一种抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制作方法

本发明属于医学材料技术领域，尤其涉及一种抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

等离子体是气体被电离后产生的由带正电或带负电粒子组成的呈电中性的离子化气体，其活性物质主要包括电子、正负离子、基态原子、激发态原子、活性自由基(如ros、rns等)和少量紫外线等(uv)。近年来随着科技的发展，低温等离子体(coldatmosphericplasma，cap)由于其对生物组织存在选择性作用同时，不对所作用组织产生热损伤，逐渐受到人们重视。研究发现cap射流作用于生物体表面可以杀灭其表面微生物、促进创面愈合，还以选择性抑制肿瘤细胞的生长。但是直接cap射流的穿透性有限，很难实现对实体肿瘤有效治疗。近来研究发现cap直接作用于特定的液体环境后，能够使这些被等离子体作用后的液体产生具有类似直接等离子体射流的生物学特性，同样也可以发挥选择性抑制肿瘤增生的作用，这进一步扩大了等离子体在医学领域上的应用潜力。被等离子体激活后的液体称为“等离子体激活液”。近年来不少研究证实了低温等子体激活液对体内外超过20种以上的恶性肿瘤存在明确的选择性抑制效应，这些肿瘤包括宫颈癌、乳腺癌、骨肉瘤、大肠癌和神经胶质瘤等。

但目前低温等离子体及等离子体激活液选择性抑制肿瘤细胞的具体机制仍不明确，现有的研究发现等离子体射流和等离子体激活液选择性抑制肿瘤细胞的机制是通过释放活性氧(ros)、活性氮(rns)、自由基、紫外线、带电粒子和电场的综合作用结果。研究同时表明不同底物液体产生的等离子体激活液其生物活性是存在差异的。

综上所述，现有技术皮肤恶性肿瘤治疗目前存在的局限性是：

皮肤恶性肿瘤主要有基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑素瘤三大常见肿瘤，近些年这三种恶性肿瘤的发病率一直处于上升趋势。目前主要的治疗方法包括手术、放疗和化疗等，但均不同程度地存在一定的局限性。很多患者没有获得有效的治疗，尤其是上述三种治疗方法对于晚期及年老患者来说均是严峻的挑战。皮肤恶性肿瘤手术治疗的适应范围比较狭窄，临床上主要包括：大部分老年患者；体质较差难以耐受手术者；皮肤癌面积较大、侵犯深度较深患者；需要皮肤移植但是没有充足供区提供移植所需皮肤的患者等。手术虽能有效切除病损组织，但手术麻醉及手术本身均会诱发各种并发症，且手术对于晚期转移患者已无治疗意义，尤其是恶性黑素瘤手术治疗的作用非常有限。化学疗法是目前治疗恶性皮肤癌的主要方法之一，但是能够有效杀灭皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌的化疗药物非常少，且特异性不高，在杀灭肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也存在毒副作用，如化疗常造成脱发、严重胃肠反应、全血细胞减少等，严重者甚至威胁患者生命。恶性黑素瘤的化疗作用也很有限，仅适用于手术后辅助治疗，不宜手术切除患者或全身广泛转移的晚期恶性黑素瘤的姑息性治疗。放疗仅适用于局部肿瘤的治疗，对于广泛性转移的恶性黑素瘤细胞难以治疗，但放疗会造成局部组织坏死、疤痕形成和放射性皮炎等，在治疗皮肤癌同时对正常组织也会产生影响而限制了放疗的应用。

解决上述技术问题的难度和意义：

关于皮肤恶性肿瘤的治疗，临床上没有高度选择性化疗药物，外科手术切除难度大，很多患者难以耐受手术，放疗也存在很大的局限性。

综上所述，低温等离子体激活液被证实在体外对培养的多达20余种人类恶性肿瘤细胞有选择性抑制生长效应，本发明采用等离子体射流在体外处理皮肤恶性肿瘤细胞也发现可以选择性抑制皮肤恶性肿瘤细胞的生长；但是鉴于皮肤肿瘤细胞均呈实体性生长，直接等离子体射流穿透深度有限，本发明使用等离子体射流作用于细胞培养基后，获得等离子体激活液(cap-dmem)，再在体外作用于皮肤肿瘤细胞，发现cap-dmem也能够选择性抑制皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑素瘤细胞，并在体外裸鼠移植瘤中得以证实。

采用等离子体激活液对肿瘤处理的意义在于，克服了等离子体射流穿透深度的局限性，可以把等离子体激活液直接注射到瘤体内进行治疗。

采用等离子体激活液不仅克服了穿透深度限制的问题，还可以把等离子体激活液直接注射到体内多种实体瘤体内进行治疗，类似于局部注射化疗药物。但是因为对正常组织细胞没有抑制效应，从而避免了类似化疗药物对正常组织细胞的潜在损伤的问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

本发明是这样实现的，一种抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制备方法，包括：

利用低温等离子体装置所产生的等离子体处理无菌细菌培养液(dmem)120s-300s，获得低温等离子体激活液(cap-dmem)；dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium)，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基,被广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。

进一步，所述抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制备方法包括：

将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，通过细铜棒发射出等离子体射流，等离子体射流处理120s后获得低温等离子体激活液cap-dmem。

进一步，所述抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制备方法包括：将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒可发射出等离子体射流，等离子体射流处理240s后获得低温等离子体激活液cap-dmem。

进一步，所述抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制备方法包括：将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒发射出等离子体射流，等离子体射流处理300s后获得低温等离子体激活液：cap-dmem。

本发明的另一目的在于提供一种抑制宫颈癌恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

本发明的另一目的在于提供一种抑制乳腺癌恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

本发明的另一目的在于提供一种抑制骨肉瘤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

本发明的另一目的在于提供一种抑制大肠癌恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

本发明的另一目的在于提供一种抑制神经胶质瘤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明创新性利用dmem作为底物液体，利用低温等离子体装置激活dmem，从而获得cap-dmem，再使用cap-dmem在体内外作用于人皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑素瘤细胞，发现cap-dmem可以选择性抑制上述3种恶性肿瘤细胞的生长，以及在体内抑制裸鼠种植后肿瘤的增生。cap-dmem处理皮肤肿瘤细胞后，随着cap-dmem所接受的射流时间的增加，皮肤肿瘤细胞体积逐渐变小，细胞逐渐失去正常形态开始变圆，细胞核开始固缩，大量细胞从培养皿脱落，如图1所示。针对cap-dmem处理后细胞活力及凋亡程度如图2、图3所示。cap-dmem对人皮肤鳞状细胞癌细胞的代谢活力显示出明显的剂量依赖性和时间依赖性，当dmem接受等离子体射流时间达到120s时，皮肤鳞癌的代谢活力已经显示出明显的抑制作用。当射流时间达300s时，约80％左右细胞已失去生命活力(图2)。同时，cap-dmem抑制细胞代谢活力与其造成的明显的细胞凋亡有关，cap-dmem对皮肤恶性肿瘤造成的凋亡也显示出明显的剂量依赖性(图3)。

因此，低温等离子体激活液作为一个新型的抗癌方法对未来临床治疗皮肤恶性肿瘤带来了新的希望。可以通过把cap-dmem直接注射到肿瘤体内进行治疗，可以有效的抑制肿瘤细胞生长，对周围正常细胞无损伤。

其优点是可以克服外科手术、放疗和化疗在治疗上述3种恶性皮肤癌中的局限性，可以有效组织肿瘤细胞生长的同时，对周围正常皮肤组织无损伤，因此可以通过局部注射达到治疗上述3种肿瘤的目的，而不需要考虑手术、化疗和放疗所带来的不良发应。

附图说明

图1是本发明实施例提供的cap-dmem处理后皮肤肿瘤细胞形态变化图。

图2是本发明实施例提供的mtt法测cap-dmem对皮肤恶性肿瘤细胞代谢活力的抑制作用图。

图3annexinv/pi双染法cap-dmem对皮肤肿瘤细胞产生凋亡作用图。

图4是本发明实施例提供的抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制备方法流程图。

图5是本发明实施例提供的低温等离子体激发装置示意图。

图中：1、电阻；2、细铜棒组合结构；3、低温等离子体；4、介电材料；5、cap-dmem低温等离子体激活液；6、直流电源。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前低温等离子体及等离子体激活液选择性抗肿瘤的具体机制仍不明确，临床上仅仅用于治疗基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑素瘤。

图1是本发明实施例提供的cap-dmem处理后皮肤肿瘤细胞形态变化图。

图2是本发明实施例提供的mtt法测cap-dmem对皮肤恶性肿瘤细胞代谢活力的抑制作用图。

图3annexinv/pi双染法cap-dmem对皮肤肿瘤细胞产生凋亡作用图。

如图4，本发明实施例提供的抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的低温等离子体激活液的制备方法为：

将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒可发射出等离子体射流；

利用低温等离子体装置所产生的等离子体射流处理无菌dmem适当时间(120s-300s)，获得低温等离子体激活后的dmem，即cap-dmem。

下面结合低温等离子体装置对本发明作进一步描述。

本发明利用低温等离子体装置处理无菌dmem，从而获得低温等离子体激活后的dmem，即cap-dmem。以下为主要装置及实施步骤：

1).低温等离子体激发装置

该发明使用的低温等离子体激发装置由一个圆柱形聚四氟乙烯桶作为绝缘外壳，内部并联放置数根专业细铜棒(直径为1mm)作为点阵电极连接直流高压脉冲电源，高压线连接一个适当大小的电阻，用来限制放电。(如下图5所示)

图中，低温等离子体激发装置包括：电阻1、细铜棒组合结构2、低温等离子体3、介电材料4、cap-dmem低温等离子体激活液5、直流电源6.

2).获取低温等离子体激活液步骤：

将地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒可发射出等离子体射流，等离子体射流处理dmem适当时间后即可获得低温等离子体激活液：cap-dmem。

下面结合具体实施例对本发明作进一步。

实施例1

1)将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒可发射出等离子体射流，等离子体射流处理120s后即可获得低温等离子体激活液：cap-dmem(120s)。

2)将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒可发射出等离子体射流，等离子体射流处理240s后即可获得低温等离子体激活液：cap-dmem(240s)。

3)将低温等离子体装置的地线插入无菌dmem中，接通电源后，细铜棒可发射出等离子体射流，等离子体射流处理300s后即可获得低温等离子体激活液：cap-dmem(300s)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。