本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种冻干保护剂、猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病毒感染引起的，多种动物共患的急性致死性传染病，以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要症状，猪是其自然易感宿主，主要引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，仔猪感染主要是神经症状，成年猪则以隐性感染为主，该病已成为种猪繁殖障碍综合症的主要病因。疫苗免疫是防制猪伪狂犬病的主要措施，现在用得较多的是基因缺失活疫苗。目前国内猪伪狂犬活疫苗生产中存在半成品毒液和成品滴度不高、制苗过程(保存和冻干)抗原损失大和存在免疫副反应现象等难题。因此，本领域中函需能够提升伪狂犬病活疫苗品质的生产方法。目前，缺乏一种具有稳定性能好、保护功能强的冻干保护剂、猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种具有稳定性能好、保护功能强的冻干保护剂、猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法。本发明的目的通过以下技术方案实现的：本发明的一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括按质量体积百分含量(m:v)的如下组分组成：蔗糖6-12％，聚乙二醇1-2％，聚谷氨酸3-6％，酶解明胶1-2％，乳蛋白水解物2-6％，l-精氨酸0.05-0.1％，体积百分含量(v:v)甘油0.5-1％，余量为水。进一步地，所述的聚乙二醇的规格为peg4000-peg10000之一。本发明的一种使用所述的冻干保护剂的猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)接毒与收获：向生长良好鸡胚成纤维细胞或st细胞中接入猪伪狂犬病毒毒种，加入细胞培养液体积比(v:v)10％的辅助培养液，先36-37℃培养6-8h，然后38-39℃培养14-16h，最后36-37℃继续培养8-12h，当细胞病变75％以上时收获半成品病毒液；(2)疫苗制备：将半成品病毒液与冻干保护剂按体积比1：1充分混匀，定量分装后冷冻真空干燥，制得猪伪狂犬病活疫苗。进一步地，在步骤(1)中，辅助培养液为含有pvpk300.1-0.2g/l、脯氨酸0.4-0.8g/l和谷氨酰胺6-10g/l的水溶液。本发明的一种猪伪狂犬病活疫苗采用上述的方法制备而成。有益效果：本发明方法制备的伪狂犬病活疫苗，抗原含量高，冻干和储运过程中稳定性好，免疫方式多样，应激反应小，使用更便捷。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明在接毒时不更换细胞培养液，而是添加少量辅助液，省略了细胞维持液的添加，降低生产成本；同时辅助液促进细胞生长和病毒增殖，从而提高猪伪狂犬病毒抗原含量。(2)本发明采用的冻干保护剂提高了猪伪狂犬病毒在冻干过程和成品疫苗储运中的稳定性，延长了疫苗保存期，由原来2-8℃保存9个月提高到24个月。(3)本发明方法生产的猪伪狂犬病活疫苗，既可以采用注射免疫方式，又可以采用喷鼻免疫方式，可以减小免疫动物的应激反应，免疫方式更便捷，免疫效果更佳。具体实施方式通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。实施例1本发明的一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括按质量体积百分含量(m:v)的如下组分组成：蔗糖6％，聚乙二醇2％，聚谷氨酸5％，酶解明胶1％，乳蛋白水解物6％，l-精氨酸0.05％，体积百分含量(v:v)甘油1％，余量为水。所述的聚乙二醇的规格为peg4000。本发明的一种使用所述的冻干保护剂的猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)接毒与收获：向生长良好鸡胚成纤维细胞或st细胞中接入猪伪狂犬病毒毒种，加入细胞培养液体积比(v:v)10％的辅助培养液，先37℃培养7h，然后38℃培养14h，最后37℃继续培养8h，当细胞病变75％以上时收获半成品病毒液；(2)疫苗制备：将半成品病毒液与冻干保护剂按体积比1：1充分混匀，定量分装后冷冻真空干燥，制得猪伪狂犬病活疫苗。在步骤(1)中，辅助培养液为含有pvpk300.1g/l、脯氨酸0.8g/l和谷氨酰胺8g/l的水溶液。实施例2实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括按质量体积百分含量(m:v)的如下组分组成：蔗糖12％，聚乙二醇1.5％，聚谷氨酸6％，酶解明胶2％，乳蛋白水解物2％，l-精氨酸0.1％，体积百分含量(v:v)甘油0.8％，余量为水。所述的聚乙二醇的规格为peg10000。本发明的一种使用所述的冻干保护剂的猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)接毒与收获：向生长良好鸡胚成纤维细胞或st细胞中接入猪伪狂犬病毒毒种，加入细胞培养液体积比(v:v)10％的辅助培养液，先36℃培养6h，然后39℃培养15h，最后36℃继续培养12h，当细胞病变75％以上时收获半成品病毒液；(2)疫苗制备：将半成品病毒液与冻干保护剂按体积比1：1充分混匀，定量分装后冷冻真空干燥，制得猪伪狂犬病活疫苗。在步骤(1)中，辅助培养液为含有pvpk300.2g/l、脯氨酸0.4g/l和谷氨酰胺6g/l的水溶液。实施例3实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括按质量体积百分含量(m:v)的如下组分组成：蔗糖10％，聚乙二醇1％，聚谷氨酸3％，酶解明胶1.2％，乳蛋白水解物2.5％，l-精氨酸0.08％，体积百分含量(v:v)甘油0.5％，余量为水。所述的聚乙二醇的规格为peg8000。本发明的一种使用所述的冻干保护剂的猪伪狂犬病活疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)接毒与收获：向生长良好鸡胚成纤维细胞或st细胞中接入猪伪狂犬病毒毒种，加入细胞培养液体积比(v:v)10％的辅助培养液，先36.5℃培养8h，然后38.5℃培养16h，最后36.6℃继续培养10h，当细胞病变75％以上时收获半成品病毒液；(2)疫苗制备：将半成品病毒液与冻干保护剂按体积比1：1充分混匀，定量分装后冷冻真空干燥，制得猪伪狂犬病活疫苗。在步骤(1)中，辅助培养液为含有pvpk300.15g/l、脯氨酸0.6g/l和谷氨酰胺10g/l的水溶液。试验1冻干保护剂及辅助培养液原材料市场有售；毒种：猪伪狂犬病毒弱毒(bartha株)、猪伪狂犬病毒强毒株均购自中国兽医药品监察所。1.冻干保护剂的配制配制1000ml冻干保护剂1：取蔗糖80g，聚乙二醇20g，聚谷氨酸40g，酶解明胶15g，乳蛋白水解物50g，l-精氨酸0.6g，甘油5ml，加入600ml去离子水中，充分溶解，定容至1000ml，除菌后备用。配制1000ml冻干保护剂2：取蔗糖100g，聚乙二醇15g，聚谷氨酸50g，酶解明胶20g，乳蛋白水解物40g，l-精氨酸0.8g，甘油10ml，加入800ml去离子水中，充分溶解，定容至1000ml，除菌后备用。2.猪伪狂犬病活疫苗的制备(1)鸡胚成纤维细胞半成品毒液制备：向生长良好鸡胚成纤维细胞中接入猪伪狂犬病毒毒种，加入细胞培养液体积比(v:v)10％的辅助培养液(辅助培养液为含有pvpk300.2g/l、脯氨酸0.6g/l和谷氨酰胺8g/l的无菌水溶液)，先37℃培养6h，然后38℃培养16h，最后37℃继续培养10h，细胞病变达75％以上，收获半成品病毒液，同时设立对照组(现有工艺，兽用生物制品规程(二000版))，分别取样测定病毒含量tcid50，结果见表1。(2)st细胞半成品毒液制备：向生长良好st细胞中接入猪伪狂犬病毒毒种，加入细胞培养液体积比(v:v)10％的辅助培养液(辅助培养液为含有pvpk300.1g/l、脯氨酸0.8g/l和谷氨酰胺9g/l的无菌水溶液)，先36℃培养8h，然后39℃培养14h，最后36℃继续培养12h，细胞病变达75％以上，收获半成品病毒液，取样测定病毒含量tcid50，结果见表1。(3)疫苗制备：将半成品病毒液与冻干保护剂按体积比1：1，充分混匀后，定量分装后冷冻真空干燥，制成猪伪狂犬病活疫苗，并设立现有工艺对照组，取样测定冻干成品的病毒含量，猪伪狂病活疫苗病毒含量测定结果如表1所示。表1单位：tcid50/头份组别冻干前半成品效价冻干后成品效价鸡胚成纤维细胞组106.9106.7st细胞组107.1106.9现有工艺对照组106.1105.0从表1可以看出，现有工艺生产的半成品毒液较本发明方法病毒含量低，且冻干过程中损失更多。(4)猪伪狂犬病活疫苗稳定性检测取上述制备的3组疫苗各取20瓶，置2-8℃保存，分别于保存后的0、6、9、12、18、24个月取样测定病毒含量，不同保存期猪伪狂犬病活疫苗效价测定结果如表2所示。表2单位：tcid50/头份组别0月6月9月12月18月24月鸡胚成纤维细胞组106.7106.7106.5106.5106.3106.3st细胞组106.9106.7106.7106.5106.5106.5现有工艺对照组105.0104.5104.0<103.7<103.7<103.7从表2可以看出，现有工艺生产的疫苗2-8℃保存期只有9个月(保存12月，效价低于规程标准103.7tcid50/头份)。本发明方法生产的疫苗保存24个月，效价仍高达106.0tcid50/头份以上，高于规程标准。3.疫苗免疫效果评价选取9周龄易感猪，用上述3组疫苗分别进行注射免疫和喷鼻免疫，10头/组，并设立空白对照组，在20周龄用猪伪狂犬强毒进行攻毒，在免疫前、免疫后7日、攻毒前和攻毒后14日进行称重，并统计发病情况，不同组疫苗免疫效果评价试验结果统计表如表3所示：表3从表3可以看出中，采用注射免疫组免疫后7日的体重较其他各组平均体重轻，说明注射免疫有一定免疫应激反应。本发明方法生产的猪伪狂犬病活疫苗，既可以采用注射免疫方式，又可以采用喷鼻免疫方式，可以减小免疫动物的应激反应，免疫方式更便捷，免疫效果更佳。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。当前第1页12