转基因小鼠皮下接种小鼠mc38系结肠癌细胞建立肿瘤模型，通过肿瘤的大小及小鼠体重来评价联合用药对抗肿瘤作用及其安全性。联合药物治疗是腹腔给予一定剂量的抗pd-1抗体，同时口服不同剂量的阿帕替尼化合物。2、实验材料和方法：2.1实验动物和材料：人pd-1转基因小鼠：70只，由cephrim公司动物中心繁殖，原始的3对人pd-1转基因小鼠购自英国的isis公司，spf级饲养。溶媒：0.5％羧甲基纤维素钠+0.25％(v/v)聚山梨酯80人igg：来自血清(sigma-aldrich)，产品编号：i4506-50mg抗pd-1抗体：其重、轻链的序列如本发明中seqidno：7和seqidno：8，冻干粉，溶于水后，再用5％葡萄糖稀释，最终浓度为3mg/ml，批号p1512。甲磺酸阿帕替尼：由江苏恒瑞医药提供，用0.5％羧甲基纤维素钠+0.25％(v/v)聚山梨酯80稀释，最终浓度为20mg/ml，批号668170301mc38细胞：dmem培养基，10％胎牛血清，37℃，5％co2培养。选择用于植入的细胞符合以下四个标准：1)快速生长；2)传代次数少；3)接种前一天更换培养基和4)具有高生存力。2.2实验方法：在接种当天收获mc38细胞，将细胞(5x105)接种于70只人pd-1转基因小鼠(雌雄都有)右肋部皮下，待小鼠平均肿瘤体积达到100mm3左右时，选取56只，随机分成8组，每组7只。分组后根据方案给予单剂腹腔注射抗pd-1抗体，再口服阿帕替尼进行联合用药。每周两次测量肿瘤体积，称体重，记录数据。2.3实验分组及给药方案表1：实验分组及给药方案注：q2dx8：两天一次，给药8次；qdx21：一天一次，给药21次；qwx3：一周一次，给药3周；qdx3for3w：每周给药三天，给药3周；ip：腹腔注射po：口服3、数据表达和统计学处理各组动物的体重、肿瘤体积及瘤重，数据用平均值±标准差(mean±sem)表示，t-test对数据进行统计学分析。各组动物的体重如图2所示，肿瘤体积结果如表2和图1所示，肿瘤重量如表3所示。肿瘤体积计算公式：体积＝0.5236×长×短×高4、实验结果表2.肿瘤体积(mm3)*p<0.05及以下表示具有统计学意义。表3.肿瘤重量(g)组1组2组3组4组5组6组7组8平均值1.2901.1940.8270.5600.8390.5750.3280.153标准差0.1730.0730.1770.0980.1840.1130.1330.075实施例21、实验目的：本实验在人pd-1转基因小鼠皮下接种小鼠mc38系结肠癌细胞建立肿瘤模型，通过肿瘤的大小及小鼠体重来评价联合用药对抗肿瘤作用及其安全性。联合药物治疗是腹腔给予一定剂量的抗pd-1抗体，同时口服一定剂量的ido抑制剂和不同剂量的阿帕替尼化合物。2、实验材料和方法：2.1实验动物和材料：人pd-1转基因小鼠：55只，由cephrim公司动物中心繁殖，原始的3对人pd-1转基因小鼠购自英国的isis公司，spf级饲养。溶媒：0.5％羧甲基纤维素钠人igg：来自血清(sigma-aldrich)，产品编号：i4506-50mg抗pd-1抗体：其重、轻链的序列如本发明中seqidno：7和seqidno：8，冻干粉，溶于水后，再用5％葡萄糖稀释，最终浓度为3mg/ml，批号p1512。甲磺酸阿帕替尼：由江苏恒瑞医药提供，用0.5％羧甲基纤维素钠+0.25％(v/v)聚山梨酯80稀释，最终浓度为20mg/ml，批号668170301ido抑制剂：由江苏恒瑞医药提供，(s)-2-(4-(4-(4-(6-氟-5h-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-基)哌啶-1-基)苯基)-1h-吡唑-1-基)乙醇，参考专利申请pct/cn2016/079054(申请日2016.04.12，公开号wo2016169421a1)中的实施例40、41中的方法制备)，化合物结构如下：mc38细胞：dmem培养基，10％胎牛血清，37℃，5％co2培养。选择用于植入的细胞符合以下四个标准：1)快速生长；2)传代次数少；3)接种前一天更换培养基和4)具有高生存力。2.2实验方法：在接种当天收获mc38细胞，将细胞(5x105)接种于55只人pd-1转基因小鼠(雌雄都有)右肋部皮下，待小鼠平均肿瘤体积达到100mm3左右时，选取42只，随机分成7组，每组6只。分组后根据方案给予单剂腹腔注射抗pd-1抗体，再口服ido抑制剂和阿帕替尼进行联合用药。每周两次测量肿瘤体积，称体重，记录数据。2.3实验分组及给药方案表4：实验分组及给药方案注：q2dx8：两天一次，给药8次；qdx21：一天一次，给药21次；qdx3/weekfor3w：每周给药三天，给药3周；bidx21：每天两次，给药21天；ip：腹腔注射po：口服3、数据表达和统计学处理各组动物的体重、肿瘤体积及瘤重，数据用平均值±标准差(mean±sem)表示，t-test对数据进行统计学分析。各组动物的体重如图4所示，肿瘤体积结果如表5和图3所示。肿瘤体积计算公式：体积＝0.5236×长×短×高4、实验结果表5.肿瘤体积(mm3)阿帕替尼间歇给药(qdx53w)和ido抑制剂以及pd-1抗体联用方案对肿瘤生长抑制明显，抑瘤效果高于阿帕替尼间歇给药(q2dx10)和ido抑制剂以及pd-1抗体联用方案，抑瘤效果与阿帕替尼连续给药(qdx21)和pd-1抗体联用相当。两种阿帕替尼间歇给药和pd-1抗体联用均有抑制肿瘤生长的作用，抑瘤效果高于ido抑制剂和pd-1抗体联用方案。实施例3：流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞1、实验目的：本实验在人pd-1转基因小鼠皮下接种小鼠mc38系结肠癌细胞建立肿瘤模型，通过流式细胞术分析小鼠肿瘤和脾脏中调节性t细胞(regulatorytcells，简称tregs)及cd细胞的表达情况。2、实验材料和方法：2.1实验动物和材料：人pd-1转基因小鼠：70只，由cephrim公司动物中心繁殖，原始的3对人pd-1转基因小鼠购自英国的isis公司，spf级饲养。溶媒：0.5％羧甲基纤维素钠+0.25％(v/v)聚山梨酯80人igg：来自血清(sigma-aldrich)，产品编号：i4506-50mg抗pd-1抗体：其重、轻链的序列如本发明中seqidno：7和seqidno：8，冻干粉，溶于水后，再用5％葡萄糖稀释，最终浓度为3mg/ml，批号p1512。甲磺酸阿帕替尼：由江苏恒瑞医药提供，用0.5％羧甲基纤维素钠+0.25％(v/v)聚山梨酯80稀释，最终浓度为20mg/ml，批号6681703012.2实验方法：2.2.1实验分组及给药方案与实施例1相同，见表1。2.2.2收获组织/器官和制备单细胞悬浮液在第28天(最后一次给药后一天)，每组5只小鼠用co2处死。立即收集肿瘤和脾脏，称重并记录，然后将肿瘤和脾脏置于冰上的rpmi-1640培养基中。接着将肿瘤和脾脏切片，转移到预先装有2.5ml预混合酶(mittenyltumor/spleenisolationkit)的c分离管中，并按照说明书中的方法在全自动组织处理器(型号miltenyigentlemacsdissociator)上处理得到单一肿瘤或脾细胞悬液。2.2.3流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞首先将200万单个肿瘤或脾细胞与fcr阻断剂(bdbiosciences)孵育，随后与cd45+，cd3+，cd4+和cd8+(biolegendsbiosciences)的预混cd表面抗原缓冲液混合。洗涤后，将细胞单个悬浮液在冰上4℃和foxp3缓冲液固定过夜。第二天，使用透化缓冲液洗涤细胞，使用抗-foxp3-apc单抗(biolegendsbiosciences)细胞内染色foxp3。再次洗涤后，通过facscantoii(bdbiosciences)分析悬浮液。用bdfacsdiva软件(bdbiosciences)分析结果。在cd45+造血细胞群内分析cd8+和cd4+群体中cd4+foxp3+细胞的总数，并以2×106表示在肿瘤中的活细胞。3、数据表达和统计学处理对照组和治疗组之间或治疗组之间的统计使用单因素方差分析(anova)，随后进行bonferroni's校正。使用graphpadprism进行分析，p<0.05及以下表示具有统计学意义。4、实验结果4.1：treg在肿瘤和脾脏cd4+细胞中的表达见表5表5.注：ip：腹腔注射po：口服4.2：cd细胞在肿瘤中的表达见表6表6.注：ip：腹腔注射po：口服4.3：cd细胞在脾脏中的表达见表7表7.注：ip：腹腔注射po：口服和对照组相比，3mg/kg的剂量下抗pd-1抗体单用对cd4+和cd8+t细胞数量没有明显的影响，但是抗pd-1抗体明显减低treg数量，增加cd8+t细胞与treg的比值。3mg/kg的剂量下抗pd-1抗体单用仅仅减少肿瘤中的treg，对脾脏中的treg无影响。和对照组相比，100mg/kg的剂量下阿帕替尼单用对cd4+和cd8+t细胞数量没有明显的影响，但是阿帕替尼明显减低treg数量，增加cd8+t细胞与treg的比值。阿帕替尼间歇给药(每周一次，给药三周；每周三次，给药三周)与抗pd-1抗体联用对cd4+和cd8+t细胞数量，cd8+t细胞与treg的比值没有明显的影响，但是阿帕替尼连续给药与抗pd-1抗体联用增加cd8+t细胞与treg的比值。实施例4：阿帕替尼治疗胃癌给药频率临床研究1、化合物市售甲磺酸阿帕替尼片。2、入组标准(1)经病理学或组织学确诊的二线治疗失败的晚期胃癌患者或胃食管结合部腺癌；(2)具有可测量的病灶；(3)ecog评分0-2分。注：(1)治疗失败的定义：治疗过程中疾病进展或治疗结束后肿瘤复发转移，或者出现不可耐受的毒性；(2)进展期疾病的每一线的治疗包括用药时间≥1个周期或者更长时间的一种或多种化疗药物；允许前期进行辅助/新辅助治疗,如果辅助/新辅助治疗期间或者完成后≤24周内出现了肿瘤复发转移，则认为前期的辅助/新辅助治疗是一个针对进展期疾病的一线全身化疗(3)允许前期的治疗是化疗联合分子靶向药物。3、给药方案本试验将采用区组随机化方法对受试者进行随机分组，按照1:1:1的比例将受试者随机分配到3个试验组。a组：阿帕替尼单药：500mg，口服，每天一次，服5天停2天，21天为一个观察周期。共纳入受试者不少于20例；b组：阿帕替尼单药：500mg，口服，每天一次，服2周停1周，21天为一个观察周期。共纳入受试者不少于20例；c组：阿帕替尼单药：500mg，口服，每天一次，连续给药，21天为一个观察周期。共纳入受试者不少于20例；4、疗效分析主要疗效指标：无进展生存期(pfs)，定义为入组研究至肿瘤进展/复发或因任何原因死亡的时间。没有观察到肿瘤进展/复发或死亡的受试者，无进展生存/无复发生存在最后一次有效肿瘤评估日作删失处理。次要疗效指标：1.总生存期(os)：定义为入组研究至因任何原因死亡的时间。最后一次联系时还存活的受试者，其总生存在最后一次联系日作删失处理。2.客观缓解率(orr)：完全缓解(cr)+部分缓解(pr)，指采用recist1.1版标准来评定肿瘤客观疗效，指cr和pr的病例数在可评价疗效患者中的百分比。3.疾病控制率(dcr)：完全缓解(cr)+部分缓解(pr)+病情稳定(sd)，指cr、pr和sd(≥4周)的病例数在可评价疗效患者中的百分比。4.生活质量评分(qol)：(参照eortcqlq-c30v3.0及hcc-18)。序列表<110>江苏恒瑞医药股份有限公司苏州盛迪亚生物医药有限公司<120>vegfr抑制剂治疗肿瘤的方法<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>5<212>prt<213>鼠源(musmusculus)<400>1sertyrmetmetser15<210>2<211>17<212>prt<213>鼠源(musmusculus)<400>2thrileserglyglyglyalaasnthrtyrtyrproaspservallys151015gly<210>3<211>7<212>prt<213>鼠源(musmusculus)<400>3glnleutyrtyrpheasptyr15<210>4<211>11<212>prt<213>鼠源(musmusculus)<400>4leualaserglnthrileglythrtrpleuthr1510<210>5<211>7<212>prt<213>鼠源(musmusculus)<400>5thralathrserleualaasp15<210>6<211>9<212>prt<213>鼠源(musmusculus)<400>6glnglnvaltyrserileprotrpthr15<210>7<211>443<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>peptide<222>(1)..(443)<223>重链序列<400>7gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530metmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alathrileserglyglyglyalaasnthrtyrtyrproaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglnleutyrtyrpheasptyrtrpglyglnglythrthrval100105110thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala115120125procysserargserthrsergluserthralaalaleuglycysleu130135140vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly145150155160alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser165170175glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu180185190glythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasnthr195200205lysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocyspropro210215220cysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleuphepro225230235240prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr245250255cysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalglnpheasn260265270trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg275280285glugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthrval290295300leuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser305310315320asnlysglyleuproserserileglulysthrileserlysalalys325330335glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserglnglu340345350glumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe355360365tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu370375380asnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphe385390395400pheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpglnglugly405410415asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr420425430thrglnlysserleuserleuserleuglylys435440<210>8<211>214<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>peptide<222>(1)..(214)<223>轻链序列<400>8aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysleualaserglnthrileglythrtrp202530leuthrtrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrthralathrserleualaaspglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnvaltyrserileprotrp859095thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser165170175serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr180185190alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser195200205pheasnargglyglucys210<210>9<211>116<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>peptide<222>(1)..(116)<223>重链可变区<400>9gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530metmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alathrileserglyglyglyalaasnthrtyrtyrproaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglnleutyrtyrpheasptyrtrpglyglnglythrthrval100105110thrvalserser115<210>10<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>peptide<222>(1)..(10)<223>轻链可变区<400>10aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysleualaserglnthrileglythrtrp202530leuthrtrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrthralathrserleualaaspglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnvaltyrserileprotrp859095thrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105当前第1页12