一种锌卟啉纳米晶及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米材料领域，涉及一种锌卟啉纳米晶及其制备方法和应用。

背景技术：

光声成像是一种新型无辐射、无创伤影像学检查方法，其结合了超声检查的高穿透深度、高灵敏度和高对比度等优点，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像，已成为近年肿瘤研究的热点与新领域。光声信号来源于激光照射生物组织中时，光声成像分子光吸收使组织发生热弹性膨胀，产生超声信号。内源性生色团和外源性造影剂是主要的光声成像分子，特别是外源性光声造影剂的应用，推动了光声成像在生物医学中的，具有十分重要的临床应用意义。近年来，制备具有光声成像技术与治疗能力的多功能光声成像造影剂，是当前生物医学领域研究的前沿与热点。

锌卟啉作为经典的光敏剂材料，同时具备光声造影剂和光光动力学治疗的能力，在肿瘤诊断和治疗领域展现出广泛的应用前景。但是，如何将脂溶性的锌卟啉有效的递送到肿瘤病灶部位，是决定肿瘤光声成像与光动力学治疗效率的关键问题。随着纳米技术向医学领域的不断渗透，纳米药物递送系统能够有效的克服脂溶性的锌卟啉难溶性及低传递效率，和对机体正常细胞组织毒副作用的难题。因此，发展一种能够具有高效的锌卟啉纳米光声成像造影剂，是实现肿瘤光声成像与光动力学治疗的必要条件。

理想的锌卟啉光声成像造影剂应该具有以下特点：纳米级尺度进行体内药物递送；较高的载药量；良好地体内分布和代谢特征及优良的生物安全性。

锌卟啉光声成像造影剂功能特性：锌卟啉在近红外具有光吸收能力，吸收光能后释放的热能导致肿瘤病灶部位温度局部升高，导致组织热膨胀而产生压力波，继而生成光声信号，通过探测光声信号能重建出组织中的光吸收分布图像，实现肿瘤的光声成像诊断；同时，激光诱导锌卟啉发生一系列光化学反应和光生物学反应，产生氧自由基或活性氧物质，损伤细胞内的亚细胞器，促进相应凋亡信号通路激活，最终引起细胞死亡，达到肿瘤光动力学治疗的目的。

难溶性药物纳米晶制剂制备技术方面，主要的方法包括为球磨法、高压乳匀法和沉淀法。其中球磨法和高压乳匀法的设备购置费用和生产过程中的能耗均很高，同时设备侵蚀产生的杂质和长时间制备过程中可能的微生物污染都可能会影响最终的产品质量。沉淀法操作最为简单，无特殊设备要求，生产过程能量消耗少，但是为了很好地抑制药物成核后的迅速结晶生长过程，需要对制备工艺进行精细的控制提出更高的要求。

cn108030921a公开了一种白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒的制备方法及其应用。以卟啉、金属盐以及白蛋白为原料，并采用去溶剂法制备白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒，方法简单、易操作、重复性好、制备的白蛋白载纳米颗粒解决了金属基配合物药物的水溶性问题和靶向性问题；同时在超声波作用下，白蛋白负载金属卟啉配合物纳米颗粒具有超声杀伤肿瘤细胞的作用，证实了金属基配合物负载于白蛋白分子后具有广阔的抗肿瘤应用前景。此方法不能够彻底解决卟啉的稳定性以及难溶性的问题。

cn103788101a公开了交联金属卟啉纳米晶及其制备方法和光探测器的制作方法，其是由金属卟啉纳米线相互交联成一维网状或枝状结构。将金属卟啉化合物与有机溶剂混合成混合溶液，通过退火处理可获得上述交联的金属卟啉纳米晶。但是，此方法制备得到的金属卟啉纳米线也不能完全解决卟啉的难溶性问题。

因此，如何更好的解决卟啉纳米制剂溶解性、稳定性的问题，对于其应用具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种锌卟啉纳米晶的制备方法，以解决锌卟啉的难溶性问题，提升造影剂在血液系统中的稳定性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种锌卟啉纳米晶的制备方法，所述制备方法包括将锌卟啉水包油型乳液经过液氮速冻后真空冻干得到锌卟啉纳米晶(fa-znpcnds)。

本发明利用乳液冻干结晶法制备具有超小粒径和表层亲水性聚合物保护的纳米晶，以此解决锌卟啉的难溶性问题，能够提升其作为造影剂时在血液系统中的稳定性；同时，在制备过程中于纳米晶表面引入肿瘤靶向分子叶酸(fa)，提高了肿瘤细胞对锌卟啉的内吞能力，实现高效的肿瘤光声成像与光动力学治疗。

本发明提供的锌卟啉纳米晶的制备方法：使用了乳液挥发法，该方法制备的锌卟啉纳米晶载药量高，水溶性好，稳定性高。

在本发明中，水包油型乳液必须经过液氮速冻的方法才能够制备锌卟啉纳米晶，如果使用其他低温冷冻的方法则无法制备得到。

优选地，所述锌卟啉水包油型乳液由以下制备方法制备得到：将使用溶剂溶解的锌卟啉与含有叶酸的表面活性剂混合，得到锌卟啉水包油型乳液。

优选地，所述锌卟啉在溶剂中的浓度为0.02～0.05g/ml，例如可以是0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml或0.05g/ml等。

优选地，所述溶剂为二氯甲烷。

优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆f127。

优选地，所述泊洛沙姆f127的浓度为0.5wt％～2.0wt％，例如可以是0.5wt％、0.8wt％、1wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.7wt％、1.9wt％或2wt％等。

优选地，所述叶酸由二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸提供。

二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸可直接购买得到。

优选地，所述二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸的浓度为0.2wt％～1wt％，例如可以是0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％或1wt％等。

在本发明中，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸的浓度会对锌卟啉纳米晶的纯度产生影响。上述范围适宜的浓度，可以使得最终制得的锌卟啉纳米晶纯度达到最高。

优选地，所述混合在超声状态下进行。

优选地，所述超声的功率为50～200w，例如可以是50w、60w、80w、100w、120w、150w、180w或200w等。

优选地，所述超声的时间为0.5～1min，例如可以是0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min或1min等。

优选地，混合得到锌卟啉水包油型乳液后，还包括将乳液进一步分散到大体积的水相中，混匀得到水相的锌卟啉水包油型乳液。

其中水相为形成的含泊洛沙姆f127的水溶液，o/w＝1:200。

在本发明中，通过乳液的进一步分散，可以吸取游离的表面活性剂以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸，提升制备得到的fa-znpcnds的纯度。

优选地，所述乳液与水相的体积比为1:15～20，例如可以是1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20等。

优选地，所述真空冻干的时间为40～50h，例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h或50h等。

优选地，所述真空冻干后还包括将冻干得到的粉末进行重悬，经过离心、溶解后，进行二次冻干得到所述锌卟啉纳米晶。

优选地，所述重悬在超纯水中进行。

优选地，所述离心的离心力为700000～800000g，例如可以是700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000或800000等。

优选地，所述离心的时间为20～40min，例如可以是20min、22min、25min、29min、30min、33min、34min、36min、38min或40min等。

优选地，所述离心、溶解的次数为3～5次，例如可以是3次、4次或5次等。

本发明通过多次离心、溶解的步骤，能够洗去游离的表面活性剂等。

优选地，所述二次冻干的时间为40～50h，例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h或50h等。

第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的制备方法制备得到的锌卟啉纳米晶。

优选地，所述锌卟啉纳米晶的粒径为5～20nm，例如可以是5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或20nm等。

通过本发明制备方法制备得到的fa-znpcnds，粒径小，溶解性更好。

第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的锌卟啉纳米晶在制备肿瘤光成像造影剂或制备肿瘤光动力学治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为实体肿瘤。

本发明所述肿瘤光成像造影剂是一种可通过静脉给药的方式注入，并在实体肿瘤病灶部位靶向聚集的造影剂，并且此造影剂能够在光的作用下产生活性氧自由基，进行实体肿瘤的光动力治疗。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的制备方法制备具有超小粒径和表层亲水性聚合物保护的纳米晶，解决了锌卟啉的难溶性问题，能够提升其作为造影剂时在血液系统中的稳定性；同时，在制备过程中于纳米晶表面引入肿瘤靶向分子叶酸，提高了肿瘤细胞对锌卟啉的内吞能力，实现高效的肿瘤光声成像与光动力学治疗。

附图说明

图1是实施例1制备的锌卟啉纳米晶的透射电镜图(标尺100nm)。

图2是实施例1中x射线光电子能谱分析叶酸靶向分子修饰锌卟啉纳米晶的测试图。

图3是实施例1中电子顺磁共振谱测试锌卟啉纳米晶单线态氧的生成图。

图4是实施例1中光声信号强度与锌卟啉纳米晶浓度的曲线图。

图5是实施例4中肿瘤细胞对不同锌卟啉纳米晶的内吞动力学数据分析曲线图。

图6a是实施例4中肿瘤细胞对znpcnds内吞后激光共聚焦图像图。

图6b是实施例4中肿瘤细胞对fa-znpcnds内吞后激光共聚焦图像图。

图7a是实施例4中肿瘤细胞对znpcnds内吞后透射电镜成像图。

图7b是实施例4中肿瘤细胞对fa-znpcnds内吞后透射电镜成像图。

图8是实施例5中不同锌卟啉制剂在肿瘤细胞内产单线态氧分析结果，其中a图为肿瘤细胞内吞不同锌卟啉制剂后的激光共聚焦成像图；b图为不同锌卟啉制剂在肿瘤细胞内产单线态氧能力对比图；c图为有光照的情况下测定不同锌卟啉制剂对肿瘤细胞的生存率影响的对比图。

图9是实施例6中体内光声成像和光动力学治疗分析结果，其中a图为造影剂尾静脉注射到荷瘤小鼠体内2h，4h，8h时肿瘤部位光声成像分析图；b图不同治疗组的肿瘤相对生长速率分析；c图不同治疗组的荷瘤小鼠生存期对比分析图；d图不同治疗组肿瘤组织切片进行细胞核凋亡检测图。

图10是实施例7中不同锌卟啉制剂组测试荷瘤小鼠体重变化分析曲线图。

图11是实施例7中不同锌卟啉制剂组荷瘤小鼠的ige水平分析图。

图12是实施例7中不同锌卟啉制剂组对健康小鼠的wbc比例影响图。

图13是实施例7中不同锌卟啉制剂组对健康小鼠的plt比例影响图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明实施例以及附图中涉及到的fa代表叶酸，pbs代表pbs缓冲液，znpc代表锌卟啉，znpcnds代表未靶向修饰的锌卟啉纳米晶，fa-znpcnds代表本发明制备的锌卟啉纳米晶。

实施例1

本实施例制备锌卟啉纳米晶的方法包括以下步骤：

以乳液体系为模板对锌卟啉析晶过程进行空间限制，从而实现锌卟啉纳米晶的制备，具体步骤如下：

(1)溶解了锌卟啉的二氯甲烷作为乳液的油相，并以1.0wt％泊洛沙姆f127和0.5wt％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸为表面活性剂的超纯水作为水相，两相的混合，在功率为100w超声1min，获得锌卟啉水包油型乳液；

(2)锌卟啉水包油型乳液分散到较大体积的水相中(1:20)，功率为100w下超声2min混匀，得到大水相的锌卟啉水包油乳液；

(3)液氮迅速冰冻，真空冻干48h，得到锌卟啉纳米晶粉末；

(4)将锌卟啉纳米晶粉末在超纯水中重悬，经超高离心力(800000g，30min)反复3次的溶解-离心-再溶解步骤，进行纯化，得到纯度较高的锌卟啉纳米晶fa-znpcnds，其纯度可达到84.5％。

将制备得到的锌卟啉纳米晶进行理化性质的表征

结果如图1所示，将冻干后的锌卟啉纳米晶重新均匀的分散在水中，形成透明溶液，表明锌卟啉纳米晶具有良好的水溶性。透射电镜分析所制得尺寸均一，粒径约为10nm锌卟啉纳米晶。制备过程中，0.5wt％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸作为乳液形成过程中的表面活性剂，吸附在锌卟啉纳米晶表面，通过x射线光电子能谱分析表明，fa没有zn峰谱，而fa-znpcnds在1023.91位置出现谱峰，证明叶酸靶向分子成功的修饰在锌卟啉纳米晶表面(如图2所示)。如图3所示，电子顺磁共振图谱分析，说明808nm激光照射锌卟啉纳米晶能够产生单线态氧。进一步体外溶液中研究光声信号与锌卟啉纳米晶关系；如图4所示，随锌卟啉纳米晶的浓度增加，光声信号逐渐增强，并且光声信号与锌卟啉纳米晶浓度呈正相关性。

实施例2

本实施例制备锌卟啉纳米晶的方法包括以下步骤：

以乳液体系为模板对锌卟啉析晶过程进行空间限制，从而实现锌卟啉纳米晶的制备，具体步骤如下：

(1)溶解了锌卟啉的二氯甲烷作为乳液的油相，并以2.0wt％泊洛沙姆f127和1wt％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸为表面活性剂的超纯水作为水相，两相的混合，在功率为200w超声0.5min，获得锌卟啉水包油型乳液；

(2)锌卟啉水包油型乳液分散到较大体积的水相中(1:15)，功率为100w下超声2min混匀，得到大水相的锌卟啉水包油乳液；

(3)液氮迅速冰冻，真空冻干50h，得到锌卟啉纳米晶粉末；

(4)将锌卟啉纳米晶粉末在超纯水中重悬，经超高离心力(700000g，40min)反复5次的溶解-离心-再溶解步骤，进行纯化，得到纯度较高的锌卟啉纳米晶fa-znpcnds。

实施例3

本实施例制备锌卟啉纳米晶的方法包括以下步骤：

以乳液体系为模板对锌卟啉析晶过程进行空间限制，从而实现锌卟啉纳米晶的制备，具体步骤如下：

(1)溶解了锌卟啉的二氯甲烷作为乳液的油相，并以0.5wt％泊洛沙姆f127和0.2wt％二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸为表面活性剂的超纯水作为水相，两相的混合，在功率为50w超声1min，获得锌卟啉水包油型乳液；

(2)锌卟啉水包油型乳液分散到较大体积的水相中(1:20)，功率为180w下超声1min混匀，得到大水相的锌卟啉水包油乳液；

(3)液氮迅速冰冻，真空冻干40h，得到锌卟啉纳米晶粉末；

(4)将锌卟啉纳米晶粉末在超纯水中重悬，经超高离心力(780000g，30min)反复3次的溶解-离心-再溶解步骤，进行纯化，得到纯度较高的锌卟啉纳米晶fa-znpcnds。

实施例4

本实施例进行肿瘤细胞对不同锌卟啉纳米晶的内吞分析

锌卟啉纳米晶与肿瘤细胞间的亲和力越大，其在肿瘤病灶部位及进入肿瘤细胞的累积量就会越多，因此光声成像和光动力学治疗效果也相应越好。在纳米晶制备过程中，表面活性剂中加入二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸分子，能够将叶酸分子修饰到纳米晶的表面，为了验证叶酸分子提高纳米晶对肿瘤细胞的靶向能力，开展了纳米晶体外细胞内吞实验。结果如图5所示，肿瘤细胞对未经靶向修饰的锌卟啉纳米晶内吞速率及内吞量均最少。叶酸分子通过与肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体相互作用，可大幅增强纳米晶与肿瘤细胞间的亲和力，从而增加了肿瘤细胞的内吞量。正如所预期的，激光共聚焦显微分析(如图6a和图6b所示)与透射电镜成像分析(如图7a和图7b所示)也得到一致的结果，叶酸靶向分子的修饰提高了肿瘤细胞对锌卟啉纳米晶的摄取量。

实施例5

本实施例进行不同锌卟啉制剂在肿瘤细胞内产单线态氧分析

锌卟啉纳米晶在肿瘤细胞内产单线态氧的能力，决定了光动力学治疗的效果。激光共聚焦数据图如图8中的a图所示(与实施例4中透射电镜成像为不同的颗粒)，靶向修饰的锌卟啉纳米晶组产单线态氧能力明显高于未靶向修饰组(如图8中的b图所示)，由于叶酸修饰促进了肿瘤细胞对锌卟啉纳米晶的内吞量。流式细胞仪检测(如图8中的c图所示，其中每个组别中的柱状从左至右依次为znpc、znpcnds、fa-znpcnds)进一步证实了以上结论。

实施例6

本实施进行体内光声成像和光动力学治疗分析

为研究锌卟啉纳米晶在体内肿瘤光声成像的效果，成功构建荷瘤小鼠模型后，分别用znpc、znpcnds和fa-znpcnds对小鼠进行尾静脉给药，将小鼠用2.5％的异氟烷麻醉，在注射前和注射后2h、10h、20h、用光声成像仪采集小鼠图像。结果如图9所示，znpc制剂注射的荷瘤小鼠其在肿瘤部位表现出较弱的光声信号，锌卟啉纳米晶制剂组可以在肿瘤部位检测出明显的光声信号，并且叶酸靶向修饰能够帮助锌卟啉纳米晶实现肿瘤靶向富集能力的大幅增强，进一步提升光声信号强度。借助泊洛萨姆f127的作用，锌卟啉纳米晶制剂能够成功逃避内皮网状系统吞噬，被动靶向富集到肿瘤病灶部位。当到达肿瘤部位后，叶酸又进一步促进了肿瘤细胞的内吞作用。因此，在注射20小时后，依然能够检测到肿瘤部位较强的光声信号。

实施例7

本实施例进行不同锌卟啉制剂毒副作用分析

锌卟啉纳米晶展示出了良好的抗肿瘤效果，进一步评估其潜在的毒副作用。在对荷瘤小鼠进行光动力学治疗的同时，通过检测小鼠的体重变化来作为不同给药组综合毒性评价的指标，药物的毒性越大体重变化的幅度越大。从体重变化图(如图10)中看出，锌卟啉纳米晶给药组小鼠的体重在给药期间始终保持在一个稳定的水平，未出现明显波动，这说明锌卟啉纳米晶具有较低的毒副作用。

过敏反应、血液毒性和综合毒性评估锌卟啉纳米晶的毒副作用，结果如图11所示，锌卟啉纳米晶给药组小鼠的ige(血清免疫球蛋白)水平与pbs对照组几乎无显著差异，这说明本发明所述制备的锌卟啉纳米晶制剂可以有效避免相应过敏反应的发生，这也极大减轻了患者因过敏反应而带来的不适，提高患者的顺应性。

用血球分析仪检测白细胞(whitebloodcell，wbc)和血小板(platelet，plt)的数量变化，过对各组小鼠接受最后一次药物注射之后血液中wbc(如图12所示)和plt(图13所示)的例进行检测发现，锌卟啉纳米晶制剂在血液毒性上的理想表现不仅更好地保证了治疗的安全性，而且还使得通过加大给药剂量提升治疗效果成为可能。

对比例1

本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(3)中使用超低温冷却槽进行速冻，而不使用液氮速冻。

结果：超低温冷冻无法实现液氮快速冻结的效果，不能实现高效的纳米晶限域效果，制备的纳米晶尺寸不均一。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的锌卟啉纳米晶及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。