桑树叶水提物粉末,其制备,抗炎作用及应用的制作方法

本发明涉及一种制备鲜桑树叶水提物粉末的方法,涉及由该方法制得的鲜桑树叶水提物粉末在制备抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
：在炎症触发的一系列疾病中,纤维化是最重要的疾病之一。例如,中枢神经系统的炎症可触发脑纤维化。癌转移是炎症触发的另一种致命性疾病。在死亡的癌症病人中因转移致死的比例高达90％。脑部的慢性炎症可能与多种代谢性疾病的发病相关,例如可能与肥胖症及糖尿病的发病相关。与脑部相联系,炎症可引起多种普通精神疾病。冠状动脉炎症或血管的慢性炎症则与动脉粥样硬化性心血管疾病相关。慢性炎症的另一个致命问题是与多种肿瘤发病相联系。例如慢性炎症与结肠癌的发病相联系。目前虽然分子机理还不清楚,但是炎症与情感障碍的关系已有大量报道。一直认为炎症是触发和延续沮丧,慢性疼痛及长期极度疲劳的机理。例如在肝病患者的行为和情感变化中炎症起到核心作用。炎症可触发早产与分娩。围产期炎症会害及成熟大脑的生理学和行为学。全身性炎症可影响神经发育。通过影响免疫系统,长期的慢性炎症可损害宿主。身体老化是绝大多数慢性病的最强风险因子,致使数种慢性病共患一身。炎症是数种慢性病共患一身的触发器。老年性肺结核与基础炎症状态有关。此外,炎症还与痴呆相关联。这样一来,开发无毒副作用的预防和治疗炎症的药物便越来越受到重视。虽然已经付出了巨大努力,可是一直取得没有实质性进展。桑树叶通常在春季枝叶茂盛时采摘,晒干或新鲜食用。例如晒干的桑树叶可以泡茶,鲜嫩的桑树叶可以炖汤或凉拌。民间认为桑树叶具有疏散风热,清肺润燥及清肝明目功效。发明人长期从事鲜桑树叶水提物粉末的化学成分及治疗作用研究。发明人对鲜桑树叶水提物粉末的化学组分进行质谱分析,发现了23种未见报道的组分,主要包括桂皮酰奎尼酸和多取代懈皮素。虽然报道过鲜桑树叶水提物粉末单一组分的生物活性,但是全组分联合的生物活性并不知情。通过反复研究发明人发现,这23种组分联合可治疗炎症。与所有桑树叶的已知发明相比,本发明的鲜桑树叶水提物粉末可治疗炎症的发明达到了一个全新高度。根据这些认识,申请人提出了本发明。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种制备鲜桑树叶水提物粉末的方法以及由该方法制备得到的鲜桑树叶水提物粉末,实验证明,由本发明制备得到的鲜桑树叶水提物粉末具有抗炎作用。为了达到所述目的,本发明采用了以下四方面的技术手段。第一方面的技术手段是提供了一种鲜桑树叶水提物粉末,分析鲜桑树叶水提物粉末的质谱总离子流图谱及对应的质谱峰的23种组分认定这种鲜桑树叶水提物粉末中含有11种奎尼酸类化合物及12种懈皮素类化合物；其中,所述的11种奎尼酸类化合物为3-o-[e-2-羧基正戊羰氧-3-羟基正丁酰氧-4-羧基正丙酰氧-5-羟基-6-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羧基正丙烯羰氧-3-羟基-4-羟基正丙羰氧-5-羧基乙酰氧-6-(6-羟基-1,3-己二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羟基乙酰氧-3-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-4,5,6-三(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羟基-3-羧基乙酰氧-4-羧基正丙烯羰氧-5,6-二(4-羧基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-甲氧-3-羟基正丁烯酰氧-4-羧基正丁烯酰氧-5-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-6-(6-羟基-1-正己烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羟基正丙烯酰氧-3,4-二羧基正丙酰氧-5-(6-羟基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-3-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-6-(8-羟基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,3,6-三(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二羟基正丙烯酰氧-3-羧基正丙烯酰氧)-4-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6-羧基正丙羰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,5-二甲氧-3-(4-羧基正丁羰氧)-4-(6-羟基-1-正己烯羰氧)-6-(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸和3-o-[e-2,5-二甲氧-3-羧基正丙羰氧-4,5-二(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸；其中,所述的12种懈皮素类化合物为3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧-4’,5’-二(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-(6-羟基-1,3-正己二烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(6-羧基正己羰氧)-4’-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-5’-(3-羧基正丁羰氧)-6’-(5-羧基正戊羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羟基正丁羰氧)-4’-(5-羟基正戊羰氧)-5’-羧基乙酰氧-6’-羟基乙酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,6’-二甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’,5’-二(4-羟基-1-正丁烯羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’,6’-二(3-羧基正丙羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’-(3-羟基正丙羰氧)-4’-(3-羧基正丙羰氧)-5’-羧基正丙酰氧-6’-羟甲氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4’,5’-二(3-羧基-1-正丁烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,3’,6’-三甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-(3-羟基正丙羰氧)-5’,6’-二羟基正丙酰氧懈皮素,3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)-6’-(3-羟基正丙羰氧)懈皮素和3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’,4’-二羧基乙酰氧基-5’-(7-羧基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6’-(9-羧基-1,3,5-正壬三烯羰氧)懈皮素。第二方面的技术手段是提出一种制备所述的鲜桑树叶水提物粉末的方法,使鲜桑树叶水提物粉末可以这样制得:鲜桑树叶用自来水洗净,在蒸馏水中于60℃-90℃加热0.5-4小时,过滤,残饼用蒸馏水洗,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为鲜桑树叶水提物粉末。第三方面的技术手段是提出一种制备所述的鲜桑树叶水提物粉末的优选方法,其特征在于取鲜桑树叶,用自来水洗净,在蒸馏水中于70℃加热2小时,过滤,残饼用蒸馏水洗,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为鲜桑树叶水提物粉末。第四方面的技术手段是提出了鲜桑树叶水提物粉末在制备抗炎药物中的应用。附图说明图1.鲜桑叶水提物粉末的uplc-质谱总离子流图谱。图2.为3-o-[e-2-羧基正戊羰氧-3-羟基正丁酰氧-4-羧基正丙酰氧-5-羟基-6-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图3.为3-o-[e-2-羧基正丙烯羰氧-3-羟基-4-羟基正丙羰氧-5-羧基乙酰氧-6-(6-羟基-1,3-己二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图4.为3-o-[e-2-羟基乙酰氧-3-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-4,5,6-三(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图5.为3-o-[e-2-羟基-3-羧基乙酰氧-4-羧基正丙烯羰氧-5,6-二(4-羧基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图6.为3-o-[e-2-甲氧-3-羟基正丁烯酰氧-4-羧基正丁烯酰氧-5-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-6-(6-羟基-1-正己烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图7.为3-o-[e-2-羟基正丙烯酰氧-3,4-二羧基正丙酰氧-5-(6-羟基-1,3,5-正己三烯羰氧)-6-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图8.为3-o-[e-2,5-二(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-3-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-6-(8-羟基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图9.为3-o-[e-2,3,6-三(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图10.为3-o-[e-2,5-二羟基正丙烯酰氧-3-羧基正丙烯酰氧)-4-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6-羧基正丙羰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图11.为3-o-[e-2,5-二甲氧-3-(4-羧基正丁羰氧)-4-(6-羟基-1-正己烯羰氧)-6-(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图12.为3-o-[e-2,5-二甲氧-3-羧基正丙羰氧-4,5-二(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图13.为3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧-4’,5’-二(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-(6-羟基-1,3-正己二烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图14.为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(6-羧基正己羰氧)-4’-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-5’-(3-羧基正丁羰氧)-6’-(5-羧基正戊羰氧)懈皮素及裂解产物。图15.为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羟基正丁羰氧)-4’-(5-羟基正戊羰氧)-5’-羧基乙酰氧-6’-羟基乙酰氧懈皮素及裂解产物。图16.为3-o-葡萄糖苷-2’,6’-二甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’,5’-二(4-羟基-1-正丁烯羰氧)懈皮素及裂解产物。图17.为3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素及裂解产物。图18.为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-4’-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-5’,6’-二(3-羧基正丙羰氧)懈皮素及裂解产物。图19.为3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’-(3-羟基正丙羰氧)-4’-(3-羧基正丙羰氧)-5’-羧基正丙酰氧-6’-羟甲氧懈皮素及裂解产物。图20.为3-o-葡萄糖苷-2’-甲氧基-3’-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-4’,5’-二(3-羧基-1-正丁烯羰氧)-6’-甲酰氧懈皮素及裂解产物。图21.为3-o-葡萄糖苷-2’,3’,6’-三甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)懈皮素及裂解产物。图22.为3-o-葡萄糖苷-2’-羟基-3’-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-4’-(3-羟基正丙羰氧)-5’,6’-二羟基正丙酰氧懈皮素及裂解产物。图23.为3-o-葡萄糖苷-2’,3’-二甲氧基-4’-羟甲基-5’-(6-羟基正己羰氧)-6’-(3-羟基正丙羰氧)懈皮素及裂解产物。图24.为3-o-葡萄糖苷-2’-甲酰氧-3’,4’-二羧基乙酰氧基-5’-(7-羧基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6’-(9-羧基-1,3,5-正壬三烯羰氧)懈皮素及裂解产物。具体实施方式为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。实施例1制备鲜桑树叶水提物粉末鲜桑树叶用自来水洗净,取100g洗净的鲜桑树叶在900ml蒸馏水中于60℃-90℃加热0.5-4小时,优选为70℃加热2小时,过滤,残饼用蒸馏水洗,合并的滤液减压浓缩,得到的7.3g粉末即为鲜桑树叶水提物粉末。实施例2测定鲜桑树叶水提物粉末的色谱和质谱离子流谱2-1.样品溶液的制备(10mg/ml)称取26.7mg鲜桑树叶水提物粉末,用2.67ml超纯水中将粉末溶解。得到的溶液经超声震荡1分钟,之后再于13000r/min离心10分钟。取上清液,过0.22μm滤膜,置于样品瓶中供色谱和质谱测定用。2-2.色谱条件色谱条件色谱柱:waters，acquityhsst3柱(2.1×100mmi.d.,1.7μm)；进样体积:2μl；流动相:水(0.1％甲酸),乙腈；按照表1的梯度用流动相洗色谱柱。表1流动相梯度表2-3.测定色谱图按照上面的色谱测定条件测定并记录鲜桑树叶水提物粉末的uplc色谱图(见图1)。2-4.测定离子流谱和质谱的条件电喷雾离子化模式为正(pi)及负(ni)模式。离子模式参数:毛细管电压为1000v,去溶剂气流速为800l/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50l/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45v,取样锥电压为6v,采集模式为msecontinuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道trap碎裂电压为6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压为20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。实施例3指定鲜桑树叶水提物粉末中23种组分的结构将实施例2的uplc色谱与质谱联接,测定鲜桑树叶水提物粉末的uplc-质谱。质谱条件是电喷雾离子化的正离子和负离子两种模式。离子模式参数:毛细管电压为1000v,去溶剂气流速为800l/h,温度450℃,源温度为120℃,锥孔气流速为50l/h,喷雾气压为6bar,碎裂电压为20-45v,取样锥电压为6v,采集模式为msecontinuum分辨率模式,带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z)数据采集范围为100-1500,低能量通道trap碎裂电压为6v,高能量通道trap碎裂电压选择梯度电压为20-60v,选取le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁采集m/z,范围为100-1500。在45分钟内分出23个独立峰。根据质谱裂解规律,这些峰(按照总离子流图谱从左到右的峰顺序)的指定见表2。这23种组分在质谱条件下的裂解产物见说明书附图2-24。表2总离子流图谱中峰对应组分保留时间,负离子质量数,结构及名称实施例4评价鲜桑树叶水提物粉末的抗炎作用因为二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型,所以本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定鲜桑树叶水提物粉末的治疗作用。因为阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药,所以本发明选择阿司匹林为阳性对照药。icr雄性小鼠(体重22±3g)在温度为25℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后,随机分为生理盐水组(剂量为10ml/kg),阿司匹林组(剂量为1110μmol/kg),鲜桑树叶水提物粉末组(50mg/kg),每组10只小鼠。测定时小鼠按所在组或口服生理盐水,或口服阿司匹林,或口服鲜桑树叶水提物粉末。给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2h后小鼠接受乙醚麻醉并断颈处死,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,两耳重量差作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量–右耳圆片重量。表3的数据说明,在50mg/kg口服剂量下鲜桑树叶水提物粉末有效地抑制二甲苯引发的急性炎症。桑树叶水提物粉末抑制二甲苯引发的急性炎症的活性与1110μmol/kg阿司匹林的活性无显著性差异。数据说明,鲜桑树叶水提物粉末有优秀的抗炎活性。表3鲜桑树叶水提物粉末的抗炎活性炎症小鼠的治疗剂剂量耳肿胀度:均值±sdmg生理盐水10ml/kg13.41±2.38阿司匹林1110μmol/kg7.61±1.22a鲜桑树叶水提物粉末50mg/kg6.15±1.88ba)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p<0.01,与阿司匹林比p>0.05；n＝10。当前第1页12