含有帕马考昔和曲马多的用于治疗急性和慢性疼痛的药物组合物的制作方法

本发明涉及包括帕马考昔(polmacoxib)和曲马多(tramadol)的组合物，并且更特别地，涉及用于治疗急性或慢性疼痛的药物组合物，其含有用作非甾体抗炎剂的帕马考昔和作为基于阿片类(opioid)镇痛剂的曲马多，其显示出优异的稳定性和在低含量时的优异效果。
背景技术：
：疼痛定义为与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪体验，或以这种损伤来描述。它还可能是指通过由伤害感受器和神经纤维组成的神经通路刺激与大脑皮层和边缘系统区域接触的区域而引起的疼痛感和感觉损伤的感觉。可以说是在身体内部或外部传递异常的警告响应，作为保护身体的防御手段。由于疼痛本身不是疾病，因此消除疼痛并不能治愈引起疼痛的疾病。疼痛主要分为由躯体或内脏组织的损伤或发炎引起的知觉疼痛，以及神经损伤后发生的神经性疼痛。知觉疼痛可以包括皮肤痛、内脏痛、躯体痛、知觉神经痛、神经根相关痛、躯体相关痛等，并且神经性疼痛可以包括由于周围或中枢神经系统功能障碍引起的疼痛。如果疼痛持续很长时间或刺激过强，则可能会干扰日常生活并引起焦虑和恐惧。因此，患有慢性疼痛的人经常患有抑郁症，所以在治疗中应考虑这些特点。已知有许多药物可用于治疗疼痛。其中，阿片类(opioid)用作镇痛剂。吗啡(morphine)衍生物是减轻人类疼痛的治疗剂，其镇痛作用是通过吗啡受体(优选μ-阿片类受体(μ-opioidreceptor))的作用来实现的。曲马多是通过口服给药显示出良好效果的广泛使用的吗啡衍生物之一。曲马多是一种通过增强阿片类受体的激活和神经元中单胺突触的浓度来发挥作用的镇痛剂。具有化学名称2-(二甲氨基甲基)-1-(3-甲氧基苯基)环己醇的曲马多具有下式i的结构。[式i]曲马多通过附着到引起疼痛的μ-受体来抑制疼痛的疼痛抑制机理类似于某些麻醉镇痛剂。因此，长时间使用或注射曲马多可能导致药物依赖性。另外，作为曲马多副作用的常见症状，可能出现便秘、失眠和焦虑症状。另外，可能会出现其他副作用，诸如头晕、嗜睡、恶心等。因此，美国fda已将曲马多列为麻醉性镇痛剂，考虑到呼吸困难的风险，建议不要对12岁以下的儿童和哺乳期妇女开药。由于这个缺点，在治疗疼痛中用作镇痛剂的阿片类药物并不总是可以高剂量或重复使用。结果，为了减少引起这些副作用的阿片类的量，通常通过将阿片类与非阿片类镇痛剂的药物组合来提供。在这些组合中，已经报道了对组合了非甾体抗炎剂(nsaid)和曲马多的药物组合物的兴趣(欧洲专利公开no.0546676)。美国专利no.6,558,701描述了为了治疗中度至重度疼痛，国际卫生组织提出了阿片类镇痛剂和非甾体镇痛剂的组合，以表现出有效的疼痛缓解效果并减少所需的镇痛剂的给药量。作为增加cox-2选择性抑制剂的镇痛作用的替代，韩国专利no.10-0444195提到了cox-2选择性抑制剂和阿片类共同给药的协同作用。根据专利文献，对于相同的疼痛，与单独使用两种药物的情况相比，cox-2抑制剂和阿片类组合的情况下，镇痛活性提高，并剂量减少。因此，期望可以减少由每种药物引起的副作用的类型和程度。与曲马多待组合的nsaid之一是帕马考昔，目前它可以以acelex胶囊的名称商购获得，并且具有下式2表示的结构。[式2]用于本发明药物组合物中的活性成分帕马考昔的化合物名称是5-(4-(氨基磺酰基)-苯基)-2,2-二甲基-4-(3-氟苯基)-3(2h)-呋喃酮。它是cox-2的选择性抑制剂，并且与常规nsaid相比，具有降低的胃肠道毒性。已知其在炎性疾病、炎症相关疾病、疼痛、实体癌、血管生成相关疾病、阿尔茨海默氏病、癫痫和惊厥、中风或癫痫中有效(韩国专利10-0495389)。目前，对乙酰氨基酚(acetaminophen)和塞来昔布(celecoxib)已经开发为与曲马多结合。即使在少量的活性成分的情况下，上述帕马考昔也示出具有效果最大和副作用最小的优点。cox(环氧合酶)负责产生前列腺素(prostaglandin)。已鉴定出两种异构体(isoform)，即cox-1和cox-2。已经证明cox-2是由促炎性刺激诱导的，并且是一种酶异构体型，其被认为在疼痛、炎症和发热的前列腺素类(prostanoid)调节剂的合成中起主要作用。本发明旨在将具有这些作用的cox-2抑制剂帕马考昔和曲马多的组合应用于急性和慢性疼痛的治疗。本申请的重点在于药物组合物，在该药物组合物中帕马考昔和曲马多的组合可以在重度至中度疼痛，特别是与炎症相关的疼痛中获得额外的效果。技术实现要素：技术问题发明人已经注意到相比于现有产品，帕马考昔和曲马多的组合具有对疼痛的协同作用和优越的稳定性，并且因此旨在将两种不同的活性成分配制成单一剂型，以进一步提高服用每种药物的便利性。解决问题的方案本发明提供了包括帕马考昔和曲马多的用于治疗急性和慢性疼痛的药物组合物。根据一种实施方式，疼痛可以是神经性疼痛，包括糖尿病性神经病、癌症疼痛、骨关节炎、中度疼痛、类风湿性关节炎、脊椎炎或坐骨神经痛。根据一种实施方式，该组合物可以是具有双层结构的双层片剂的形式，其中，帕马考昔和曲马多被分离在各自层中。根据一种实施方式，该组合物还可以包括包衣基料。根据一种实施方式，该组合物可以是含有曲马多内芯和帕马考昔外芯的芯片制剂的形式，或者是含有在曲马多内层上的帕马考昔外包衣层的双重释放微包衣(drm)的形式。根据一种实施方式，帕马考昔与曲马多的比例可以是1:1至500的重量比。另外，帕马考昔与曲马多的比例可以是1:1至300的重量比。另外，帕马考昔与曲马多的比例可以是2:1至300的重量比。根据一种实施方式，该组合物还可以包括药学上可接受的载体。在下面的详细描述中包括了本发明的其他特定实施方式。发明效果在本发明中，帕马考昔和曲马多被配制成含有快速释放的帕马考昔和缓释的曲马多的单一剂型，其是一种组合，被设计成通过使剂型中每种药物之间的相互作用最小化而允许在每天仅一个或两个剂量的情况下每种药物的作用可以互补地和可持续地发挥。根据本发明的多层片剂适合于批量生产，这是由于其具有优异的颗粒流动性，具有适用于促进片剂包装、运输和处理的硬度，并且在制造过程中很少发生片剂的顶裂(capping)或腰裂(lamination)。附图说明图1至图12是示出了每个实施例的溶出模式的图。图13是示出了动物模型中重量变化的图。图14是示出了动物模型中的疼痛指数的图。图15是示出了动物模型中抗炎因子活性的图。图16和图17示出了组织病理学尸检结果。具体实施方式由于可以在本发明中进行各种修改和变化，因此在附图中示出了特定实施方式，并且将在具体实施方式中进行详细描述。然而，应当理解的是，本发明并不旨在限于特定的实施方式，而是包括落入本发明的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。在本发明的以下描述中，如果确定已知功能的详细描述可能使本发明的主旨不清楚，则将省略已知功能的详细描述。在下文中，将更详细地描述根据本发明实施方式的药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”可以与“药学组合物”和“药学上可接受的组合物”互换地描述，并且是指对待给药的受试者可以相对无毒并且具有无害的有效作用的任何无机或有机化合物制剂。另外，它可以指以下任何有机或无机化合物制剂：在其中由该组合物引起的副作用不会损害药物的功效，并且不会对待给药该化合物的受试者造成严重刺激并且不会损害该化合物的生物活性和性质。如本文所用，术语“待给药的受试者”可以与“待给药的个体”和“待给药的生物”互换使用，并且可以指遭受或可能遭受急性或慢性疼痛的包括人在内的任何动物。本发明提供了包括帕马考昔和曲马多的用于治疗急性和慢性疼痛的组合组合物。帕马考昔和曲马多的组合可具有降低活性成分变形的作用，从而增强在与其他药学上可接受的添加剂混合时抗随时间变化的稳定性。根据一种实施方式，在根据本发明的药物组合物中帕马考昔与曲马多的比例可以是1至500:1至500的重量比，例如1至300:1至100的重量比，例如1至2:1至300的重量比，例如，1:1至300的重量比，例如，2:1至300重量比。具体地，帕马考昔与曲马多的含量比可以为1:500，并且例如帕马考昔与曲马多的质量比可以为1:500。根据一种实施方式，基于组合物的总重量，组合物可以包括按重量计0.1至10％的帕马考昔和按重量计10至50％的曲马多，例如，按重量计0.3至1％的帕马考昔和按重量计20至40％的曲马多。根据一种实施方式，在组合物中，帕马考昔存在的量可以为1至5mg，例如1至2mg，并且曲马多存在的量可以为30至300mg，例如37.5至200mg。根据一种实施方式，本发明还可以包括药学上可接受的和生理上合适的添加剂。例如，在每种制剂中通常使用的任何药学上可接受的添加剂都可以用作添加剂，诸如填料、增量剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、缓冲剂、包衣剂、甜味剂、增溶剂、悬浮剂、着色剂、水溶性添加剂、赋形剂、载体、填料、助流剂、吸湿剂等。例如，基于组合物总重量，添加剂存在的量可以为按重量计5至90％，例如按重量计40至90％。根据一种实施方式，本发明可以分为帕马考昔隔室和曲马多隔室。具体地，帕马考昔隔室可以由硅化微晶纤维素、羟基乙酸淀粉钠、聚维酮或硬脂酸镁组成，但不限于此。例如，由于帕马考昔隔室中含有少量的活性成分，因此硅化微晶纤维素可以用作水不溶性聚合物，以提高药物在混合物中的混合均匀性并提高压片能力，但是本发明不限于此。另外，用于缓释的曲马多层可以由微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、二氧化硅或硬脂酸镁组成，但不限于此。通常，作为延迟药物释放的手段，可以使用纤维素衍生物，诸如，羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素，以及羧甲基纤维素钠或羧乙烯基聚合物，它们是凝胶形成物质，其可以通过用水不溶性物质包被药物或通过与水接触形成水凝胶来控制活性成分的释放。例如，曲马多层可以含有羟丙基甲基纤维素以实现缓释，但不限于此。根据一种实施方式，本发明还可以包括包衣基料，以确保光敏帕马考昔的长期稳定性。尽管可以使用常用的包衣基料，例如，包衣基料可以是选自由以下包衣基料组成的组的至少一种：该包衣基料包括聚乙烯醇衍生物、甲基丙烯酸衍生物和聚丙烯酸衍生物欧巴代和水溶性包衣基料中的羟丙基甲基纤维素(hpmc)，例如根据一种实施方式，根据本发明的组合物可以以口服剂型提供并且可以配制成固体或液体形式。特别地，根据本发明的组合物可以以任何方便的形式提供，诸如，以适于用水或其他合适的液体介质重构的片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂或粉剂的形式。例如，本发明的组合物可以以片剂的形式提供，诸如，单层和多层片剂，或者以双重释放微包衣(drm，dualreleasemicro-coating)的形式提供。根据一种实施方式，本发明的组合物可以是双重释放微包衣(drm)，其含有在曲马多内层上的帕马考昔外包衣层。另外，本发明的组合物可以配制成芯片制剂、双层片剂、多层片剂、单片剂、胶囊剂或混悬剂的形式。优选的是，将其物理上分成帕马考昔隔室和曲马多隔室，以便使帕马考昔隔室显示出快速的药物释放且曲马多隔室显示出持续的药物释放。例如，可以将其配制成具有分开的帕马考昔层和曲马多层的双层结构的双层片剂。双层结构的制造方法可以包括但不限于，用曲马多及其混合物颗粒剂形成下层并压缩，并且然后用帕马考昔和其混合物颗粒剂形成上层，并使用压片机进行压片。另外，其可以制备为含有曲马多内芯和帕马考昔外芯的芯片制剂。或者，根据本发明的组合物的最终制剂可以选自芯片制剂、胶囊剂或多层片剂，该芯片制剂包括由缓释隔室组成的内芯和由快速释放隔室组成的外层；该胶囊剂含有由缓释隔室组成的颗粒、小丸或片，和由快速释放隔室组成的颗粒、小丸或片；该多层片剂中，缓释隔室层和快速释放隔室层是层压的。根据一种实施方式，本发明可以显示出作为镇痛剂用于治疗疼痛(特别是急性疼痛和慢性疼痛)的有效效果。疼痛可以包括神经性疼痛，包括糖尿病性神经病、痛觉过敏、异常性疼痛、癌症疼痛和骨关节炎，以及重度至中度疼痛、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、坐骨神经痛和冻结肩。例如，本发明可用于治疗与炎症部分诸如类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、坐骨神经痛和冻结肩相关的重度至中度疼痛。根据本发明的药学组合物或药物组合物可以通过本领域技术人员已知的标准方法制备成适合于应用于人类(包括婴儿、儿童)和成年动物的任何形式。在下文中，将详细描述本发明的实施方式，以使本领域技术人员可以容易地实施本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式来实施，并且不应被解释为限于在本文中阐述的实施方式。实施例1将下表1中的作为主要成分的帕马考昔和曲马多与赋形剂组合、干燥、造粒、混合并压制成湿颗粒剂形式。帕马考昔层通过引用crystalgenomics现有产品的片剂处方进行，而处方研究的重点是显示缓释的曲马多层。对于实施例1的曲马多层的初始缓释，使用hpmck100m(methoceltmk100mpremium羟丙基甲基纤维素,dowchemicalcompany)作为缓释剂来制备用于口服给药的双层片剂。[表1]实施例2为了降低最初的高释放量，除hpmck100m外，在后混合中加入作为缓释剂的卡波姆(carbomer)以制备用于口服给药的双层片剂。[表2]实施例3在后混合中加入乙基纤维素(ethylcellulose)以制备用于口服给药的双层片剂。[表3]实施例4通过在造粒过程中增加粘合剂的含量而不是在后混合中增加缓释剂的含量来增加赋形剂之间的结合力。增加作为粘合剂的pvpk-30的含量以制备用于口服给药的双层片剂。[表4]实施例5如下表5所示降低了曲马多层的目标剂量以制备用于口服给药的双层片剂。[表5]实施例6如下表6所示，将低分子hpmc用作缓释剂以制备用于口服给药的双层片剂。[表6]实施例7以表7所示的量添加了具有不同分子量的三种hpmc，以制备用于口服给药的双层片剂。[表7]实施例8增加hpmck100m的含量比以制备用于口服给药的双层片剂。[表8]实施例9将另一种缓释剂peo(polyoxtmwsr,dowchemicalcompany)与hpmck100m一起添加以制备用于口服给药的双层片剂。[表9]实施例10考虑到压片性能，去除peo并降低hpmc含量以制备用于口服给药的双层片剂。[表10]实施例11由于帕马考昔层的质量低于曲马多层的质量，因此在层之间出现了含量不均。为了防止这种现象，将帕马考昔层中赋形剂的量增加两倍，以制备用于口服给药的双层片剂。[表11]实施例12至14在以与实施例11相同的方式制备制剂之后，为了根据用于口服给药的双层片剂的硬度确认释放变化的模式，制备了制剂以使片剂具有的硬度分别为7、10和13kp。实施例15制备了含有150mg曲马多和2mg帕马考昔的片剂组合物，以开发用于每天两次(一日两次，bisindie，bid)给药的片剂，并且同时用于开发每天四次(一日四次，quaquedie，qd)给药的片剂。如实施例11形成薄层那样，bid片剂中的帕马考昔快速释放层的总重量为99mg的情况下，在制造期间有可能产生诸如质量偏差和含量不均的问题。因此，将快速释放层的量增加至两倍以制备用于口服给药的双层片剂。[表12]实施例16实施例15中的溶出率高于参考药物，并且因此在后混合中将卡波姆71g替换为卡波姆974p作为缓释剂以制备组合物。由于卡波姆974p具有的颗粒流动性低于卡波姆71g，但显示出高的缓释性能，因此考虑到流动性，以适当的量添加卡波姆974p以制备组合物。[表13]实施例17尽管实施例16的溶出率接近参考药物，但是在组合物的生产中卡波姆的流动性不好，并且存在质量偏差和生产困难。因此，加入另一种缓释剂peo以制备组合物。[表14]实施例18和19为了降低实施例17中的高溶出率，去除了peo并添加了高分子量的hpmck200m和hpmck100mcr以制备组合物。[表15][表16]实施例20为了降低溶出率，添加了硬化植物油和hpmck200m以制备组合物。[表17]实施例21和22根据以上实施例的溶出结果，选择显示出最接近参考药物溶出率的卡波姆作为缓释剂，并将卡波姆添加至造粒和后混合中以制备组合物。考虑到流动性，在后混合中添加适当量的卡波姆以制备组合物。在相同组合物的情况下，在实施例21中将片剂制备成圆形冲压形式，并且在实施例22中将片剂制成矩形冲压形式，以便根据片剂的形状比较溶出率的差异。[表18]实验例1：溶出评价根据下表19的溶出测试方法进行溶出评价，以评价根据实施例的制剂的溶出性质。作为对照组，在比较例1中使用ultracet缓释片剂(janssenkorea，ltd.，ultraceter片剂，ulceceter片剂.对乙酰氨基酚650mg，盐酸曲马多75mg)，在比较例2中使用acelex片剂(crystalgenomics，acelex片剂，2mg-帕马考昔)，并且在比较例3中使用zytramxl(mundipharmakorea，zytramxl缓释片剂，盐酸曲马多150mg)。[表19]实施例1至4的溶出评价结果在表20和图1中示出，其中，溶出率的单位为％。[表20]实施例5中的曲马多层的溶出评价结果在表21和图2中示出，并且实施例5中的帕马考昔层的溶出评价结果在表22和图3中示出，其中，溶出率的单位为％。[表21]0hr4hr6hr12hr16hr比较例1072.988.6102.2101.8实施例5063.278.499.1103.4[表22]0hr5hr10hr15hr30hr45hr60hr比较例2037.252.863.475.182.789.4实施例5023.53849.867.375.980.4实施例6至9的溶出评价结果在表23和图4中示出，其中，溶出率的单位为％。[表23]0hr2hr4hr6hr8hr12hr16hr实施例6059.184.899.8101.8102.3102.7实施例7059.786.698.7105.6105.8106.4实施例8041.76277.186.996.599.6实施例9043.466.482.291.9100.2101.2比较例1049.569.382.992.7102.8103.1实施例10和11的溶出评价结果在表24和图5中示出。如图5所示，确认了实施例10表现出与比较例1类似的溶出模式。另外，根据实施例10的ph的溶出结果在表25和图6中示出。溶出率的单位为％。[表24][表25]实施例12至14的溶出评价结果在表26和图7中示出，其中，溶出率的单位为％。[表26]实施例15至21和比较例3的溶出评价结果在表27和图8中示出，其中，溶出率的单位为％。[表27]实施例22的溶出评价结果在表28和图9中示出，其中，溶出率的单位为％。[表28]实施例22和比较例3的在ph6.8和ph4.0以及ph水时的溶出评价结果在表29和图10至图12中示出，其中，溶出率的单位为％。[表29]实验例2：评价对骨关节炎的治疗效果为了评价对骨关节炎的治疗效果，在spraguedawley大鼠中制备了骨关节炎动物模型(每组n＝10)。1)将碘乙酸单钠(mia，i2512，sigma，poole，uk)以60mg/ml的浓度溶于0.9％无菌注射用盐水中，并在实验当天(第0天)制备。2)分组后，将动物(spraguedawley大鼠)置于麻醉室(matrix，us/vme-2)中，并用二乙醚进行麻醉。此后，使用胰岛素注射器(bdtm胰岛素注射器，带有ultra-finetm短针，31针规)，经由髌骨韧带(patellartendon)向诱导组(g2至g9)受试者的左膝关节间隙以50μlmia/每个受试者(mia3mg/头)进行一次注射。每组中的动物数为10只，并且阴性对照组(g1)在左膝关节的相同位置注射50μl盐水(saline)一次。仅对在适应期间被确认没有检疫异常的动物进行分组，然后给予mia。在给予mia后的第6天，测量了总共100名给予了mia的受试者的后腿负重(weightbearing)，并依次排除左后腿负重高的受影响的受试者，以选择70名受试者。选择的受试者被随机分组以具有均匀的体重负荷和体重的分布。分组完成后，在每个饲养箱上贴一张个体识别卡(包括测试名称、测试组、个体编号、性别、测试开始日期等)。将它们分为总共七个组，并且每个组的详细说明在下表30中示出。[表30]在表30中，在g6和g7组中，帕马考昔和盐酸曲马多的含量比设定为1:100，并且g7组中的剂量是g6组的1.5倍高。也就是说，在g6组中，给药了0.2mg/kg帕马考昔和20mg/kg盐酸曲马多，并且在g7组中，给药了0.3mg/kg帕马考昔和30mg/kg盐酸曲马多。每个组的具体给药信息如下：g1：正常组，在测试期间不给药任何物质g2：诱导组，在测试期间不给药任何物质g3：对乙酰氨基酚300mg/kg+盐酸曲马多30mg/kgg4：帕马考昔0.3mg/kgg5：盐酸曲马多30mg/kgg6：帕马考昔0.2mg/kg+盐酸曲马多20mg/kgg7：帕马考昔0.3mg/kg+盐酸曲马多30mg/kg.每组每天以3ml口服给药一次，持续3周。测试开始时每组的平均重量范围为332.58±22.92g至335.93±25.62g，并且重量变化的测量结果在图8中示出。3周后，在测试结束时每组的平均重量为378.38±40.03g至415.26±30.11g，具体地，与测试开始时每组的平均重量比较，g1(20.5％)、g2(24.5％)、g3(13.8％)、g4(24.4％)、g5(18.5％)、g6(18.6％)和g7(18.4％)，这表明重量增加了约13.8％至24.5％。对于3周的重量变化，测试组与正常组g1相比无显著差异。然而，g3组显示出最慢的重量增加以及在禁食后第21天和尸检之前明显的重量损失(图13)。在所有测试组中，在测试期间未观察到与给药测试物质相关的临床症状或死亡。实验例3：镇痛效果的评价为了评估镇痛效果，使用动态足底触觉测量器(ugobasiles.r.l，意大利)测量撤足阈值(pwt，g)。本实验中使用的冯·弗雷(vonfrey)丝在弯曲期间具有恒定的压力，从而赋予恒定的刺激。此时，物理异常性疼痛表现为回避反应，从而能够量化疼痛指数。1)通过用冯·弗雷丝进行物理刺激，使用动态足底触觉测量器(ugobasiles.r.l，意大利)来测量疼痛抑制效果。2)将大鼠分别放在每个丙烯酸树脂笼中，让其留置15分钟以适应新环境。3)适应后，将触觉测量器设定为g和s。通过刺激受影响的足部的底部，逐渐增加力(0–50g)，并测量后撤足阈值(当测试体回避刺激时的力：克)，一式三份，以5min为间隔，来测量由刺激器的刺激引起的异常性疼痛。4)在给药测试药物后的2周(第10天)和3周(第17天)内的固定时间一式两份地测量撤足阈值(pwt)。测量结果在图14中示出。通过使用动态足底触觉测量器观察身体上发展的异常性疼痛后的回避反应的结果，发现在3周的评估期期间回避反应的刺激强度的变化为：阴性对照组g1为32.1～39.5g，而诱导组g2为10.5～18.9g，这表明维持了机械阈值的显著降低(图14)。与g2组相比，发现在所有测试组中，撤足阈值均增加。通过10天评估，发现阳性对照组g3(对乙酰氨基酚和曲马多共同给药)、g4(帕马考昔单独给药)和g5(盐酸曲马多单独给药)组的撤足阈值分别为30.3g、24.2g和26.3g，并且共同给药组g6和g7的撤足阈值分别为25.5g和29.59g。也就是说，与显示出14.7gpwt的诱导组g2相比，所有治疗组均显示出撤足阈值显著增加(p<0.05)。根据撤足阈值(pwt)的评估，阳性对照组g3，盐酸曲马多单独给药组g5，共同给药组g6和g7分别显示出30.0g、26.3g、26.2g和31.8g，并且帕马考昔单独给药组g4显示出4.2g，这表明与诱导组g2相比具有显著增加(p<0.05)。在该评估中，发现在抗机械异常性疼痛的镇痛功效方面，高剂量帕马考昔和盐酸曲马多共同给药组g7的撤足阈值倾向于比低剂量组g6增加的更多。试验组的平均撤足阈值在阳性对照组g3与高剂量帕马考昔和盐酸曲马多共同给药组g7之间类似，有望显示出类似的镇痛作用。g6组(帕马考昔0.2mg/kg+曲马多20mg/kg)显示出的疼痛缓解效果与单独使用曲马多(30mg/kg)类似，尽管曲马多的量减少了1/3。结果是，有望降低长期使用曲马会产生的副作用和成瘾的风险。实验例4：抗炎效果的评价基质金属蛋白酶(mmp)负责正常生理环境中细胞底物的受控降解。据报道，在其作用不受控制并过度表达的情况下，它是通过细胞底物组分的大量降解而引起组织损伤的一个因素。在本研究中，所有治疗组在治疗3周后获得的血清中mmp-3活性成分的水平均低于诱导组(g2)。在治疗组的比较中，帕马考昔组和帕马考昔+曲马多组合组显示出的mmp-3水平低于g3和g5组。由此，可以期望作为有效的消炎药的帕马考昔能够抑制分解代谢因子(mmp-3)的活性，并且因此抑制关节损伤，从而对疼痛缓解产生协同作用(图15)。总之，与对乙酰氨基酚+曲马多的组合或单独的曲马多作为参考药物相比，帕马考昔和曲马多的组合可以作为优异的疼痛治疗剂，其具有优异的疼痛缓解效果和抗炎作用，并且具有的副作用极低。实验例5：组织学评价将组织切片染色用于进行组织学评价。1)将分离器官中的肝和胃组织充分固定在10％中性福尔马林缓冲溶液中，然后进行常规组织处理程序，诸如修剪、脱水和石蜡包埋，以制备组织切片并将其切成约4μm。之后，将它们用苏木精&伊红(h&e)染色并进行显微镜检查。2)将收集的膝关节组织固定在10％福尔马林中24小时，并在组织处理前脱钙72小时同时以24小时的时间间隔用10％甲酸更换溶液。通过冠状切片来制备膝关节的矢状切面，从而可以很好地识别股骨和胫骨的内侧和外侧踝关节表面。3)随后，在常规的组织处理程序(诸如，脱水、清理和穿透)之后，进行石蜡包埋，并用旋转切片机制备了5μm的膝关节薄片。对其进行脱蜡和水合，然后进行苏木精&伊红(h&e)染色。4)为了进行番红o-快速绿(sofg)染色，在脱蜡和水合后，将膝关节薄片在weigert的苏木精铁溶液(ht110232，sigma，stlouis，美国)中反应10分钟，并用水洗涤，并且然后在0.02％的快速绿(fcf)溶液(f7258,sigma,stlouis，美国)中染色5分钟。随后，使其在1％乙酸溶液中反应，并且然后用0.1％番红o溶液(s2255，sigma，st.louis)进行染色。将通过番红o-快速绿染色的载玻片洗涤5分钟以具有清晰的核颜色。脱水并澄清后，将其密封。5)为了观察软骨和骨骼的破坏、关节软骨的损伤和组织病理学变化并评估退行性关节炎的发展，采用以下mankin评分(最高＝19)对关节软骨的表面损伤程度和番红o染色程度进行分类和数字化。对骨关节炎病变进行组织病理学评分的标准-改良mankin评分系统变量评分(max19)表面0＝完整的表面1＝表面裂缝2＝至中部的表面裂缝3＝至深部的表面裂缝4＝完全破坏细胞过少度0＝完整1＝软骨细胞轻度减少2＝软骨细胞中度减少3＝软骨细胞重度减少4＝无细胞克隆/骨赘形成0＝正常1＝偶尔双重(duos)2＝双重或三重(trios)3＝多个巢状细胞番红o的染色强度0＝正常1＝轻度减少2＝中度减少3＝重度减少4＝没有发现颜色结构0＝正常1＝糜烂<15％表面2＝糜烂<50％表面3＝溃疡<75％表面4＝溃疡≥75％表面mankin评分是每个指数的总和。6)为了确认各个样品对治疗部位以外的部位的影响，在尸检后进行了总体观察。结果在图15和图16中示出。如图15所示，根据实验完成后的总体尸检观察，阴性对照组g1和帕马考昔单独给药组g4中均未识别出异常的异常发现，而在阳性对照组g3中识别出5例胃壁增厚，4例胃粘膜点状出血，3例胃粘膜充血和1例胃溃疡，显示出明显的体重损失，其被认为是治疗组中异常发生率最高的组。在曲马多单独给药组g5中，识别出1例肝表面结节，3例胃壁增厚和3例胃粘膜点状出血。在高剂量帕马考昔和盐酸曲马多共同给药组g7中识别出2例胃粘膜点状出血。如图16所示，根据组织病理学发现，在阳性对照组g3中观察到4例轻度水平的贲门腺上皮脱离，与阳性对照组g3类似在泊曲昔单独给药组g4中观察到4例轻度水平的贲门腺上皮脱离，并且在盐酸曲马多单独给药组g5中发现2例贲门腺上皮脱离以及4例贲门腺和胃底腺糜烂(erosion)。与阴性对照组g1相同，在高剂量帕马考昔和曲马多共同给药组g7中未观察到异常发现。根据肝脏组织学检查，在阴性对照组g1中，在中央静脉周围的肝细胞保持了正常的小叶结构，而放射状肝细胞索(hepaticcellcords)和血窦显示了朝向肝小叶边缘的索状排列。所有测试组均表现出与阴性对照组g1类似的结果，表明没有与测试药物的给药相关的特定异常。总之，与每种物质单独给药相比，测试物质帕马考昔和盐酸曲马多的共同给药缓解了mia诱导的骨关节炎大鼠(rat)模型的疼痛。它使得受影响的后腿的使用增加。因此，具有改善重量分布比例和缓解机械异常性疼痛的知觉超敏性的协同作用。通常发现与阳性对照组g3(对乙酰氨基酚和盐酸曲马多共同给药)相比，帕马考昔和盐酸曲马多共同给药组g6和g7具有类似或更佳的镇痛效果。另外，在组织学评价中，在所有测试组中，关节表面的损伤程度、软骨细胞的减少和糖胺聚糖(glycosaminoglycan)的减少都类似。然而，对于软骨细胞的簇(cluster)形成——损伤的另一个指标，与阳性对照组g3(对乙酰氨基酚和曲马多共同给药)相比，盐酸曲马多单独给药组g5和帕马考昔和盐酸曲马多共同给药组g6和g7显示出改善的作用。根据胃组织分析结果，在帕马考昔单独给药组g4中观察到幽门的上皮脱离，并且在曲马多单独给药组g5中观察到贲门和幽门的上皮脱离以及糜烂，这表明胃部刺激。在这些测试条件下的碘乙酸单钠(mia)骨关节炎大鼠模型中，证实了与阳性对照组g3(对乙酰氨基酚和盐酸曲马多共同给药)相比，帕马考昔和盐酸曲马多共同给药组g6和g7表现出同等的镇痛效果，而没有胃部刺激。以上描述仅是本发明技术思想的说明，并且本领域技术人员可以在不脱离本发明基本特征的情况下进行各种修改和变化。另外，本发明中公开的实施方式并不旨在限制本发明的技术思想，而是用于描述本发明，并且本发明的技术思想的范围不受这些实施方式的限制。本发明的保护范围应该由所附的权利要求书来解释，并且与之等效的范围内的所有技术思想都应解释为包括在本发明的范围内。当前第1页1 2 3