一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法与流程

本发明涉及妇科用药技术领域，具体涉及一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法。

背景技术：

白色念珠菌是一种条件致病菌，念珠菌病是由念珠菌属引起的感染，可能发生在皮肤、眼睛、口腔、食道、胃肠道、阴道和血管系统。外阴阴道念珠菌病(vvc)是常见的女性阴道疾病。据统计，在全球范围内，vvc是人类最常见的真菌感染，超过75％的女性在她们的一生中至少发作一次，5％-8％的女性则会反复发作。外阴阴道炎念珠菌病(vvc)临床表现为阴道和外阴组织瘙痒，疼痛和灼热感，阴道分泌物增多，从而影响女性生活质量。

目前，以阴道内局部给药或口服制剂形式提供唑类抗真菌剂通常被推荐为首选治疗方法。然而，这类抗真菌剂谱窄和较大的毒性作用，且由于过度使用抗真菌剂存在潜在耐药性威胁，低剂量或单剂量治疗等因素导致外阴阴道炎念珠菌病(vvc)复发率上升。因此，天然来源物质抗菌治疗vvc已成为越来越多阴道炎药物开发的方向。

无患子，亦称洗手果、油罗树，一种生长于热带地区的落叶乔木，具有抗炎，镇痛，抗肿瘤活性等功能，其根、皮、叶、果皮、种子等均具有很强的药用价值，是不可多得的自然资源。无患子果皮中含有丰富的皂苷，已有研究表明无患子皂苷体外具有抗菌活性，且无患子取材便利，具有良好的产品开发前景。

无患子果皮的提取方法种类较多，包括水提醇沉法、正丁醇萃取法、超滤膜分离法、大孔树脂法以及微生物发酵法等。其中，水提醇沉法应用最为普遍，但所的产品皂苷纯度不高。近几年来，微生物发酵法应用十分广泛，一些通过物化方法较难去除的大分子物质，可通过微生物进行分解，效果十分显著。并且，微生物发酵法其产品纯度比常规水提法所得产品纯度高，同时在发酵过程中可对皂苷进行改性，从而提高皂苷有效成分的生物活性。

原位凝胶，是一类以溶液状态给药，能在用药部位发生相转变，由液态转化成非化学交联半固体凝胶的制剂。原味凝胶具有很好的生物相容性，在给药部位能够具有有效的停留时间，从而保证药物的作用，是一种新型的给药系统。

技术实现要素：

本发明的首要目的是针对现有治疗白色念珠菌性阴道炎药物的不足，在于提供一种制备简单，毒副作用小，抗白色念珠菌效果显著的治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法。

本发明的另一目的是，针对现有治疗白色念珠菌的产品存在的给药方式的局限性，在于提供上述原位凝胶制剂的新型阴道给药系统。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂的制备方法，以无患子水提发酵浓缩液为主要活性成分，根据其皂苷含量配置成合适浓度的水提发酵液，并将该水提发酵液制备成温度敏感型凝胶；主要通过以下步骤实现：

步骤一、制备无患子水提发酵浓缩液

(1.1)将无患子干果皮粉碎，在40℃的条件下将粉末与水按质量比1:3混合提取6h，过滤得到第一次滤液和滤渣。

(1.2)在40℃的条件下，将滤渣与水按1:2的质量比例混合提取4h，过滤得到第二次滤液，弃去滤渣；

(1.3)合并第一次滤液和第二次滤液，得到无患子皂苷粗滤液。将无患子皂苷粗滤液以5000r/min离心10min得到无患子水提液；

(1.4)将无患子水提液于蒸发设备中浓缩得到无患子皂苷浓缩液。

(1.5)以1.0％为接种量，向无患子皂苷浓缩液中接种葡萄酒干酵母，在30℃下发酵4d得到无患子水提发酵浓缩液。

步骤二、测定无患子水提发酵浓缩液中皂苷的含量

(2.1)标准曲线的制作：配置1mg/ml齐墩果酸标准溶液。取干燥洁净的试管，分别加入0,30,60,90,120,150μl齐墩果酸标准溶液，置于50℃水浴烘干，先后加入0.4ml5％(wt％)香草醛-冰醋酸溶液和1.4ml分析纯高氯酸为显色剂，震荡混匀。置于70℃水浴中加热20min，冰水浴冷却至室温，再加入10ml冰醋酸作为溶剂，充分混匀。用紫外分光光度计在540nm处测定吸光度；

(2.2)样品测定：将无患子水提发酵浓缩液稀释倍数，取100μl稀释液于试管中，重复上述操作测定无患子水提发酵浓缩液中皂苷的含量。

步骤三、制备无患子原位凝胶制剂

在3-6℃下，取聚乙二醇400溶解到无患子水提发酵浓缩液中，混合均匀，加入泊洛沙姆407和泊洛沙姆188溶胀完全，添加蒸馏水，混匀后得到无患子原位凝胶制剂。

所述步骤(1.1)中，将无患子干果皮粉碎至20-60目，可以是20目、30目、40目、50目或60目等。

所述步骤(1.4)中，浓缩倍数为6-7倍；

所述步骤(1.5)中，将葡萄酒干酵母接种于无患子皂苷浓缩液的四倍稀释液中，活化介质简单、操作简易，时间短。

所述步骤(2.2)中，无患子水提发酵浓缩液稀释倍数为10-100倍，可以是10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。

所述步骤三中，无患子原位凝胶制剂制备温度为3-6℃，可以是3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃、5.5℃或6℃等。

所述步骤三中，所用无患子水提发酵浓缩液中皂苷浓度为10-80mg/ml，例如可以是10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、60mg/ml或80mg/ml等。

所述步骤三中，泊洛沙姆407的添加量为16-22份，例如可以是16份、17份、18份、19份、20份、21份或22份等。

所述步骤三中，泊洛沙姆188的添加量为0.1-5份，例如可以是0份、0.5份、1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份或5份等。

所述步骤三中，聚乙二醇400的添加量为0.1-3份，例如可以是0份、0.5份、1份、1.5份、2份、2.5份或3份等。

所述步骤三中，无患子水提发酵浓缩液的添加量为50份。

本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：

1.本发明直接采用无患子果皮进行提取，操作步骤简单易行，效率高，且无患子果皮取材方便，简单易得。

2.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂，具有制备简单，毒副作用小，抗白色念珠菌效果显著的特点，其作用于白色念珠菌的最低抑菌浓度(mic)可低至0.0625mg/ml(以皂苷含量计)。

3.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂，能够弥补抗生素类药物的不足，降低白色念珠菌性阴道炎的复发率。

4.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂，能够实现原位治疗，延长药物有效停留时间，是一种新型阴道给药系统。

5.本发明得到的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂，药理实验证明对白色念珠菌具有显著抑制作用，经动物实验证明，能够明显改善白色念珠菌性小鼠的病症。

附图说明

图1为感染白色念珠菌atcc10231后的小鼠阴道灌洗液真菌载量图。

图2为不同免疫标志物水平图。其中，(a)为il-1β，(b)为il-6，(c)为il-8，(d)为ldh。

图3为小鼠阴道组织病理切片图。其中，(a)为il-1β，(b)为il-6，(c)为il-8，(d)为ldh。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式做进一步的详细描述，但这些实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。

无患子水提发酵浓缩液的制备：

将无患子干果皮粉碎至20-60目，在40℃的条件下将此粉末与水按质量比1:3提取6h，过滤得到第一次滤液和滤渣。在同样的温度条件下，将滤渣再与水按1:2的比例提取4h，过滤得到第二次滤液，弃去滤渣，合并两次滤液，得到无患子皂苷粗滤液。将粗滤液以6000r/min离心10min得到无患子水提液，于蒸发设备中浓缩6倍得到无患子皂苷浓缩液。选择葡萄酒干酵母为发酵菌株，以1.0％接种量，在30℃下发酵4d得到无患子水提发酵浓缩液。

实施例1

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂的制备方法，其中，无患子原位凝胶制剂包括如下重量的组分：50份无患子水提发酵浓缩液(20mg/ml以皂苷记)，20份泊洛沙姆407，3份泊洛沙姆188，2份聚乙二醇400，蒸馏水补齐至100份，无患子原位凝胶制剂中无患子皂苷浓度为10mg/ml。

本实施例无患子原位凝胶制剂的制备方法如下：

在4℃下，按重量份数称取聚乙二醇400溶解到50份无患子水提发酵浓缩液中，混合均匀，加入泊洛沙姆407和泊洛沙姆188溶胀完全，继续加蒸馏水至100份，混匀后得到无患子原位凝胶制剂。

实施例2

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂的制备方法，其中，无患子原位凝胶制剂包括如下重量的组分：无患子水提发酵浓缩液50份(30mg/ml以皂苷记)，20份泊洛沙姆407，3份泊洛沙姆188，2份聚乙二醇400，蒸馏水补齐至100份，无患子原位凝胶制剂中无患子皂苷浓度为15mg/ml。

本实施例无患子原位凝胶制剂的制备方法如下：

在5℃下，按重量份数称取聚乙二醇400溶解到50份无患子水提发酵浓缩液中，混合均匀，加入泊洛沙姆407和泊洛沙姆188溶胀完全，继续加蒸馏水至100份，混匀后得到无患子原位凝胶制剂。

实施3

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂的制备方法，其中，无患子原位凝胶制剂包括如下重量的组分：无患子水提发酵浓缩液50份(60mg/ml以皂苷记)，20份泊洛沙姆407，3份泊洛沙姆188，2份聚乙二醇400，蒸馏水补齐至100份，无患子原位凝胶制剂中无患子皂苷浓度为30mg/ml。

本实施例无患子原位凝胶制剂的制备方法如下：

在5.5℃下，按重量份数称取聚乙二醇400溶解到50份无患子水提发酵浓缩液中，混合均匀，加入泊洛沙姆407和泊洛沙姆188溶胀完全，继续加蒸馏水至100份，混匀后得到无患子原位凝胶制剂。

实施例4

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂的制备方法，其中，无患子原位凝胶制剂包括如下重量的组分：无患子水提发酵浓缩液50份(80mg/ml以皂苷记)，20份泊洛沙姆407，3份泊洛沙姆188，2份聚乙二醇400，蒸馏水补齐至100份，无患子原位凝胶制剂中无患子皂苷浓度为40mg/ml。

本实施例无患子原位凝胶制剂的制备方法如下：

在6℃下，按重量份数称取聚乙二醇400溶解到50份无患子水提发酵浓缩液中，混合均匀，加入泊洛沙姆407和泊洛沙姆188溶胀完全，继续加蒸馏水至100份，混匀后得到无患子原位凝胶制剂。

实施例5

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例1的区别仅在于，无患子水提发酵浓缩液50份(30mg/ml以皂苷记)。

实施例6

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例1的区别仅在于，无患子水提发酵浓缩液50份(40mg/ml以皂苷记)。

实施例7

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例1的区别仅在于，无患子水提发酵浓缩液50份(50mg/ml以皂苷记)。

实施例8

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例1的区别仅在于，无患子水提发酵浓缩液50份(60mg/ml以皂苷记)。

实施例9

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例1的区别仅在于，无患子水提发酵浓缩液50份(70mg/ml以皂苷记)。

实施例10

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例1的区别仅在于，无患子水提发酵浓缩液50份(80mg/ml以皂苷记)。

对比例1

本实施提供了一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂及制备方法，与实施例4的区别仅在于，未添加无患子水提发酵浓缩液。

按如下方法，对本发明实施例1-10和对比例1提供的原位凝胶制剂的性能进行测试：

无患子水提发酵浓缩液皂苷含量测定

标准曲线的制作：配置1mg/ml齐墩果酸标准溶液。取干燥洁净的试管，分别加入0,30,60,90,120,150μl齐墩果酸标准溶液，置于50℃水浴烘干，先后加入0.4ml5％(wt％)香草醛-冰醋酸溶液和1.4ml分析纯高氯酸为显色剂，震荡混匀。置于70℃水浴中加热20min，冰水浴冷却至室温，再加入10ml冰醋酸作为溶剂，充分混匀。用紫外分光光度计在540nm处测定吸光度；得到齐墩果酸含量y(μg)的计算方程，y(μg)＝0.0056*od-0.0491，r²＝0.9995。

无患子皂苷含量的测定：将无患子皂苷提取液稀释50倍，取100μl稀释液于20ml比色管中，然后将该稀释液按照上述方法测定吸光度，计算齐墩果酸含量y(μg)，，样品重复测定三次。将三次测定结果计算算术平均值，代入如下方程计算出无患子皂苷的含量。

无患子皂苷含量与齐墩果酸含量的计算方程：皂苷的含量＝y(μg)×2.3。

无患子水提发酵液最低抑菌浓度测定(mic测定)

方法：实验菌株采用标准菌株白色念珠菌atcc10231，挑取菌落采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为10⁶cfu/ml的菌液待用。

将12支试管排成一列、编号，各加入双倍营养的固体培养基(sda培养基)1ml，在第一管内加入1ml待测样品(浓度为10mg/ml，溶剂为蒸馏水)，混匀后吸取1ml到第2管，混匀再取1ml到第3管，依次类推到第9管，弃去1ml，第11管以生理盐水作空白对照，第12管加氟康唑作阳性对照。121℃高压蒸汽灭菌，待培养基凝固后，每管加入上述配制好的菌悬液20μl，置于30℃培养箱中静置培养24-48h。观察结果判定：培养基表面无菌落表示无细菌生长，有菌落表示有细菌生长，以能抑制细菌生长的无患子皂苷提取液最高稀释度作为其最低抑菌浓度(mic)。

无患子原位凝胶制剂最低抑菌浓度测定(mic测定)

方法：实验菌株采用标准菌株白色念珠菌atcc10231，挑取菌落采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为10⁶cfu/ml的菌液待用。

将12支试管排成一列、编号，各加入双倍营养的固体培养基(sda培养基)1ml，在第一管内加入1ml洗面奶(浓度为10mg/ml，溶剂为蒸馏水)，混匀后吸取1ml到第2管，混匀再取1ml到第3管，依次类推到第9管，弃去1ml，第11管以生理盐水作空白对照，第12管加氟康唑作阳性对照。121℃高压蒸汽灭菌，待培养基凝固后，每管加入上述配制好的菌悬液20μl，置于30℃培养箱中静置培养24-48h。观察结果判定：培养基表面无菌落表示无细菌生长，有菌落表示有细菌生长，以能抑制细菌生长的无患子皂苷提取液最高稀释度作为其最低抑菌浓度(mic)。

无患子原位凝胶制剂体内抑菌效果评价(以实施案例1为例)

无患子原位凝胶制剂体内动物实验

(1)小鼠念珠菌型阴道炎模型建立

取26只八周龄icr小鼠，随机挑出5只作为空白对照组，剩余21只隔天皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1mg/只)刺激假发情，连续注射一周。最后一次刺激后，小鼠感染由pbs缓冲液配置的白色念珠菌菌悬液(10⁸cfu/ml)，通过移液枪靠近阴道口的方式感染，每只20μl，连续感染2d。然后，小鼠恢复48h以利于白色念珠菌的感染定植。48h后用pbs缓冲液灌洗阴道，取阴道灌洗液涂布sda琼脂平板确定真菌载量，根据平板计数结果随机将小鼠分为3组，即模型对照组，阳性对照(氟康唑)组，无患子原位凝胶组。

(2)分组给药

通过阴道灌注的方式，空白对照组和模型对照组灌注50μlpbs缓冲液，无患子原位凝胶组灌注10mg/ml的无患子原位凝胶制剂，阳性对照组灌注氟康唑原位凝胶制剂，每天一次，持续11d，并在第0,5,10,11d用50μlpbs缓冲液灌洗阴道三次，涂布于sda琼脂平板确定真菌载量。

(3)免疫学标志物和病理切片

取治疗第13d取阴道灌洗液，通过酶联免疫吸附(elisa)测定细胞因子(il-1β，il-6,il-8)和乳酸脱氢酶[ldh]。断颈法处死小鼠，取阴道组织，石蜡包埋，he染色，镜下观察病理变化，来判断无患子原位凝胶制剂效果。

上述性能测试的结果如下所示：

表1实施例1-14最低抑菌浓度mic

真菌载量

在vvc小鼠感染后治疗的11d中，测定了在0,5,10,11d的真菌载量，具体见图1。模型组的真菌载量在11d中都没有显著性差异(p＜0.05)，说明白色念珠菌定植成功；对照组(氟康唑)真菌载量在治疗第10d开始与模型组相比显著性下降(p＜0.05)，说明vvc小鼠模型建模成功。

第11d，无患子原位凝胶组和对照组与模型组之间呈现显著性差异(p＜0.05)，表明无患子原位凝胶与对照组一样，能有效抑制小鼠体内白色念珠菌生长。无患子原位凝胶的真菌载量持续降低，且第11d与第10d的真菌载量之间也存在显著性差异(p＜0.05)，说明无患子原位凝胶治疗作用从第10d开始逐渐显示。

免疫学标志物

与空白组相比，模型组的三个细胞因子(il-1β，il-6,il-8)均存在显著性差异(p＜0.05)，说明感染白色念珠菌确实会造成细胞因子水平上调，显示出明显的炎症反应；与模型组相比，对照组的三个细胞因子(il-1β，il-6,il-8)也存在显著性差异(p＜0.05)，说明本研究采用的氟康唑对白色念珠菌造成的炎症反应具有治疗作用，进一步说明本研究所建立的vvc建模在细胞因子水平上是可以深入探讨的。

图2显示，和模型组比，水提组的促炎因子il-1β无显著性差异，促炎因子il-6与趋化因子il-8存在显著性差异(p＜0.05)，说明无患子原位凝胶能够降低il-6和il-8两个炎症指标；且无患子原位凝胶的促炎因子il-6与趋化因子il-8水平与阳性对照组相当(p＜0.05)，说明治疗11d后，本研究采用的10mg/ml的无患子原位凝胶对il-6和il-8两个炎症指标的抑制作用与2mg/ml氟康唑相当。

乳酸脱氢酶(ldh)是组织损伤指标，可以用来判别由白色念珠菌引起的阴道组织损伤程度，ldh数值越高，表明阴道组织受白色念珠菌损伤程度越大。与空白组相比，模型组和对照组之间均存在显著性差异(p＜0.05)，说明本研究所建立的vvc模型在ldh指标上值得深入探讨。与模型相比，无患子原位凝胶的ldh水平显著下降(p＜0.05)，说明无患子原位凝胶能改善阴道组织损伤程度，具有治疗作用。与对照相比，无患子原位凝胶的ldh水平与之相当(p＜0.05)，说明治疗11d后，10mg/ml无患子原位凝胶在改善阴道组织损伤程度上与2mg/ml氟康唑相当。

病理切片

阴道组织病理切片能够直观地表现阴道组织的情况。阴道组织由管腔(l)，粘膜(m)和粘膜下层(sm)组成。如图3所示，空白组小鼠组织排列清晰，层次分明；模型组的粘膜层(m)增厚，部分上皮细胞严重坏死脱落，说明白色念珠菌感染主要影响粘膜层(m)，使其变厚。有研究报道，阴道粘膜被白色念珠菌感染后产生炎性反应，造成阴道黏膜水肿甚至炎性增生，使黏膜层增厚。与模型组相比，对照组、无患子原位凝胶的粘膜层(m)均有所变薄，上皮细胞仅有轻微脱落现象，表明两者都能不同程度地减轻白色念珠菌感染阴道组织的症状。

综上所述，本发明的一种治疗白色念珠菌性阴道炎的无患子原位凝胶制剂，在体外对白色念珠菌具有显著抑制作用，在体内能够有效降低vvc的炎症反应，是一种优良的vvc治疗药物，且制备简单，毒副作用小，无耐药性威胁。