一种自然杀伤细胞外泌体和大分子树枝状聚合物的组合物的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体自然杀伤细胞外泌体和大分子树枝状聚合物的组合物。

背景技术：

用于癌症治疗的靶向药物递送系统由于其高递送效率和最小副作用，逐渐受到广泛的关注。近期有研究发现一种生物膜伪装策略，并且认为其在癌症治疗中具有很大的潜力。该策略涉及涂有天然生物膜组份的纳米载体，使其在表面功能化。许多类似的膜已被用于制造仿生核壳纳米粒子，包括来自红细胞(rbc)、血小板、细菌、白细胞(wbc)、癌细胞的膜。然而，无一例外地，核-壳纳米颗粒的制造需要通过细胞裂解和膜纯化来提取质膜材料。这一过程极大地增加了污染和破坏功能性表面蛋白的风险。前者导致免疫原性增加，后者导致材料的功能下降。因此，对于其临床应用而言，获得功能性和高度生物相容性的材料至关重要。

外泌体(exosomes或evs)是纳米级细胞外脂质双层囊泡，其直径范围为30nm至150nm，几乎所有的细胞都分泌它们。自然杀伤(nk)细胞，已知在肿瘤免疫学中发挥关键作用，分泌的外泌体表达杀伤蛋白，包括fasl和穿孔素，涉及对多种肿瘤的靶向细胞毒性。有研究证明nk细胞外泌体(nkexos)具有肿瘤特异性积累，对正常组织没有细胞毒活性。同时，酸性肿瘤微环境也可以促进这种纳米粒子的积累。因此，nkexos可以执行促进肿瘤靶向和直接抗肿瘤剂的双重功能。此外，nkexos易于处理，因为它们是稳定的囊泡，可在-80℃下保持其生物活性至少两年。更重要的是，基于nk细胞的疗法可以应用在同种异体的场景中，不引起移植物抗宿主病(gvhd)。因此，在合成过程中，过量的游离nkexos不会引起副作用，但由于它们自身的性质而具有抗肿瘤作用。此外，使用整合的nkexos而不是破碎的膜作为纳米颗粒的外壳也避免了免疫原性物质被污染，比如传统的膜制备过程中的功能蛋白质的分解。因此，对nkexos进行深入研究，有助于为肿瘤或非肿瘤疾病的临床治疗提供新的治疗思路和实验基础。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，本发明研究了一种自然杀伤细胞外泌体(nkexos)和大分子树枝状聚合物的组合物，具体是一种新型的仿生核壳聚合物，以及一种仿生核壳聚合物和nkexos的组合物。

本发明提供了一种纳米颗粒，其包含外泌体(exos)和大分子树枝状聚合物。

在一个方面中，所述纳米颗粒具有核-壳结构；优选的，所述exos作为纳米颗粒的外壳，所述大分子树枝状聚合物作为纳米颗粒的内核。

在一个方面中，所述大分子树枝状聚合物选自酪氨酸偶联的大分子树枝状聚合物；优选的，所述大分子树枝状聚合物选自聚酰胺-胺(pamam)树枝状聚合物。

在一个方面中，所述exos选自免疫细胞外泌体；优选的，所述exos选自自然杀伤细胞外泌体(nkexos)。

在一个方面中，所述exos与所述大分子树枝状聚合物的质量比为4：1～1：4。

在一个方面中，所述内核进一步加载基因治疗剂；优选的，所述基因治疗剂选自核酸片段；更优选的，所述核酸片段选自dna、rna。

在一个方面中，所述核酸片段选自mirna；优选的，所述mirna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明提供了一种药物组合物，其包含之前所述的纳米颗粒，和之前所述的nkexos，以及任选的，药学上可接受的载体。

在一个方面中，所述米颗粒与所述nkexos的质量比为4：1～1：4。

本发明提供了一种之前所述的药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将一定浓度的核酸片段加入适量的缓冲液中；

(2)加入一定量的大分子树枝状聚合物，充分混合反应；

(3)离心去除过量的核酸片段，收集沉淀，重悬得到载有核酸片段的大分子树枝状聚合物；

(4)加入一定量的自然杀伤细胞外泌体(nkexos)，孵育；

(5)获得所述药物组合物。

在一个方面中，所述大分子树枝状聚合物选自与酪氨酸偶联；优选的，所述大分子树枝状聚合物选自聚酰胺-胺(pamam)树枝状聚合物。

在一个方面中，所述nkexos与所述大分子树枝状聚合物的质量比为4：1～1：4。

在一个方面中，所述核酸片段选自dna、rna；优选的，所述核酸片段选自mirna；更优选的，所述mirna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明提供了一种之前所述的纳米颗粒或者之前所述的药物组合物在制备用于治疗癌症或感染的药物中的用途。

在一个方面中，所述癌症选自肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌或黑色素瘤；所述感染选自病毒感染、细菌感染或真菌感染。

本发明首次报道了一种通过简单孵育nkexos和酪氨酸偶联的树枝状大分子后生成的含有外泌体伪装的核壳纳米颗粒(nns)和nkexos的纳米粒子组合物。

组合物中的nns是一种仿生核壳聚合物(图1)，由两种组分的自组装形成：(1)基于聚酰胺-胺(pamam)树枝状聚合物的内核部分，用于加载基因治疗剂；(2)基于nkexos的外壳具有肿瘤靶向和直接抗肿瘤的双重功能。nkexos通过内吞作用/融合或fasl/fas将nns引导至肿瘤并与靶细胞的质膜相互作用，这两者也参与nkexos细胞毒作用。在通过靶细胞内化然后从酸性内体逃逸后，治疗性mirna被释放到细胞质中并调节细胞的转录组批次或基因，其与nkexos发挥组合的抗肿瘤作用。

附图说明

图1：纳米颗粒的电镜照片。

图2：纳米颗粒和自然杀伤细胞外泌体(nkexos)的制备流程图。

图3：胃癌细胞增殖受自然杀伤细胞外泌体nkexos、载有目的mirna的pamam树枝状聚合物(pamam-mirna)、外泌体伪装的核壳纳米颗粒和nkexos的组合物(nns-nkexos)的影响(注：各组实验数据具有显著性差异)。

图4：肺癌细胞增殖受自然杀伤细胞外泌体nkexos、载有目的mirna的pamam树枝状聚合物(pamam-mirna)、外泌体伪装的核壳纳米颗粒和nkexos的组合物(nns-nkexos)的影响(注：各组实验数据具有显著性差异)。

图5：黑色素瘤细胞增殖受自然杀伤细胞外泌体nkexos、载有目的mirna的pamam树枝状聚合物(pamam-mirna)、外泌体伪装的核壳纳米颗粒和nkexos的组合物(nns-nkexos)的影响(注：各组实验数据具有显著性差异)。

具体实施方式

下述实验方法中所用的实验材料，如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出诸多修改，这样的修改也落入本发明的保护范围之内。

实施例1、制备自然杀伤细胞外泌体(nkexos)

一、实验材料

人nk细胞系nk92-mi，dmem培养基(含10％胎牛血清)，在37℃、5％co2条件下培养，备用。

二、实验步骤

1、培养nk92-mi细胞3天以上，收集上清液。

2、上清液经10,000g、4℃、离心30分钟，弃去沉淀。

3、上清液经0.22μm滤膜过滤，保留滤液。

4、滤液经100,000g、4℃、离心70分钟，保留沉淀。

5、沉淀经pbs溶液清洗若干次，得到nkexos，备用。

实施例2、制备外泌体伪装的核壳纳米颗粒(nns)和nkexos的组合物

一、实验材料

mirnalet7a，序列：ugagguaguagguuguauaguu(seqidno:1)

酪氨酸偶联的聚酰胺-胺树枝状聚合物(pamamg5)

二、实验步骤

1、将10ml浓度1mm的目的mirna加入100μl1×pbs缓冲液。

2、加入4ml(5.44mg)的酪氨酸偶联的pamam树枝状聚合物，充分混合，4℃下反应15分钟。

3、10,000rpm、离心30分钟，弃去过量的mirna，收集沉淀，重悬得到载有目的mirna的pamam树枝状聚合物。

4、加入上述10mg的nkexos，4℃下孵育24小时。

5、获得nns-nkexos组合物。

实施例3、nns-nkexos组合物对肿瘤细胞的影响

一、实验材料

分别批量制备得到自然杀伤细胞外泌体nkexos，载有目的mirna的pamam树枝状聚合物(pamam-mirna)，外泌体伪装的核壳纳米颗粒和nkexos的组合物(nns-nkexos)。

胃癌细胞系snu484，肺癌细胞系nci-h460，黑色素瘤细胞系a375，dmem培养基(含10％胎牛血清)，在37℃、5％co2条件下培养，备用。

二、实验分组

1组：空白对照

2组：nkexos

3组：pamam-mirna

4组：nns-nkexos组合物

三、实验方法

1、肿瘤细胞经胰酶消化，离心，收集细胞。

2、细胞经dmem培养基(含10％胎牛血清)混悬，按1×10⁵/ml细胞密度加入6孔板中。

3、1组不加入任何试剂，2组每孔加入10μgnkexos，3组每孔加入20μgpamam-mirna，4组加入30μgnns-nkexos组合物。

4、各实验组分别培养24、48、72小时。

5、培养结束后，每孔加入20μlcck-8试剂，继续孵育3小时。

6、cck-8法检测细胞存活率。

四、实验结果

图3-5分别显示了胃癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤细胞的增殖受nkexos、pamam-mirna、nns-nkexos的影响。由图中可知，nkexos、pamam-mirna、nns-nkexos三者都会抑制肿瘤细胞的增殖，其中nns-nkexos明显结合了nkexos和pamam-mirna两者的特点，对肿瘤细胞增殖的影响更加显著。