细胞表面锚定抗原治疗癌症的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请声明对于2017年4月7日提交的美国临时专利申请62,482,982的优先权享有优先权。之前申请的整个信息披露被认为是即时申请信息披露的一部分，而在此引用。

本公开内容提供了细胞表面锚定抗原缀合物，包含细胞表面锚定抗原缀合物的组合和制剂以及使用其治疗癌症的方法。

背景信息

在过去的十年中，美国食品和药物管理局(usfoodanddrugadministration)已批准了多种检查点抑制剂用于治疗各种癌症。检查点抑制剂通过暴露免疫系统中隐藏的癌细胞而发挥作用。癌细胞通过在某些检查点发送信号指示其无害，从而欺骗免疫细胞。如果不是这些检查点，则t细胞会攻击健康细胞。免疫疗法药物会破坏癌细胞的信号，使其暴露于免疫系统中进行攻击。

研究人员继续寻找用于治疗肿瘤的新药及其与其他已知检查点抑制剂药物的组合，因为需要改善对乳腺癌，胃癌和其他晚期癌症患者的治疗结果。

总结

本公开内容涉及通过治疗和/或抑制患者肿瘤来治疗癌症的化合物，组合物和方法。在某些实施方案中，提供了细胞表面锚定抗原缀合物，其包含至少一种抗原以共价键合至3β-胆固醇胺，或其类似物或衍生物，任选地通过接头。还提供了药物组合物，其包含细胞表面锚定抗原缀合物，例如但不限于本文所述的那些，以及toll样受体(tlr)激动剂。合适的toll样受体(tlr)激动剂包括但不限于cpgodn(cpg寡聚脱氧核苷酸)，多肌苷酸：聚胞苷酸(polyic)，咪喹莫特(imiquimod)等，或其混合物。

在某些实施方案中，本公开内容涉及治疗和/或抑制肿瘤及其转移的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物或药物组合物。

附图说明

本公开的某些方面可以通过附图来查看。包括以下内容：

图1显示了示例性缀合物。其中图a显示了α-gal-胆固醇胺缀合物。b图显示了含有叶酸的l-鼠李糖-胆固醇胺缀合物。

图2显示用于细胞表面锚定抗原缀合物的示例性抗原。

图3显示出了用于缀合物的3β-胆固醇胺，含有3β-胆固醇胺的组成部分，及其衍生物的实例。

图4显示了细胞表面锚定抗原缀合物的示例性结构。

图5显示了细胞表面锚定抗原缀合物的其他示例性结构。

图6显示了用于细胞表面锚定抗原缀合物的示例性脂质部分。

图7显示了细胞表面锚定抗原缀合物的额外的示例性结构。

具体发明描述

应该理解的是，本公开不限于所描述的特定实施例，因为它可以多形式变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本发明，本公开的范围可由所附权利要求限制。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如本文所用，以下术语具有以下含义。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“佐剂”包括多种佐剂。

如本文所用，术语“包括”旨在表示所述组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应表示排除对于所述目的而言对组合具有任何实质意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物将不排除不会实质上影响要求保护的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由...组成”是指排除多于其他成分中痕量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案在本公开的范围内。

当在诸如温度，时间，数量和浓度的数字名称之前使用术语“约”时，包括范围在内，其表示近似值可以相差(+)或(-)10％，5％或1％。

如本文所用，术语“治疗”是指预防，治愈，逆转，减轻，减轻，最小化，抑制，抑制和/或中止疾病或病症，包括其一种或多种临床症状。

如本文所用，术语“组合物”是指适合于出于治疗目的而向目标患者给药的制备物，其包含至少一种药物活性成分，包括其任何固体形式。在某些实施方案中，组合物被配制成可注射制剂。在某些实施方案中，将组合物配制为膜，凝胶，贴剂或液体溶液。如本文所用，术语局部地是指非全身系统性地将组合物施用于要治疗的组织(例如，肿瘤)和/或器官(内部或在某些情况下，外部；通过导管)的表面，用于产生局部效应。

如本文所用，术语“药学上可接受的”表示考虑到要治疗的疾病或病症以及相应的疾病，所指示的材料不具有会导致合理谨慎的医生避免将该材料施用于患者的性质以及给药途径。例如，通常需要这种材料基本上是无菌的。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或承载物，例如液体或固体填充剂，稀释剂，辅料，赋形剂，溶剂或包囊材料，其参与或递送任何补充剂或组合物或组分，从一个器官或身体的一部分到另一器官或身体的一部分，或将药剂递送至所需组织或与所需组织相邻的组织。

如本文所用，术语“经配制”或“制剂”是指其中将包括一种或多种药物活性成分的不同化学物质组合以产生剂型的过程。在某些实施方案中，可以将两种或更多种药物活性成分共配制为单一剂型或组合剂量单位，或分别配制并随后组合为组合剂量单位。持续释放制剂是被设计为在延长的时间段内在体内缓慢释放治疗剂的缓释制剂，而速释制剂是被设计为在较短的时间段内在体内快速释放治疗剂的制剂。

如本文所用，术语“递送”是指用于根据需要在体内安全地实现其所需治疗效果的运输药物组合物的方法，制剂，技术和系统。在一些实施方案中，将有效量的组合物配制为用于肿瘤内注射到患者体内(又称肿瘤内递送，瘤内给药，瘤内注射)。

如本文所用，术语“溶液”是指本领域众所周知的溶液，悬浮液，乳剂，滴剂，软膏剂，洗液，喷雾剂，脂质体。在一些实施方案中，液体溶液为包含ph缓冲剂的水溶液，当添加少量的酸或碱时，该ph缓冲剂抵抗ph的变化。在某些实施方案中，液体溶液包含润滑性增强剂。

如本文所用，术语“ph缓冲剂”是指当向其添加少量酸或碱时抵抗ph变化的缓冲水溶液。ph缓冲溶液通常包含弱酸及其共轭碱的混合物，反之亦然。例如，ph缓冲溶液可包含磷酸盐，例如磷酸钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钠二水合物，磷酸氢二钠，磷酸氢二钠十二水合物，磷酸钾，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾；硼酸和硼酸盐，例如硼酸钠和硼酸钾；柠檬酸和柠檬酸盐，例如柠檬酸钠和柠檬酸二钠；乙酸盐，例如乙酸钠和乙酸钾；ph调节剂可以包括例如酸，例如盐酸，乳酸，柠檬酸，磷酸和乙酸，以及碱性碱，例如氢氧化钠，氢氧化钾，在一些实施方案中，ph缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液(即，包含磷酸钠，氯化钠，并且在某些制剂中，包含氯化钾和磷酸钾)。

化合物

本文披露的是包括3β-胆固醇胺(3β-cholesterylamine)的细胞表面锚定抗原缀合物，或它的类似物或衍生物，其中3β-胆固醇胺与至少一种抗原共价键合。细胞表面锚定抗原缀合物充当癌细胞裂解剂并增强肿瘤抗原呈递。3β-胆固醇胺是缀合物中的细胞表面锚定分子。在某些实施方案中，抗原通过接头与3β-胆固醇胺结合。预期其中描述的基于3β-胆固醇胺的细胞表面锚定抗原缀合物将比类似的基于脂肪酸的抗原缀合物表现出更长的细胞表面半衰期。在这些实施方案中，至少一种抗原通过胺基形成共价键与3β-胆固醇胺键合。

所述抗原缀合物中使用可以是任何抗原，在某些实施方案中，是患者体内的抗体的抗原分子或患者体内tcr(t细胞受体的t细胞的)的抗原分子，其被称为作为天然抗原。合适的天然抗原包括，但不限于，半乳糖α-1，3-半乳糖(galactose-alpha-1,3-galactose，简称α-gal)，l-鼠李糖(l-rhamnose)，福斯曼二糖(forssmandisaccharide)，磷酰胆碱(phosphorylcholine，简称pc)，dnp(dinitrophenyl)或其组合物。内源性抗-gal抗体与α-gal表位结合，在人体内含量很高，约占血清总抗体的1％，这是由胃肠道中微生物的α-gal抗原刺激产生的。天然的α-gal免疫在异种移植排斥中起关键作用。l-鼠李糖抗原是α-gal的替代物，也可用于本文公开的细胞表面锚定抗原缀合物中。内源性抗l-鼠李糖抗体在人类中含量很高而且具有具有很高的亲和力。

在一些实施方案中，本发明的细胞表面锚定抗原缀合物具有以下结构式，其为天然抗原通过任选的接头与细胞表面锚定分子的缀合物：

天然抗原-任选的接头-细胞表面锚定分子

适于掺入细胞表面锚定抗原缀合物的α-gal天然抗原的示例可以从文献中发现和转用(例如参见美国专利申请us2010/0145015，美国专利us7820628，世界专利申请wo2015/170121，美国专利8,440,198，论文oncoimmunology,2013jan1；2(1):e22449；论文anticancerres.2012sep；32(9):3861-8；论文cancerimmunolimmunother.2016；65(8):897-907)。适于掺入细胞表面锚定抗原缀合物的l-鼠李糖天然抗原的示例可以从文献中发现和转用(例如参见美国专利申请us2014/0112975；论文chembiochem.2014；15(10):1393-8；论文acschembiol.2011；6(2):185-91；论文acschembiol.2016；11(5):1205-9)。适于掺入细胞表面锚定抗原缀合物的所述galnac-r(1,3)-galnac(福斯曼二糖)天然抗原的示例可以从文献中发现和转用(例如美国专利申请us2013/0149331)。适于掺入细胞表面锚定抗原缀合物的磷酸胆碱(pc)天然抗原的示例可以从文献中发现和转用(例如论文acschem.biol.2013,8,2404-2411中所描述)。这些天然抗原的示例参见图2。

描述于文献中的α-半乳糖脂质缀合物或l-鼠李糖脂质缀合物也可作为本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物，与免疫功能增强剂类型的组合物共注射入肿瘤或共配制为剂型进行瘤内注射或以其他途径给药。

除了α-gal，l-鼠李糖，福斯曼二糖和磷酰胆碱(pc)，其它具有t细胞免疫活性或b细胞免疫活性的抗原可以也可使用于细胞表面锚定抗原缀合物，其可以是内源性的或由疫苗诱导。另一内源性抗原的实例是二硝基苯基(dinitrophenyl，简称dnp)。诱导抗体或抗原特异性效应t细胞可由疫苗接种来生成。例如，大多数新出生的幼儿接收抗结核疫苗bcg，口服脊髓灰质炎病毒疫苗(opv)和抗b型肝炎疫苗(乙肝疫苗)导致针对这些抗原的b细胞或t细胞免疫。可以使用这些抗原来制备缀合物。在实践中，患者可首先测试其抗原的反应性然后就可以选择具有较强的b细胞免疫活性或t细胞免疫活性的抗原制备缀合物。患者然后可以被给以个体化的缀合物来治疗特定疾病(例如癌症或自身免疫疾病)。人们也可以给患者注入一个针对特定抗原的疫苗(例如将特定非天然肽抗原缀合到血蓝蛋白klh，与增强剂一起给药)，以允许患者产生针对该抗原的b细胞免疫活性或t细胞免疫活性，然后使用该抗原来制备本文所述的缀合物用于疾病治疗。利用天然免疫力的另一个例子是使用血型抗原代替α-gal来构建缀合物(例如，abo抗原)。例如，对于具有血型a患者，所述缀合物可利用的b抗原；对于具有患者血液型为b的个体，共轭物可利用的a抗原；对于血型为o的患者，结合物可以利用a或b抗原或其组合。t细胞抗原可以是mhc肽复合物的形式。当使用含α-gal的结合物治疗癌症时，可以给患者接种一种疫苗，该疫苗可以在治疗之前和/或期间诱导/增加抗α-gal抗体的产生/功效(例如给与患者α-gal与klh的缀合物，以及疫苗增强剂)。这将增加抗α-gal抗体的产生并增加抗体的亲和力/效力。此疫苗接种策略也可用于在本文所述的方法，在治疗之前到或在治疗过程中使用其他天然抗原如l-鼠李糖或二硝基苯招募内源性抗体以治疗疾病和增强相应抗体效力。

在某些实施方案中，本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物包含一个以上的抗原，其可以是一个以上相同或不同抗原的组合。一个可任选的接头或空间间隔子可以被用于将抗原连接到细胞表面锚定分子。在这样的实施方案中，接头(又称连接子)可以是线状的或分支结构的。在某些实施方案中，接头是分子量小于约1500的肽或含聚乙二醇的组成。在某些实施方案中，接头包含含有一个或多个lys，arg或其他带正电荷氨基酸的氨基酸或多肽序列。在某些实施方案中，缀合物中的胆固醇胺的胺可以被转化为季铵。

图3显示了用于缀合物的3β-胆固醇胺，含3β-胆固醇胺的组成部分及其衍生物或类似物的实例。示例性衍生物包括但不限于其胺基可被直链或支链烷基或烯基或含1至30个碳的炔基或芳基取代的化合物，例如甲基，乙基或其他低级烷基(例如图3中的r，r1，r2)。胆固醇胺还可以进一步缀合于含有正电荷的组成部分，如精氨酸。胆固醇胺的双键烯基-c＝c-基团还可以被饱和烷基-c-c-基团取代，导致一个胆甾烷衍生物。在一些实施方案中，胆固醇胺可以被3-氨基三萜类取代，包括胆甾烷，胆甾二烯和胆甾烯。此外，可以预期的是，胆固醇胺的3-胺基可以是α或β构型。

示例性的细胞表面锚定抗原缀合物包括α半乳糖-胆固醇胺，l-鼠李糖-胆固醇胺，α-gal-连接子-胆固醇胺，l-鼠李糖-连接子-胆固醇胺，l-鼠李糖的低聚物-连接子(可任选的)-胆固醇胺，α-gal的低聚物-连接子(可任选的)-胆固醇胺，福斯曼二糖-连接体(可任选的)-胆固醇胺，α-gal-连接子-胆固醇胺-l-鼠李糖。用于连接基于碳水化合物的天然抗原的键优选为糖苷键，例如s-，n-，c-和o-糖苷键(如图4所示)。图4还显示了示例性的基于α-gal的缀合物设计：α-半乳糖-(可选的接头)-胆固醇胺，这将使其与内源性抗α-gal抗体结合，从而消除锚定的细胞。

可以将多于一个单位的天然抗原，多于一种类型的天然抗原和多于一个单位的细胞表面锚定分子(例如胆固醇胺)掺入缀合物中(图4)。它们在缀合物中可以是单体形式或低聚物形式。如图4所示，它们也可以缀合至可溶性聚合物主链(例如葡聚糖，多肽，聚丙烯酸或其类似物)。

如前所述，其它内源性抗原如福斯曼二糖，磷酰胆碱(pc)，dnp(dinitrophenyl)也可用于制备缀合物。示例如图5所示。

所述缀合物中细胞表面锚定分子部分也可以包括胆固醇胺外的其它化合物，如脂质分子和细胞表面锚定肽。适合于使用在细胞表面锚定抗原缀合物的脂质分子的例子包括磷脂，甘油脂，甘油磷脂，鞘脂，神经酰胺，glycerophosphoethanolamine，甾醇或类固醇。在某些实施方案中，细胞表面锚定分子是阳离子脂质，其中缀合位置在含有仲，叔或季胺基的阳离子末端。图5、6显示了细胞表面锚定分子/部分的其他实例。在某些实施方案中，鼠李糖脂包括铜绿假单胞菌或其他微生物所产生的单鼠李糖脂和二鼠李糖脂，α-半乳糖神经酰胺(α-galcer)，α-葡糖神经酰胺(α-glccer)，α-glucuronylceramide，α-galacturonylceramide，及其类似物/衍生物也可使用作为癌细胞裂解剂。所述α-半乳糖神经酰胺(α-galcer)，α-葡糖神经酰胺(α-glccer)，α-glucuronylceramide和α-galacturonylceramide是t细胞抗原。

所述缀合物还可以包括癌细胞结合结构域以增加其靶向癌细胞，这将允许静脉内(iv)注射，而不用瘤内注射。叶酸和rgd肽/拟肽等癌细胞小分子配体可用于癌症靶向(例如描述于论文currmedchem.2014；21(14):1618-30；currentpharmaceuticaldesign16(9):1040-54和journalofaminoacids,volume2012(2012)中的)。可以将叶酸或rgd肽(arginylglycylasparticacid)掺入缀合物中以增加癌症靶向性。多价策略和affimer型亲和配体也可以使用。因此，在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物包含癌细胞结合结构域，例如叶酸，rgd肽，rgd拟肽或tgf-α，gnrh，egfr或vegf拮抗剂。实例包括α-gal-(任选的接头)-egf，α-gal-(任选的接头)-vegf，α-gal-(任选的接头)-tgf-α，α-gal-gnrh。可与egfr或vegfr结合而不激活它们的亲和配体，例如egfr或vegf拮抗剂，可用于制备缀合物。例如，decorin，vegf165b，或如描述在专利申请pct/ca2010/000275中的vegf拮抗剂可以用来代替可活化vegfr血管生成的天然vegf，以制备缀合物。在其他天然抗原缀合物，如l－鼠李糖，与肽/蛋白质/小分子(例如叶酸，vegf或它们的衍生物/模拟物如vegf165b)中也在此提供。实例包括叶酸-可任选的接头-α-gal，vegf165b-可任选的接头-α-gal，vegf-可任选的接头-α-gal，叶酸-可任选的接头-α-l-鼠李糖，vegf165b-可任选的接头-α-l-鼠李糖，vegf-可任选的接头-α-l-鼠李糖。在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物不包含脂质分子或胆固醇胺。其他示例在图7中显示。

配方

本发明还提供作为原位癌症疫苗促进针对癌细胞的强效免疫应答的组合物和制剂。在一个实施方案中，提供了药物组合物，包含一个细胞表面锚定抗原缀合物和一个免疫功能增强剂。适宜的免疫功能增强剂的实例包括模式识别受体(prr)配体，rig样受体(rlr)配体，nod样受体(nlr)配体，c型凝集素受体(clr)配体，和toll样受体配体诸如tlr3配体，tlr4配体，tlr5配体，tlr7/8配体，和tlr9配体，或它们的组合。免疫功能增强剂可以是疫苗佐剂。优选地，toll样受体配体是toll样受体(tlr)激动剂。示例性的toll样受体(tlr)激动剂包括但不限于cpg(cpgodn)，聚肌胞苷酸(polyic)，咪喹莫特(imiquimod)或其组合。对于这些制剂，细胞表面锚定抗原缀合物可以是本文以上描述的那些，或本领域已知的任何实例。例如。在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物包含抗原(例如，单糖或寡糖结构部分)共价结合至亲脂性的细胞表面锚定脂质，脂质可选自固醇，3β-胆固醇胺，胆固醇，脂肪酸，甘油三酯，磷脂，乙酰化或非乙酰化甘油，鞘脂，鞘氨醇，神经酰胺，甘油脂，甘油磷脂，甘油磷酸乙醇胺和类固醇。在某些实施方案中，单糖或寡糖部分是半乳糖-α-1，3-半乳糖(α-gal)，l-鼠李糖或福斯曼二糖。

在某些实施方案中，所述细胞表面锚定抗原缀合物包含下式的脂质结构部分：

其中x是化学键，-co-，-o-co-或-hnco-，其将脂质部分与抗原连接；

r²⁰为具有7-32个碳原子的烷基或烯基，其任选地被1-6个羟基取代；

r²¹为氢或烷基；

r²²和r²³独立地是氢或—co—r²⁴，其中r²⁴选自氢或具有1-6个碳原子的烷基，其任选地被1-6个羟基取代。

在其它实施方案中，脂质结构部分或分子中细胞膜锚定部分的一般结构，是一个阳离子脂质，其中所述缀合是连接在含有仲，叔或季胺基团阳离子端。图6显示了细胞膜锚定分子/部分(例如脂质)的其他实例。

其它的可以激活和/或增强免疫系统和免疫细胞(如apc，b细胞和t细胞)的功能的分子也可以加入制剂。适宜的免疫功能的活化和/或增强分子可以从以下选择：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(例如，沙格司亭或莫拉司亭)，刺激免疫的单克隆抗体(例如抗kir抗体诸如lirilumab，cd137抗体对如urelumab或utomilumab)，fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)，除了聚肌胞苷酸，cpg和咪喹莫特的其它模式识别受体激动剂，t细胞嗜性趋化因子，例如ccl2，ccl1，ccl22和ccl17，b细胞趋化因子如cxcl13，干扰素γ，i型ifn(例如ifn-α，ifn-β)，肿瘤坏死因子(tnf)-β，tnf-α，il-1，interleukin-2(il-2，如aldesleukin，teceleukin或bioleukin)，白介素10(il-10)，il-12，il-6，il-24，il-2，il-18，il-4，il-5，il-6，il-9和il-13或它们的衍生物(如peg化的衍生物)，cd1d配体，vα14/vβ8.2t细胞受体配体，inkt激动剂，α-半乳糖神经酰胺(α-galcer)，α-葡糖((α-glccer)，α-glucuronylceramide，α-半乳糖醛酸神经酰胺，异豆糖苷神经酰胺(igb3)和hs44。治疗有效量的这些试剂可以被添加到本文所描述的制剂，被用作肿瘤内注射。

可以预期的是如本文所述细胞表面锚定抗原缀合物，可以用治疗性抗体替换，其中包括单克隆抗体，双特异性抗体和抗体-药物偶联物。治疗性抗体的实例包括赫赛汀，利妥昔单抗，bexxar，西妥昔单抗，贝伐单抗，帕尼单抗，培妥珠单抗，kadcyla，卡妥索单抗，针对肿瘤表面抗原(如半乳糖胺-o-丝氨酸/苏氨酸(tn抗原)，半乳糖1-3galnac-o-ser/苏氨酸(核心-1抗原)，stf抗原和类似物)的抗体。使用的抗原不必具有高度的肿瘤特异性，因为可以将抗体注射到肿瘤中以达到高的局部浓度而有效。例如，针对抗体上皮细胞粘附分子(epcam)抗原可用于上皮和上皮来源的肿瘤细胞中尽管它也可以与其它正常上皮细胞结合。这些抗体或抗体-药物偶联物可被注入到实体肿瘤以裂解肿瘤细胞和/或改善所述抗原呈递，因此释放肿瘤新抗原，以促进免疫应答。优选地，这些分子和组合物与免疫功能增强剂一起注射到肿瘤内，任选地还包括唾液酸酶。优选地靶肿瘤需要有可与抗体特异结合的抗原的表达，例如使用赫赛汀治疗则肿瘤需要是her2阳性，使用cetuximab用于治疗则肿瘤需要是表达egfr的。如本文所述的制剂包括治疗有效量的一个或多个抗体类型的药物和免疫功能增强剂，和可选的唾液酸酶。在某些实施方案中，制剂可以均是含有悬浮剂，为含有约50毫克/毫升赫赛汀和大约5毫克/毫升的咪喹莫特，以及药学上可接受的赋形剂的组合。所述抗体可以与其它成分注射再混合，因此允许用户使用市售的抗体药物。该用户可以使用含有免疫功能增强剂与任选的唾液酸酶的制剂溶液的作为稀释剂重构冻干抗体；或使用抗体溶液作为稀释剂重构含有免疫功能

类似地，化疗药物也可用于在本发明的组合物和制剂来替代细胞表面锚定抗原缀合物，或与细胞表面锚定抗原缀合物组合。这些药物的实施例包括烷基化剂(如环磷酰胺，乌拉莫司汀，卡莫司汀和usulfan)，抗代谢剂(如氨甲喋呤和fluorouracil)，抗微管剂(如紫杉醇，长春地辛和长春氟宁)，拓扑异构酶抑制剂(如伊立替康和topotecan)和细胞毒性药(例如蒽环类，博来霉素，丝裂霉素c，米托蒽醌和放线菌素)。

方法

本发明还提供了一种治疗和/或抑制实体肿瘤的方法，包括给予一个需要的患者施用治疗有效量的细胞表面锚定抗原缀合物，制剂或药物组合物，如本文所述。所述细胞表面锚定抗原缀合物，制剂或药物组合，可以瘤内注射来治疗癌症。在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物，制剂或药物组合物，进一步包含癌细胞结合结构域以增加其靶向癌细胞，这将允许静脉内(iv)注射，而不是瘤内注射。在某些实施方案中，治疗和/或抑制包括预防肿瘤的转移。在其它实施方案中，方法包括施用治疗有效量的免疫检查点抑制剂，例如t淋巴细胞抗原4(ctla-4)阻断抗体，pd-1阻断抗体，pd-l1阻断抗体，ipilimumab，tremelimumab，atezolizumab，nivolumab或pembrolizumab或其组合。

如本文所用，短语“有效量”是指足以提供足够高的浓度以对其接受者赋予有益作用的剂量。任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病，疾病的严重程度，特定化合物的活性，给药途径，化合物的清除率，治疗持续时间，与该化合物组合或同时使用的药物，患者的年龄，体重，性别，饮食和总体健康状况，以及医学技术和科学领域众所周知的类似因素。在确定“治疗有效量”时考虑的各种一般考虑因素是本领域技术人员已知的并进行了描述。剂量水平通常在约0.001至最高100mg/kg的范围内；通常适用的浓度范围为0.05至10mg/kg。

细胞表面锚定抗原缀合物，制剂或药物组合物，如本文所述可以肠胃外施用，如血管内，静脉内，动脉内，肌内，皮下，或类似。也可以通过气雾剂经口服，经鼻，经直肠，经皮或吸入给药。最初可以通过确定ic50从细胞培养测定中估算治疗有效剂量。然后可以在动物模型中制定剂量，以实现细胞培养中确定的ic50。此类信息可用于更准确地确定对人体有用的初始剂量。血浆或肿瘤中药物的水平可以例如通过hplc测量。具体的制剂，给药途径和剂量可以由个别医师根据患者的状况来选择。本文所述的化合物可以与药学上可接受的载体一起配制的药物或药物形式给药。因此，所述化合物可用于药物或药物组合物的制造中。药物组合物可以配制成用于肠胃外给药的溶液或冻干粉剂。在使用前，可通过添加合适的稀释剂或其他药学上可接受的载体来重构。液体制剂可以是缓冲的，等渗的水溶液。粉末也可以以干燥形式喷雾。合适的稀释剂的例子是盐水溶液(等渗或非等渗的)，标准的5％葡萄糖水溶液或缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。这样的制剂特别适合于肠胃外给药。可以将化合物配制成包括其他医学上有用的药物或生物药的制剂。化合物也可以与对化合物所针对的疾病或状况有用的其他药物或生物药剂一起给药。

另一种可以注射到肿瘤(例如，黑色素瘤)中以治疗癌症的药剂是唾液酸酶或与胆固醇胺或脂质型分子缀合的唾液酸酶。它可以增加nk细胞的细胞毒性，促进抗原呈递和抗体介导的针对肿瘤细胞的补体激活。所述唾液酸酶可以是治疗有效量的细菌唾液酸酶或病毒唾液酸酶或动物唾液酸酶或人唾液酸酶(例如，0.1～10毫克每次注射)。它可以是单体或低聚物或聚合物(例如与可溶聚合物骨架键合)，也可以包被在纳米/微米颗粒上。优选地，将其与癌细胞溶解剂一起以治疗有效量注入肿瘤。它也可以与免疫功能增强剂共同配伍制成剂型。

本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物，制剂或药物组合可以以活性药物，前药，脂质体，胶束，缓释制剂的形式施用，也可缀合至聚合物药物载体(例如右旋糖酐dextran)或封装在可生物降解的微米粒子/纳米粒子中。施用的量和浓度应足以裂解显著量的癌细胞(例如，可裂解被注入肿瘤中>5％的癌细胞)。细胞裂解肽和抗生素，如多粘菌素，也可以使用于本文中所描述的的制剂和组合物。其它瘤内注射时可以裂解癌细胞的试剂也可以本文中所描述的组合物和制剂的与细胞表面锚定抗原缀合物组合使用。例如，制剂可以包含酸或碱(例如，在有机酸缓冲液，例如乳酸或柠檬酸，有机酸为0.1～1m，ph＝2，或者在na2co3缓冲剂中na2co3为0.1～1mph＝10)，有机溶剂(例如，75％的乙醇，dmf，dmso，丙酮)，穿孔素perforin，c3b，c5b，膜攻击复合物，细胞毒t细胞，nk细胞和可裂解细胞的洗涤剂/表面活性剂。

本文所述的细胞表面锚定抗原，抗体，化学疗法药物，细胞裂解肽或抗生素以及所述去污剂，作为癌细胞裂解剂起作用并且能够增强肿瘤抗原的呈递。其量和浓度应足以溶解大量癌细胞(例如大于所注射肿瘤中癌细胞的10％)。本发明公开了用于治疗癌症的组合物和制剂。所述组合物或制剂包含有癌细胞裂解剂和免疫功能增强剂于药学上可接受的载体中，其可用作肿瘤内注射来治疗癌症。

它们可以是活性药物，前药，脂质体，胶束，缓释制剂的形式，也可以与聚合物药物载体(例如右旋糖酐)偶联，也可以封装在可生物降解的微米颗粒/纳米颗粒中。优选的量和浓度应足以裂解大量的癌细胞(例如，＞10％的被注射肿瘤中的癌细胞)。可以使用的去污剂的例子包括阴离子去污剂，阳离子去污剂，非离子去污剂和两性离子去污剂，例如烷基苯硫酸盐，烷基苯磺酸盐，胆汁酸，脱氧胆酸，季铵类去污剂，吐温，triton，chaps，sls，sds，sles，doc，np-40，溴化西曲铵(ctab)，十六烷基吡啶氯化物(cpc)，苯扎氯铵(bac)，苄索氯铵(bzt)，二甲基二十八烷基氯化铵和双十八烷基二甲基溴化铵(dodab)，只要它们能有效地在体内裂解肿瘤细胞。例如，它们可被以0.1－100毫克/毫升的浓度注入。

本发明还提供抑制或清除肿瘤内癌症细胞和/或预防转移的方法。该方法包括向需要其的患者施用如本文所描述的的制剂或组合物，其组合包括癌症细胞裂解剂，如细胞表面锚定抗原缀合物，以及免疫功能增强剂。该组合物可以通过肿瘤内注射给予肿瘤。免疫功能增强剂可以与所述癌细胞裂解剂(如细胞表面锚定抗原缀合物)形成混合物通过瘤内注射被给予患者，或顺序地(于注射免疫功能增强剂之前或之后)对相同的肿瘤注射癌细胞裂解剂。例如，同时含有癌细胞裂解剂和免疫功能增强剂的液体制剂可以被注入到肿瘤中，例如，注射50μl－1000μl/厘米³肿瘤体积。肿瘤是任何类型的实体肿瘤，只要可以进行肿瘤内注射即可。

此外，有效剂量的免疫检查点抑制剂也可以施用以进一步增强治疗效果。所述免疫检查点抑制剂可以作为瘤内注射给药或通过静脉注射给药。

合适的免疫检验点抑制剂的例子包括抗pd-1抗体，抗pd-l1抗体，抗ctla-4的抗体或它们的组合。其实例包括ipilimumab，tremelimumab，atezolizumab，nivolumab和pembrolizumab。例如，患者可以通过静脉内注射ipilimumab(例如，治疗后每3周共4次剂量约3－10毫克/公斤，或治疗后每3周一次atezolizumab1200毫克iv直至疾病无进展)。

综而言之，本发明提供了通过治疗原发肿瘤来杀死肿瘤中的癌细胞和/或预防或延迟转移的方法。该方法包括向有需要的患者施予，一个癌细胞裂解剂，以及附加任选的免疫功能增强剂。治疗有效量免疫检验点抑制剂也可给予以进一步增强该治疗。免疫功能增强剂通过瘤内注射至原发肿瘤而给药。它可以通过瘤内注射施用给一个需要受试者，可以作为与癌细胞裂解剂的混合物给药或对给与癌细胞裂解剂的相同的肿瘤顺序地给药(在给与癌细胞裂解剂之前或之后)。对原发肿瘤的治疗将诱导针对远处和继发性肿瘤的免疫反应，以杀死其中的癌细胞，并防止肿瘤的转移。所述用于瘤内注射组合物包含癌细胞裂解剂和免疫功能增强剂，二者在药物上可接受的载体中。该制剂包含在药物上可接受的载体中癌细胞裂解剂和免疫功能增强剂。它可以是可注射的液体或固体剂型，如一个冻干制剂，可以重新配制用注射液。癌细胞裂解剂和免疫功能增强剂可以是在所述的形式的活性药物，前体药物，脂质体，胶束，乳剂，凝胶，植入物，热相变剂型，不溶性沉淀物(例如，通过与共沉淀剂结合)，共轭键合在聚合物药物载体(例如右旋糖酐)上，封装或涂覆在可生物降解的微米颗粒或纳米颗粒中或表面。热相变制剂是温度升高时其相位从液体到半固体转变的剂型。这样的制剂通常使用的泊洛沙姆作为一个赋形剂。微米颗粒或纳米粒子的示例性尺寸是10纳米到100微米。

本发明还提供了包含本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物和免疫功能增强剂的组合物。这样的组合物可以被注射到肿瘤内(例如，注射50μl－1000μl/厘米³肿瘤体积)。合适的免疫功能增强剂实例包括prr配体，tlr3配体，rlr配体，tlr4配体，tlr5配体，tlr7/8配体，tlr9配体，nod2配体，咪唑并喹啉类tlr7/8配体(例如咪喹莫特(r837)，嘎德莫特(gardiquimod)，雷西莫德(r848)，3m-052、3m-852、3m-s-34240)，cpgodn(cpg寡脱氧核苷酸，例如odn1826和odn2216)，dsrna的合成类似物，如polyic(例如polyiclc，polyic-卡那霉素，polyi：polyc12u)，tlr4/5配体，如细菌脂多糖(lps，例如单磷酰脂质a)，细菌鞭毛蛋白(例如创伤弧菌鞭毛蛋白b)或它们的衍生物，或它们的组合。很多是商业来源可得(例如可从invivogencorporation获得)。

免疫功能增强剂可以以下形式施用：作为前药，脂质体，乳液，胶束，持续释放制剂，不溶性沉淀物(例如与共沉淀剂形成复合物)，缀合于聚合物药物载体(例如葡聚糖)，或包封在可生物降解的微米颗粒/纳米颗粒(例如由可生物降解的聚合物制备而成的，如pla，plga，pcl，pga或phb制成的颗粒)。疫苗佐剂封装于微米颗粒/纳米颗粒或其前药的制备和使用是本领域的技术人员公知的。其实施例中可以以下文献找到，例如vaccine,2014,32(24),2882-95；science,2015,348(6241),aaa8205以及natcommun.,2016,7,13193上的文章，以及美国专利申请us13/560955，us12/764569和us12/788266。

在某些实施方案中，含免疫功能增强剂的组合物以治疗有效量对肿瘤内给药。例如，咪喹莫特可以以1－100毫克的游离药物或10－1000毫克微纳米颗粒包封的咪喹莫特的剂量给药。也可以使用其他合适的剂量，只要它可以产生令人满意的治疗效果即可，这可以通过使用众所周知的方案和方法通过实验进行筛选和测试来确定。

细胞表面锚定抗原缀合物的合成

本文所述的3β-胆固醇胺(3β-cholesterylamine)，或其衍生物，和所使用的细胞表面锚定抗原缀合物中的抗原，可以使用已知的方法分离得到，从商业来源获得，或者部分或完全通过使用本领域中公知的方法合成(例如，化学和/或生物技术方法)。

在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物可以通过使用接头将抗原与3β-胆固醇胺通过共价键合，通过于羧酸，醛或肼与3β-胆固醇胺产生一个或多个酰胺，氨基或亚氨基键合。这些方法本领域内众所周知。例如参见hermansongt，bioconjugatetechniques，academicpress，第169-186页(1996)中所描述，通过引用并入本文。如方案1所示，在一个实施方案中，抗原可以经由异头碳原子共价结合至接头。接头具有离去基团(lg)。这种缀合物前体然后可以被共价键合到胆固醇胺以提供本文所述细胞表面锚定抗原缀合物。

方案1

药物组合物

本公开提供了通常包含至少一种药学上可接受的载体的组合物。可以使用本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体，包括水或盐水。如本领域中已知的，各成分及其相对量由预期用途和递送方法确定。根据本公开内容提供的组合物可被配制成用于递送至有需要的患者的溶液，可于静脉内递送。

可以选择在组合物中使用的稀释剂或载体使它们不会减弱组合物的期望效果。合适的组合物的实例包括水溶液，例如盐溶液，5％葡萄糖。可以使用其他熟知的药学上可接受的液体载体，例如醇，二醇，酯和酰胺。在某些实施方案中，组合物还包含一种或多种赋形剂，例如但不限于离子强度调节剂，溶解度增强剂，糖例如甘露醇或山梨糖醇，ph缓冲剂，表面活性剂，聚合物稳定剂，防腐剂和/或助溶剂。

在某些实施方案中，聚合物基质或聚合物材料可用作药学上可接受的载体。本文所述的聚合物材料可包含天然或非天然的聚合物，例如，糖，肽，蛋白质，层粘连蛋白，胶原蛋白，透明质酸，离子和非离子水溶性聚合物等，丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，例如羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，甲基纤维素，羧甲基纤维素和醚化纤维素；聚乳酸，聚乙醇酸，乳酸和乙醇酸的共聚物或其他天然和合成的聚合物。在某些实施方案中，本文提供的组合物可被配制成膜，凝胶，泡沫，或和其它剂型。

合适的离子强度调节剂包括，例如，甘油，丙二醇，甘露醇，葡萄糖，右旋糖，山梨糖醇，氯化钠，氯化钾和其他电解质。

在某些实施方案中，可能需要增强细胞表面锚定抗原缀合物的溶解度。在这种情况下，可通过使用适当的制剂技术来增加溶解度，例如掺入增加溶解度的组合物，例如甘露醇，乙醇，甘油，聚乙二醇，丙二醇，泊洛沙姆和本领域已知的其他。

可用于本文的组合物中的合适的ph缓冲剂包括，例如，乙酸盐，硼酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，和磷酸盐缓冲液，以及盐酸，氢氧化钠，氧化镁，钾磷酸盐，碳酸氢盐，氨，碳酸，盐酸酸，柠檬酸钠，柠檬酸，乙酸，磷酸氢二钠，硼砂，硼酸，氢氧化钠，二乙基巴比妥酸和蛋白质，以及各种生物缓冲液，例如taps，bicine，tris，tricine，hepes，tes，mops，pipes，cacodylate或mes。在某些实施方案中，将适当的缓冲系统(例如磷酸钠，乙酸钠，柠檬酸钠，硼酸钠或硼酸)添加至组合物中以防止ph在储存条件下变化。在一些实施方案中，缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液(即，包含磷酸钠，氯化钠，并且在一些制剂中，包含氯化钾和磷酸钾)。具体的浓度将根据所使用的试剂而变化。在某些实施方案中，添加ph缓冲剂体系(例如磷酸钠，乙酸钠，柠檬酸钠，硼酸钠或硼酸)以将ph维持在约ph4至约ph8或约ph5至5的范围内。大约ph8，或大约ph6至大约ph8，或大约ph7至大约ph8。在一些实施方案中，选择缓冲液以保持ph在大约ph2至大约ph11的范围内。在一些实施方案中，ph为约ph5至约ph8。在一些实施方案中，缓冲液为盐缓冲液。在某些实施方案中，ph为约ph4至约ph8，或约ph3至约ph8，或约ph4至约ph7。

表面活性剂可在组合物中使用，以提供较高浓度的细胞表面锚定抗原缀合物和免疫功能增强剂。所述表面活性剂起到溶解不溶物和稳定胶体分散体的作用，如胶束溶液，微乳剂，乳剂和悬浮液。合适的表面活性剂包括聚山梨酸酯，泊洛沙姆，polyosyl40stearate，聚氧蓖麻油，替洛沙泊，triton和脱水山梨醇单月桂酸酯。在一个实施方案中，表面活性剂的亲水/亲脂/平衡值(hlb)为12.4至13.2，并且对于眼科用途是可接受的，例如tritonx114和泰洛沙泊。

可以对本文所述的组合物进行灭菌以去除不想要的污染物，包括但不限于内毒素和传染原。可以使用不会不利地影响细胞表面锚定抗原缀合物的结构和亲生物特性的灭菌技术。在某些实施方案中，组合物可使用常规的灭菌技术，包括环氧丙烷或环氧乙烷处理，无菌过滤，气体等离子体灭菌，γ辐射，电子束，和/或消毒用消毒和/或灭菌的过酸，如过乙酸。在一个实施方案中，可以对组合物进行一种或多种灭菌过程。或者，可以将组合物包装在包括塑料包装纸或箔纸包装纸的任何类型的容器中，并且可以进一步灭菌。

在一些实施方案中，将防腐剂添加到组合物中以防止使用期间的微生物污染。加入的合适的防腐剂包括苯扎氯铵，苯甲酸，烷基对羟基苯甲酸酯，烷基苯甲酸酯，氯丁醇，氯甲酚，鲸蜡醇，脂肪醇如十六醇，有机金属如乙酸盐，汞的化合物苯基汞硝酸盐或硼酸盐，重氮烷基尿素，己二酸二异丙酯，二甲基聚硅氧烷，edta盐，维生素e及其混合物。在某些实施方案中，防腐剂选自苯扎氯铵，氯丁醇，苯度溴铵，甲基对羟基苯甲酸酯，丙基对羟基苯甲酸酯，苯基乙基醇，依地酸二钠，山梨酸，或polyquarternium。

在一些实施方案中，组合物和其他试剂的分开或顺序施用对于促进组合物向患者的递送是必需的。在某些实施方案中，可以以不同的给药频率或间隔施用组合物和另一种药剂。例如，一种组合物可以每天或每周施用，而另一种药剂可以较少地施用。另外，对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用相同的给药途径或不同的给药途径来给药组合物和其他药剂。

可以使用任何有效的组合物给药方案。例如，该组合物可以以单剂量，输注形式给药。此外，交错的方案，例如，一到两天每周可作为替代每日治疗。

本公开内容所考虑的制剂可以用于注射给药，包括水性或油性混悬剂或乳剂，可以使用芝麻油，玉米油，棉籽油或花生油，以及酏剂，甘露醇，右旋糖或无菌水溶液，以及类似的药物载体。盐水水溶液也通常用于注射，但是在本发明的上下文中次优选。也可以使用乙醇，甘油，丙二醇，液态聚乙二醇等(及其合适的混合物)，环糊精衍生物和植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等。

无菌注射溶液的制备方法是，将所需量的组分与所需的上述其他各种成分掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

在制备包含本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物的药物组合物中，通常将活性成分用赋形剂或载体稀释和/或封闭在可以是胶囊，药囊，纸或其他容器形式的这种载体内。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体，半固体或液体材料(如上所述)，它们充当活性成分的媒介物，载体或介质。因此，组合物可以是膜，凝胶，粉末，悬浮液，乳剂，溶液的形式，其包含例如多达重量10％的活性化合物，无菌注射溶液和无菌包装的粉末。

合适的赋形剂的一些实例包括乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯胶，磷酸钙，藻酸盐，黄芪胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，无菌水，糖浆和甲基纤维素。所述制剂可以另外包括：润湿剂；乳化和悬浮剂；和防腐剂如苯甲酸甲酯和丙酯。

本文使用的凝胶是指固态胶冻状材料，其性质可以从软和弱到硬和坚韧。如本领域所公知的，凝胶是非流体的胶体网络或聚合物网络，其通过流体在其整个体积中膨胀。水凝胶是一种凝胶，其包含与亲水性聚合物链的网络，有时为胶体态凝胶，其中水是分散介质。水凝胶是高吸收性的，并且可以包含高度的水，例如大于90％的水。在一些实施方案中，本文所述的凝胶包含天然或合成的聚合物网络。在一些实施方案中，凝胶包含亲水性聚合物基质。在其他实施方案中，凝胶包含疏水性聚合物基质。在一些实施方案中，凝胶具有与天然组织非常相似的柔韧性。在某些实施方案中，该凝胶是生物相容的且可吸收的。在某些实施方案中，在外科手术之前，期间或之后将凝胶施用于患者。

本文所用的液体溶液是指本领域众所周知的溶液，悬浮液，乳剂，滴剂，软膏剂，洗液，喷雾剂，脂质体。在一些实施方案中，液体溶液包含ph缓冲剂水溶液，当添加少量的酸或碱时，该ph缓冲剂抵抗ph的变化。

可替代地，示例性制剂可以包含：a)如本文所述细胞表面锚定抗原缀合物和免疫功能增强剂；b)药学上可接受的载体；c)亲水性聚合物作为基质网络，其中所述组合物配制成粘性液体，例如粘度为几百至几千cps，凝胶或软膏。在这些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物分散或溶解在适宜的药学可接受载体中。

在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物或包含其的组合物，在制剂之前或之后冻干。在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物，或包含其的组合物中，是冻干制剂，其包括填充剂，冻干保护剂，或它们的混合物。在某些实施方案中，冻干保护剂是蔗糖。在某些实施方案中，填充剂是甘露醇。在某些实施方案中，细胞表面锚定抗原缀合物，或包含其的组合物，冻干的药物制剂包含甘露醇和蔗糖。示例性药物制剂可包含约1-20％的甘露醇和约1-20％的蔗糖。药物制剂可以进一步包含一种或多种缓冲剂，包括但不限于磷酸盐缓冲剂。因此，本文还提供了包含如本文所述的药物缀合物，纳米颗粒或包含其的组合物的冻干组合物。

给药

合适的剂量可以通过标准方法确定，例如通过在实验室动物模型或临床试验中建立剂量反应曲线来确定，并且可以根据患者的状况，所治疗的疾病状态，给药途径和组织分布以及共同使用其他治疗方法的可能性。给予患者的有效量可基于体表面积，患者体重或体重以及医师对患者状况的评估。在各种示例性实施方式中，剂量为约0.0001mg至约10mg。在其他说明性示例，有效剂量为每剂约0.01μg至约1000mg，每剂1μg至约100mg，或每剂约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg。剂量或每剂约1mg至10mg，或每剂约1至约100mg，或每剂约1mg至5000mg，或每剂约1mg至3000mg，或约100mg至每剂3000mg，或每剂约1000mg至3000mg。在本文所述的各种实施方案的任何一个中，有效剂量为每剂约0.01μg至约1000mg，每剂1μg至约100mg，约100μg至约1.0mg，约50μg至约600μg，约50μg至约700微克，约100微克至约200微克，约100微克至约600微克，约100微克至约500微克，约200微克至约600微克，或约100微克至约50毫克，或每剂约500μg至约10mg或每剂约1mg至约10mg。在其他说明性实施方案中，有效剂量可以是约1μg，约10μg，约25μg，约50μg，约75μg，约100μg，约125μg，约150μg，约200μg，约250μg，约50μg。275微克，约300微克，约350微克，约400微克，约450微克，约500微克，约550微克，约575微克，约600微克，约625微克，约650微克，约675微克，约700微克约800μg，约900μg，1.0mg，约1.5mg，约2.0mg，约10mg，约100mg或约100mg至约30克。在某些实施方案中，剂量为约0.01毫升至约10毫升。

在某些实施方案中，该剂量每天作为注射剂给予有需要的受试者。在其他实施方案中，剂量是每2-3天注射一次。在其他说明性实施方案中，该剂量每周一次注射给需要其的受试者。在其他实施方案中，该剂量每两周一次注射给有需要的受试者。在其他实施方案中，该剂量每月一次注射给需要其的受试者。可以继续治疗直至达到所需的治疗效果。

例子

用于该组合物和制剂中的微米/纳米颗粒的示例性组合物，制剂和制备如下。

例子1

在水性介质中，癌细胞裂解剂为1至约100mg/ml(例如α-gal-胆固醇胺缀合物或l-鼠李糖-胆固醇胺缀合物或摩尔比为1：1的混合物)，0.1～50mg/mltlr7/8配体(例如咪喹莫特或加地喹莫德或雷西莫德)，0.1～50mg/mltlr3/rlr配体(例如dsrna如polyic或polyiclc)，0.1～50mg/mltlr9配体(例如cpgodn如odn1826或odn2216)以及0.1～50mg/ml霍乱弧菌神经氨酸酶(唾液酸酶)，在1xpbs中，然后冻干，得到最终制剂。在另一个实例中，所述制剂含有30毫克/毫升癌细胞裂解剂(例如α-gal-胆固醇胺缀合物或l-鼠李糖-胆固醇胺缀合物)，5mg/ml的咪喹莫特，5mg/ml的polyic，5mg/ml的classacpgodn2216和5mg/ml的霍乱弧菌神经氨酸苷酶(唾液酸酶)，在5％蔗糖1xpbs中。加水重构后可以将它以100μl－300μl/cm3肿瘤体积注射到肿瘤中。

例子2

在水性介质中，100mg/ml癌细胞裂解剂(例如α-gal-胆固醇胺缀合物或l-鼠李糖-胆固醇胺缀合物)，2mg/ml咪喹莫特，2mg/mlpolyic，2mg/mlclassacpgodn2216或classbcpgodn，2mg/ml神经氨酸酶(唾液酸酶)-脂质缀合物在1xpbs和15％矿物油中形成乳液。上述实施方案中的药物为活性药物形式，如前所述它们中的一种或多种或全部也可以为前药，脂质体，胶束，不溶性沉淀物(例如与共沉淀剂复合)的形式，或为与聚合物药物载体(例如右旋糖酐)缀合，或涂在或封装在可生物降解的微米颗粒/纳米颗粒。例如，具有一个或多个胺基的化合物可沉淀polyic或cpgodn从而产生不溶性沉淀物用作缓释药物制剂。所述的示例共沉淀化合物包括α-聚赖氨酸，ε-聚赖氨酸，精胺，多粘菌素，庆大霉素，乳链菌肽，dc-胆固醇，胆固醇胺，叔/季铵型洗涤剂(例如cetrimonium盐，十六烷基吡啶鎓盐，苯扎氯銨，苄索氯化物，二甲基二十八烷基氯化铵和二十八烷基二甲基铵盐)或它们的碱形式。咪喹莫特或嘎德莫特或雷西莫特也可以沉淀polyic或cpgodn。可以将表面活性剂添加至沉淀物中以形成稳定的悬浮液。

例子3

通过添加本文所述的含胺化合物，可以在可生物降解的微球或纳米球中进行polyic或cpgodn的封装。例如，可使用双乳化-溶剂蒸发法制备封装有polyic或cpgodn的plga杂化纳米球。简而言之，将1mltris/edta缓冲液中的polyic或cpgodn在含有dc-cholesterol或十六烷基二甲基胺的plga溶液(5％w/v的二氯甲烷溶液，plgamw＝66,000da；birminghampolymers，birmingham，al，美国)中乳化。或加迪奎莫特溶液(5％w/v的二氯甲烷溶液)使用超声仪处理5分钟。使用超声仪在25ml4％(w/v)聚乙烯醇水溶液(pva，mw＝30,000–70,000da；sigma，st.louis，美国)中乳化油包水溶液5分钟。将该乳液在室温下搅拌72小时以除去二氯甲烷。通过超速离心(20,000g，4℃，20分钟)回收plga纳米球。将plga纳米球沉淀物在蒸馏水中洗涤五次以除去pva，然后通过涡旋重新悬浮和冻干48小时，以获得干粉。当将额外的咪喹莫特(例如1％w/v的二氯甲烷溶液)添加到polyic或cpgodn溶液中时，所得的纳米球也会封装咪喹莫特。制备的纳米球可用作免疫功能增强剂。

例子4

可以使用双重乳化水/油/水系统制备封装聚ic和咪喹莫特的纳米球。简而言之，plga是在二氯甲烷中以10％wt/vol的比例制备的，其中二氯甲烷也包含3％咪喹莫特，而polyic是在pbs中以50mg/ml的比例制备的。通过超声处理进行的乳化是使用均质器然后进行超声处理。初级乳液在厚壁玻璃压力管中以水与有机相之比为1：5进行。在均质步骤之后，将emprovepva4–88水溶液添加到plga有机溶液中(pva与有机相的体积比为3：1)，涡旋混合，并通过超声处理进行乳化。然后在搅拌下将所得的双重乳液转移至烧杯中，该烧杯含有70mm磷酸盐缓冲液ph8.0，其体积比为1份双重乳液与7.5份缓冲剂。在搅拌下将有机溶剂(二氯甲烷)蒸发2小时，并通过两个洗涤步骤以75,600rcf的离心回收纳米颗粒。pbs用于洗涤液和最终的重悬浮介质。洗涤后的悬浮液储存在-20℃。

例子5

制备的溶液含有20～200mg/mll-鼠李糖-胆固醇胺缀合物，3毫克/毫升的polyic或3毫克/毫升的cpgodn2216或两者的混合物，20mg/ml的生物可降解的plga纳米(包封了20％的咪喹莫特)，和粒单核细胞集落刺激因子(10-200μg/ml)。可以对悬浮液中加入适量的表面活性剂以使其稳定。患者接受瘤内注射0.5毫升/厘米³肿瘤体积上述制剂后，患者静脉内用注射ipilimumab3～10毫克/公斤体重每3周4个剂量，或atezolizumab1200毫克iv，每3周，直至疾病进展。

例子6

制备的溶液含有100～200毫克/毫升dnp脂质缀合物，任选的100毫克/毫升α-gal-胆固醇胺缀合物，10mg/ml的咪喹莫特，2毫克/毫升polyic，2mg/ml的cpgodn2216，50微克/ml的粒单核细胞集落刺激因子，1×10⁴-1×10⁵u/ml的ifn-α，1-10miu/ml的il-2。患者接受上述制剂的瘤内注射后，每3周静脉注射3至10mg/kg的伊匹木单抗，共4剂，或静脉注射q3wk的atezolizumab1200mg，直至疾病进展。

例子7

制备的溶液含有100～200毫克/毫升包封20％dnp脂质缀合物的plga纳米颗粒，2mg/mlpolyic，2mg/ml的cpgodn2216，5毫克/ml咪喹莫特，0.5-2mg/ml的α-galcer，25×10⁴u/mlifn-α，5miu/mlil-2。患者接受0.3ml/立方厘米肿瘤体积上述制剂的瘤内注射后，患者静脉内注射易普利姆玛3～10毫克/公斤，每3周4次剂量，或atezolizumab1200毫克ivq3wk直到疾病进展。

例子8

制备的溶液含有100～200毫克/毫升包封20％dnp脂质缀合物的plga纳米颗粒，2mg/mlpolyic，2mg/ml的cpgodn2216，5毫克/ml3m-052，5miu/mlil-2。患者接受0.6ml/立方厘米肿瘤体积上述制剂的瘤内注射后，患者静脉内注射易普利姆玛3～10毫克/公斤，每3周4次剂量，或atezolizumab1200毫克ivq3wk直到疾病进展。

例子9

制备的制剂含有20～100毫克/毫升赫赛汀，2mg/ml的咪喹莫特，2毫克/毫升polyic，5mg/ml的α-神经酰胺和2mg/ml的神经氨酸苷酶(人源唾液酸酶)在1×pbs溶液中。可以将其以100～500ul/立方厘米肿瘤体积注射到her2阳性肿瘤中，每10天共3次以治疗癌症。检查点抑制剂可在同一时间及以后给予患者。

例子10

制备的制剂含有50毫克/毫升赫赛汀，任选的50毫克/毫升西妥昔单抗，1mg/ml的咪喹莫特和2mg/ml的神经氨酸苷酶，在药物上可接受的赋形剂中。在另一个实例中，所述制剂包含50mg/ml曲妥珠单抗-美坦新偶联物，20mg/mlplga纳米颗粒(所述纳米颗粒包含10％咪喹莫特)和2mg/mlpolyic，在药学上可接受的赋形剂中。

例子11

制备的制剂含有50毫克/毫升西妥昔单抗，2-5mg/ml的咪喹莫特和2mg/ml的霍乱弧菌神经氨酸酶，在pbs中。在另一实例中，该制剂含有50毫克/毫升西妥昔单抗，20mg/ml的plga纳米颗粒(含有10％咪喹莫特)，2毫克/毫升polyic，50微克/ml的粒单核细胞集落刺激因子，1×10⁴-1×10⁵u/ml的ifn-α，1-10miu/ml的il-2，在药学上可接受的赋形剂中。这些含西妥昔单抗的制剂可以以100～500ul/立方厘米肿瘤体积注射到表达egfr的肿瘤中以治疗癌症，每10天共治疗3次。检查点抑制剂可在同一时间及以后给予患者。

例子12

plga-r837纳米颗粒(r837包封在聚交酯-共-乙交酯颗粒中)可以使用水包油型单乳液法制备。简而言之，将r837(tlr7配体)以2.5mg/ml溶解在dmso中。总共50μlr837被加入到1ml溶解于二氯甲烷的plga(5毫克/毫升)。接下来，使用超声将混合物与0.4ml5％w/vpva溶液均化10分钟。将水包油乳液加入到2.1ml的5％w/vpva溶液中，在室温下蒸发有机溶剂4小时。在3500g离心20分钟后获得plga-r837纳米颗粒。

例子13

免疫功能增强剂和细胞表面锚定抗原缀合物也可以在一起包封在微米/纳米颗粒。例如，将r837或r848以2.5mg/ml溶于dmso。如本文所述的细胞表面锚定抗原缀合物，50毫克/毫升溶解于dmso。50μlr837/r848和50μl细胞表面锚定抗原缀合物的dmso溶液添加到1mlmpeg-plga(10毫克/毫升乙腈溶液)。接着，将该混合物逐滴加入5ml水(含有100毫克polyic)中。在搅拌1小时和静置12小时后，以22,000g离心5分钟后获得纳米颗粒。