一类高稳定性新型树枝状分子影像探针及其制备方法与流程

本发明涉及分子影像探针，尤其是涉及核心和支化中心均为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)衍生物与金属离子配位结构的一类高稳定性新型树枝状分子影像探针及其制备方法。

背景技术：

分子影像学是一个在活体中研究细胞或分子层面生物学过程的新兴领域。分子影像学的发展有利于人们了解疾病的发生发展过程以及疾病的早期诊断和治疗。目前常见的分子影像学技术有磁共振成像(mri)、荧光成像、正电子发射断层成像(pet)、单电子发射断层成像(spect)、电子计算机断层扫描(ct)以及超声成像等。这些成像技术往往需要成像探针的辅助来提高病灶信号强度或对比度。在这些探针中，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)衍生物与金属离子的配合物是一类典型而重要的探针。特别是一些dota衍生物与钆(以及)、镓-68(netspot^tm)及镥-177的配合物已经被美国食品药品监督管理局批准用于临床。这些dota及其衍生物的金属配合物可以被用于临床的一个重要原因是配合物的稳定性很高，在体内不容易释放有毒性金属离子。近些年在临床上发现钆的dota配合物会在病人脑部沉积，造成人们对配合物分子影像探针新的安全性疑虑，临床上和基础研究中急需具有更高稳定性以及更好成像性质的分子影像探针(huckle,jamese.etal.,investigativeradiology,2016,51:236)。

树枝状分子因具有单分散性好、合成简单可控、大小在纳米尺度而结构精确可设计等优点在近年备受医药卫生领域关注(tomalia,d.a.etal.,journalofinternalmedicine,2014,276:579)。将金属配合物结构与树枝状大分子结构结合可以有效提高探针的成像性质。margerum及bryant等人将gd³⁺-dota衍生物结构分别连接到第2-10代pamam(聚酰胺-胺)树枝状分子上，发现得到的新造影剂的弛豫效能均不同程度地高于商品化造影剂，且新造影剂在体内的循环时间也更长(margerum,lawrenced.etal.,journalofalloysandcompounds,1997,249:185；bryant,l.henryetal.,journalofmagneticresonanceimaging,1999,9:348)。中国专利zl200910052789.4公开了一种肿瘤靶向非离子型的树状大分子磁共振成像造影剂及其制备方法。将连有peg和叶酸的dtpa偶联到pamam树枝状分子表面，使得到的造影剂不仅能在体

内停留更长时间，还能在肿瘤组织富集。中国专利zl201010286508.4公开了一种肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备方法，主要是通过将peg、双功能配体及具有肿瘤靶向作用的t7肽负载到pamam树枝状分子上，最后与氯化钆螯合得到。中国专利zl201210585092.5公开了一种可降解树枝状大分子磁共振造影剂及其制备方法。

已有的树枝状分子影像探针的研究及专利大部分是在树枝状分子材料的表面连接具有影像功能的结构，目前尚没有以金属离子和dota衍生物配位结构为核心和支化中心的树枝状分子影像探针被报道。除此之外，树枝状分子影像探针的稳定性也未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一类高稳定性新型的树枝状分子影像探针。

本发明的第二目的是提供一类高稳定性新型的树枝状分子影像探针的制备方法。

所述一类树枝状分子影像探针的分子的核心和支化中心均为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)衍生物与金属离子的配位结构，分子的表面可以根据需要修饰多种具有生物医药价值的结构，其结构式为：

其中，a～y可以独立地是任何正整数，g1,g2,……,gn表示树枝状分子代数，n为正整数；

r0的结构式如下：

其中，m表示金属离子，*号表示与r1的连接位点；m可为gd³⁺、mn²⁺、fe³⁺、eu²⁺、eu³⁺、tb³⁺、⁶⁴cu²⁺、⁶⁸ga³⁺、¹⁷⁷lu³⁺等，优选gd³⁺、mn²⁺、tb³⁺、¹⁷⁷lu³⁺等。

r1的结构式如下：

其中，m表示金属离子，*号表示与r0或者r1或者r2的连接位点；m可为gd³⁺、mn²⁺、fe³⁺、eu²⁺、eu³⁺、tb³⁺、⁶⁴cu²⁺、⁶⁸ga³⁺、¹⁷⁷lu³⁺等，优选gd³⁺、mn²⁺、tb³⁺、¹⁷⁷lu³⁺等。

r2可以是但不仅限于羟基、胺基、甲基、乙酰基、peg、两性离子、配合物、靶向分子、蛋白质等具有生物医药价值的结构中的至少一种。

所述一类树枝状分子影像探针的制备方法包括以下步骤：

1)合成树枝状分子零代，其分子结构式如下：

2)将步骤1)产品的羧基与do3atbu-nh2缩合，do3atbu-nh2的结构式如下：

3)将步骤2)产品的叔丁基脱去，得到新一代的树枝状分子；

4)根据需要重复步骤2)到步骤3)的过程可得到不同代数的树枝状分子；

5)根据需要可进一步将步骤3)或步骤4)的产品表面的羧基修饰为其他具有生物医药价值的结构；

6)将步骤3)或步骤4)或步骤5)的产品与金属离子螯合得到不同代数、不同表面官能团的树枝状分子影像探针。

在步骤1)中，所述合成树枝状分子零代的步骤可为：

1.1)低温下将氯乙酰氯的二氯甲烷溶液加入boc-乙二胺的二氯甲烷溶液中，反应过夜，用水萃取洗涤反应液，有机层旋蒸得ca-eda-boc产品，其结构式如下：

1.2)将步骤1.1)的产品与轮环藤宁(1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、碘化钾、碳酸钾在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)50～80℃下反应3～48h，反应液溶于氯仿或二氯甲烷后用水萃取洗去杂质，有机层旋蒸后得到产品dota-4eda-boc，其结构式如下：

1.3)将步骤1.2)的产品在盐酸中搅拌2～24h，脱去boc保护后再用三乙胺中和盐酸，旋蒸得到产品dota-4eda，其结构式如下：

1.4)将步骤1.3)的产品与丙烯酸甲酯在甲醇中反应3～48h，反应液经过萃取、旋蒸得到甲酯保护的树枝状分子零代；

1.5)将步骤1.4)的产品在氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化锂的甲醇水溶液中磁搅拌水解反应，所得反应液再冰浴下用酸中和，最后旋蒸得树枝状分子零代。

在步骤2)中，所述将步骤1)产品的羧基与do3atbu-nh2缩合使用的缩合剂可为edc·hcl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、hobt(1-羟基苯并三唑)，所述羧基、edc·hcl、hobt、do3atbu-nh2的摩尔比可为1∶(1～50)∶(1～50)∶(1～50)，反应溶剂可为dmf，反应的温度可为10～60℃，产品通过萃取或者透析或者柱色谱方法纯化。

在步骤3)中，所述将步骤2)产品的叔丁基脱去，可使用三氟乙酸脱叔丁基保护，使用四氢呋喃沉淀产品，产品再通过萃取或者透析或者柱色谱方法纯化。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

目前大部分树枝状分子影像探针的影像功能单元都是在树枝状分子表面，在本发明中，在树枝状分子内部引入影像功能单元，这一方面可以为材料的表面留出更多的位点进行进一步的多功能化修饰，另一方面又可以在树枝状分子代数较小时就负载较多的造影功能单元，负载效率更高。在合成上，首次使用do3atbu-nh2作为构建树枝状分子骨架的基元，实现了在树枝状分子内部引入dota配位穴的目的。在功能上，本发明所得到的新型树枝状分子影像探针拥有比商品化探针更好的成像性质及更高的稳定性。

附图说明

图1为实施例1制备的甲酯保护的树枝状分子零代¹hnmr谱图。

图2为实施例1制备的树枝状分子零代的maldi-tof质谱图。

图3为实施例2制备的1至4代pdota树枝状分子(pdota-g1～g4)的maldi-tof质谱图。

图4为实施例3制备的gd-g1～g4树枝状分子磁共振成像造影剂及对照组gd-dota在1m盐酸溶液中横向弛豫时间随时间的变化图。

图5为实施例4制备的mn-g1～g4树枝状分子磁共振成像造影剂及对照组mn-dota在0.1m盐酸溶液中横向弛豫时间随时间的变化图。

图6为实施例5制备的铽的pdota-g1～g4树枝状分子荧光成像探针(tb-g1～g4)及对照组tb-dota在488nm光激发下的细胞荧光成像图片。

图7为实施例6制备的表面peg修饰的gd-g4(gd-g4-peg)及对照组gd-dota在3.0t磁场下的体外t1加权像对比图(自旋回波序列，tr＝20ms，te＝6.9ms，从左至右钆离子浓度依次为1.0、0.4、0.2、0.1、0.05mm)。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1

树枝状分子零代的制备：

a)ca-eda-boc的制备：

将boc-乙二胺16g(100mmol)、三乙胺11g(109mmol)溶于200ml二氯甲烷中并置于-78℃搅拌冷却。将氯乙酰氯8ml(100mmol)溶于100ml二氯甲烷中，氮气保护、磁搅拌下缓慢加入boc-乙二胺溶液中，加完后继续搅拌，缓慢升至室温，将反应液转移至分液漏斗，用3×100ml水洗，有机层旋蒸得ca-eda-boc白色固体产品，产率85％。

b)dota-4eda-boc的制备：

将轮环藤宁0.25g(1.45mmol)、ca-eda-boc1.60g(6.76mmol)、碳酸钾1.2g(8.7mmol)、碘化钾1.2g(7.23mmol)溶于8mldmf，氮气保护下将此反应液于70℃磁搅拌加热24h，然后将反应液转移至分液漏斗，溶于100ml氯仿，用3×50ml水洗，有机层旋蒸得到dota-4eda-boc固体产品，产率87％。

c)dota-4eda的制备：

磁搅拌下将dota-4eda-boc0.40g(0.41mmol)加入8ml1m盐酸水溶液中，室温磁搅拌12h，再加入4ml甲醇，冰浴磁搅拌下再加入三乙胺1.4ml(10mmol)，旋蒸除去溶剂得到dota-4eda与三乙胺盐酸盐的混合物。

d)甲酯保护的树枝状分子零代的制备：

将步骤c)中全部产品溶于3ml甲醇，氮气保护、冰浴搅拌下将此溶液缓慢注入1ml丙烯酸甲酯(11mmol)的1ml甲醇溶液中，加完后密封反应体系，室温搅拌24h。再将反应液溶于20ml氯仿，用3×10ml水洗涤，有机层用无水硫酸镁干燥后旋蒸得到淡黄色油状物产品，产率98％，产品核磁图如图1。

e)树枝状分子零代的制备：

将步骤d)产品0.12g(0.095mmol)溶于2ml甲醇和1ml水的混合溶液，再加入单水氢氧化锂0.050g(1.2mmol)，室温搅拌12h，再向反应中加1ml水，用1m氢氟酸水溶液调节ph为4.1，离心，上清液旋蒸得到白色胶状固体，产率100％，产品maldi-tof质谱图如图2。

实施例2

1～4代树枝状分子(pdota-g1～g4)的制备：

a)pdota-g1-tbu的制备：

于树枝状分子零代产品(0.095mmol)先后加入do3atbu-nh20.75g(1.22mmol)、dmf5ml、dipea500ul(2.88mmol)、hobt0.32g(2.37mmol)以及edc·hcl0.50g(2.6mmol)，室温磁搅拌反应2天。反应液用100ml氯仿溶解后再用3×50ml水萃取洗。将氯仿旋掉后产品再溶于10ml乙醇，此溶液再装入透析袋中，以乙醇为透析液进行透析。最后旋蒸干燥透析袋中的溶液，得到pdota-g1-tbu固体产品，产率66％。

b)pdota-g1的制备：

磁搅拌下将pdota-g1-tbu0.059g加入3ml三氟乙酸中，室温磁搅拌1h。再将三氟乙酸旋蒸除去，剩余物加入四氢呋喃析出白色固体，固体离心去上清后再用四氢呋喃分散-离心-去上清洗三遍后于真空干燥箱干燥，得pdota-g1固体产品，产率100％。

c)pdota-g2～g4的制备：

pdota-g1固体产品0.01g溶于1mldmf，再依次加入100uldipea、0.078ghobt、0.31gdo3atbu-nh2及0.11gedc·hcl。反应于30℃加热磁搅拌过夜，旋蒸除去dmf。再向反应液加入3ml三氟乙酸，室温磁搅拌4h，再旋蒸除去三氟乙酸。再加入四氢呋喃，析出白色固体。离心除去上清，得到的固体再用四氢呋喃分散-离心-去上清洗3遍。得到的白色固体再用水溶解，转移至超滤管，超滤3遍。再旋蒸除去上管产品溶液中的溶剂水，得到pdota-g2固体产品。

将上述制备流程的原料改为pdota-g2或pdota-g3即可制备pdota-g3或pdota-g4。

pdota-g1～g4产品的maldi-tof质谱图如图3。

实施例3

钆的pdota-g1～g4树枝状分子磁共振成像造影剂(gd-g1～g4)的制备、弛豫效能测定及稳定性评估：

将0.02gpdota-g1～g4分别溶于12mlph＝6的mes缓冲液，再磁搅拌下分别加入0.037g无水氯化钆，35℃加热磁搅拌过夜。反应液再分别转移至超滤管，用去离子水超滤纯化3遍，分别冻干上管产品溶液得到gd-g1～g4白色固体产品。

将得到的gd-g1～g4产品及对照样品gd-dota分别配成不同浓度的1×pbs溶液，测定0.5t磁场下不同浓度溶液的弛豫时间，计算弛豫效能(实施例3制备的钆的pdota-g1～g4树枝状分子磁共振成像造影剂(gd-g1～g4)及对照组gd-dota在0.5t磁场下的弛豫率值参见表1)，由表1可知，gd-g1～g4树枝状分子配合物造影剂的弛豫效能均明显高于临床上使用的gd-dota造影剂。

表1

将得到的gd-g1～g4产品及对照样品gd-dota按照相同钆离子浓度分别溶于1m的盐酸溶液，测定溶液的横向弛豫时间随时间变化，结果如图4所示。gd-dota在50h内即酸解完全(横向弛豫时间不再变化)，而gd-g2～g4需要超过1000h才能完成酸解，说明gd-g2～g4的稳定性明显高于gd-dota。

实施例4

锰的pdota-g1～g4树枝状分子磁共振成像造影剂(mn-g1～g4)的制备、弛豫效能测定及稳定性评估：

将0.02gpdota-g1～g4分别溶于12mlph＝6的mes缓冲液，再磁搅拌下分别加入0.028g四水合氯化锰，35℃加热磁搅拌过夜。反应液再分别转移至超滤管，用去离子水超滤纯化3遍，分别冻干上管产品溶液得到mn-g1～g4白色固体产品。

将得到的mn-g1～g4产品及对照样品mn-dota分别配成不同浓度的1×pbs溶液，测定0.5t磁场下不同浓度溶液的弛豫时间，计算弛豫效能(实施例4制备的锰的pdota-g1～g4树枝状分子磁共振成像造影剂(mn-g1～g4)及对照组mn-dota在0.5t磁场下的弛豫率值参见表2)，由表2可知，mn-g1～g4树枝状分子造影剂的弛豫效能均明显高于mn-dota造影剂。

表2

将得到的mn-g1～g4产品及对照样品mn-dota按照相同锰离子浓度分别溶于0.1m的盐酸溶液，测定溶液的横向弛豫时间随时间变化，结果如图5所示。mn-dota在20min内即酸解完全(横向弛豫时间不再变化)，而mn-g1～g4需要超过1500min才能完成酸解，说明mn-g1～g4的稳定性明显高于mn-dota。

实施例5

铽的pdota-g1～g4树枝状分子荧光成像探针(tb-g1～g4)的制备及细胞成像应用：

将0.02gpdota-g1～g4分别溶于12mlph＝6的mes缓冲液，再磁搅拌下分别加入0.052g六水合氯化铽，35℃加热磁搅拌过夜。反应液再分别转移至超滤管，用去离子水超滤纯化3遍，分别冻干上管产品溶液得到tb-g1～g4白色固体产品。

将得到的tb-g1～g4产品及对照样品tb-dota分别配成3mm的1×pbs溶液，按照0.3mm的浓度与细胞共孵育4h，再用1×pbs溶液洗去上清，于488nm激发光下进行细胞荧光成像。如图6所示，tb-g2～g4均能很好地保留于细胞并发射荧光，从而实现细胞的荧光成像，而tb-dota及tb-g1难以在细胞中保留而无法实现细胞荧光成像。说明tb-g2～g4具有潜在的细胞荧光成像价值。

实施例6

表面peg修饰的gd-g4(gd-g4-peg)树枝状分子磁共振成像造影剂的制备及成像性能：

a)g4-peg的制备：

0.04gpdota-g4溶于8mldmf，再磁搅拌下依次加入400uldipea、0.312ghobt、0.1gpeg1k-nh2及0.44gedc·hcl，反应于30℃加热磁搅拌过夜。将反应液加入乙醚中，立即有白色浑浊产生。离心去上清，固体加20ml去离子水溶解后转移至超滤管，用去离子水超滤三遍，将上管产品溶液冻干得到黄白色固体产品。

b)gd-g4-peg的制备：

将0.04gg4-peg溶于12mlph＝6的mes缓冲液，再磁搅拌下加入0.037g无水氯化钆，35℃加热磁搅拌过夜。反应液再转移至超滤管，用去离子水超滤纯化3遍，冻干上管产品溶液得到gd-g4-peg固体产品。

将得到的gd-g4-peg产品及对照样品gd-dota分别配成不同浓度的1×pbs溶液，进行3.0t磁场下不同浓度溶液的t1成像。如图7所示，相同浓度下gd-g4-peg的t1磁共振图像信号明显高于gd-dota，说明gd-g4-peg的t1造影效果明显优于临床上使用的gd-dota造影剂。