一种近红外光热疗栓塞微球及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医用纳米功能材料及技术领域，具体涉及一种近红外光热疗栓塞微球及其制备方法和应用。

背景技术：

肝细胞癌(hcc)是全世界最常见的的恶性肿瘤之一，近几年欧美的发病率及致死率已明显上升。据2018年最新统计数据表明，hcc的发病年龄已呈现年轻化趋势。目前肝切除术仍然是肝癌治疗的首选方法，但术后总体5年其局部复发率超过70％，局部复发所引起的转移是肝癌术后的首位死因，早期肝癌也不例外。针对这一状况，临床在术后常通过微血管侵犯(mvi)的病理判断辅以经导管肝动脉栓塞(tae)进行治疗，但考虑到化疗药物副作用大、血液循环短且存在促癌细胞转移可能，故给药面临诸多挑战。另一方面，放疗仅适用于边界明显且无远端转移的肿瘤，放疗种子对手术部位的复杂操作以及对邻近正常组织的损伤，成效有限。

近红外光热疗利用近红外光(波长700-1400nm)对生物组织伤害小的特点，通过光热转换产生局部高温(60℃及以上)实现细胞或组织消融。由于肿瘤血供相比正常组织要差，致使肿瘤细胞对高热损伤的修复能力降低而更容易被杀灭。研究表明，与主流的热疗方法如射频热疗、微波热疗等相比，近红外光热疗在癌症治疗中具有更高的热效率和更低的副作用，将有效降低周围组织的损害，从而作为一种新的热疗手段。目前已开发的近红外光热转换材料主要由贵金属纳米材料、有机高分子、碳基以及半导体材料构成。然而近红外光热疗仍依赖静脉系统或瘤内局部注射纳米热介质的给药方式。一方面，经静脉系统注射虽然可以通过主/被动靶向肿瘤，但大部分纳米材料往往积累在肝脏和脾脏等代谢器官而带来较大毒副作用；另一方面，瘤内局部注射虽可避免静脉给药的弊端及脱靶沉积问题，然而，纳米尺度的热介质却很容易扩散到周围正常组织，故为维持瘤区的热疗温度必须加大热介质的给药剂量。如何解决热介质在瘤区达到产热的富集浓度、且要长期滞留在瘤区以便实现反复热疗所面临的安全问题成为热疗领域的首要任务。

而在热介质方面，制备成近红外光热疗栓塞微球与单纯注射纳米颗粒的方式相比更具安全、高效的优点。但是，目前市面上制备均一尺寸微球所用的方法多为微流控及膜乳化方法，微流控设备成本及维护费用较高，加上商用膜乳化设备所用的膜多为天然火山石烧制易损耗，因此较难实现可控稳定的低成本规模生产。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供了一种近红外光热疗栓塞微球及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

提供了一种近红外光热疗栓塞微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将第一高分子聚合物修饰后的光热剂与第二高分子聚合物进行剪切混合，然后加入表面活性剂进行表面活化，得到水相，所述第一高分子聚合物为具有生物相容性的高分子聚合物，所述第二高分子聚合物为具有生物相容性和生物可降解性的高分子聚合物；

步骤2：选取二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中的一种或多种作为油相，将油相和水相通过静电气体喷流截断形成均一制备滴；

步骤3：将步骤2中制备的均一制备滴进行搅拌交联固化。

优选地，所述第二高分子聚合物为海藻酸钠、壳聚糖、明胶和pva中的一种或多种，所述第二高分子聚合物的质量为水相与油相的总质量的2～10％；所述第一高分子聚合物为聚乙二醇。

优选地，步骤1中，所述光热剂为尺寸为1～100nm的黑磷量子点、尺寸为1～100nm的碳基纳米颗粒和尺寸为1～100nm的贵金属纳米颗粒中的一种，所述光热剂的质量为水相与油相的总质量的0.3～3％。

优选地，步骤1中，所述表面活性剂为聚氧乙烯，聚氧乙烯的质量为水相与油相的总质量的0.1～1％。

优选地，步骤1中，剪切速度为10000～30000r/min。

优选地，所述步骤2的具体过程为：选取二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中的一种或多种作为油相，将油相和表面活化后的水相置于微量注射泵，通过同轴针头的静电气体喷流截断形成均一制备滴，输料速度为1～30ml/h，静电电压为1～20kv，气体喷流压力为0.01～0.05mpa，气体为惰性气体。

优选地，所述步骤3的具体过程为：将步骤2中制备的均一制备滴滴加至含单一钙离子或单一镁离子或单一钡离子的溶液中，然后进行搅拌交联固化；含单一钙离子或单一镁离子或单一钡离子的溶液的质量分数为1～10％，搅拌交联固化的温度为30～50℃，搅拌速度为100～1000rpm/min。

作为实施方案的一种，步骤2中，将含有化疗药物的二氯甲烷溶液、三氯甲烷溶液、乙酸乙酯溶液和丙酮溶液中的一种或多种作为油相，化疗药物的质量为水相和油相的总质量的5～15％。

本发明还提供了一种近红外光热疗栓塞微球，其特征在于，由权利要求1～8任一项所述的制备方法制得，所述微球的尺寸为50～900μm，所述微球经808nm，1w/cm²的近红外激光辐射5min可升温至40～70℃。所述微球可通过表面修饰或者添加化疗药物、造影介质、靶向材料等应用在基于手术导航的原位肿瘤近红外光热-化疗栓塞协同以及联合放疗、免疫领域，所述造影介质和靶向材料包括但不限于磁性纳米颗粒、荧光分子、核素、碘剂、小分子rna、亲和素和免疫佐剂。

在静电气体喷流过程中，高压静电被施加至壳层的高分子聚合物制备液，使其带电从而克服液体分子间的表面张力。此外，位于核层的高分子聚合物制备液被壳层聚合物导电液包裹形成混合流体，混合流体在微量注射泵推送下输运到针头尖端形成锥体结构(泰勒锥)，在惰性气体截断作用下形成带电的连贯喷射流并在收集装置上收集，随着喷射流的溶剂挥发、固化最后得到产品。

本发明还提供了由上述任一种方法制得的一种近红外光热疗栓塞微球，所制备的微球的尺寸为50～900μm，经808nm，1w/cm²的近红外激光辐射5min可升温40～70℃；通过表面修饰或者添加造影介质、靶向材料可应用在基于手术导航的原位肿瘤近红外光热-化疗疗栓塞协同以及联合放疗、免疫领域，所述造影介质和靶向材料包括但不限于磁性纳米颗粒、荧光分子、核素、碘剂、小分子rna、亲和素和免疫佐剂。

本发明的有益效果为：本发明制备栓塞微球可通过控制高压静电的电压以及输料速度等参数对微球实现控制制备，结合其它参数控制可获得50～900μm尺寸可调的磁性微球，制得的微球经808nm，1w/cm²的近红外激光辐射5min可升温至84.3℃，解决了传统方法成本较高，可控性较低的缺点。

附图说明

图1所示为液体剥离-超声联合的方法快速制备的黑磷量子点表征示意图，其中，图1a为透射电镜照片，图1b为透射电镜高分辨图，图1c为量子点的水动力尺寸粒径统计；

图2所示为具有近红外光热化疗功效的栓塞微球的制备过程及应用的示意图；

图3所示为红外热像仪拍摄的微球经近红外激光照射升温后的照片；

图4所示为具有近红外光热化疗功效的栓塞微球的光镜照片和sem照片，其中，图4a为光镜照片，图4b-d为sem照片；

图5所示为实施例3所制栓塞微球的表面元素中的分布表征结果图；

图6所示为通过mtt法对微球的剂量和时间依赖细胞活力检测的结果图；

图7所示为细胞经微球体外近红外光热疗的状态对照图，其中，图7a为hepg2细胞在显微镜下的图像，图7b为hepg2细胞经微球体外近红外光热疗后在显微镜下的图像；

图8所示为微球在考察期内不同条件下的紫杉醇释药曲线图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：液体剥离-超声联合的方法制备黑磷量子点及其表面改性

黑磷与石墨烯类似，但其拥有石墨烯材料所不具备的随着层数可变的直接带隙，此外，磷固有生物相容性，可在水溶液中自然分解产生无毒的磷酸盐，故被称为比肩石墨烯的“梦幻材料”，采用黑磷量子点作为光热剂可使得所制得的微球具备优异的光热转换性能，使得制得的微球在长效切断肿瘤供养的同时还实现了热瘤区组织快速反复加热及热诱导释药的协同治疗功效，解决了热介质在瘤区达到产热的富集浓度、且要长期滞留在瘤区以便实现反复热疗所面临的安全问题。

在惰性气体环境保护下将200mg超高纯黑磷晶体进行研磨，然后分散在200mln-甲基吡咯烷酮中。随后，在冰浴环境下进行超声和离心处理，然后进行聚乙二醇改性(聚乙二醇，英文简称为peg，是美国fda批准作为体内注射用辅料之一，具有高的水溶性、抗蛋白吸附能力和良好的生物相容性)，将其修饰在黑磷量子点表面可改善颗粒在水溶液的分散性，进一步降低暴露在植入膜壳层时与血浆蛋白的相互作用，降低颗粒毒性并减缓黑磷被氧化的情况。改性方案如下：将上述制备好的黑磷量子点分散在超纯水中，然后与带功能基团的peg混合(如peg分子末端带甲氧基、氨基或羧基等)。修饰peg的黑磷量子点经超声及高剪切处理后进一步通过离心及透析进行纯化。

图1所示为液体剥离-超声联合的方法快速制备的黑磷量子点表征示意图，其中，图1a为透射电镜图，量子点呈现单分散性，图1b为透射电镜高分辨图，晶格条纹间距均为0.26nm，对应于[040]晶格类型。图1c为经peg修饰后的黑磷量子点水动力尺寸统计，经dls测得其尺寸约为1.8nm。

实施例2：尺寸为50～100μm的近红外光热疗栓塞微球的制备

将10mg实施例1中制得的黑磷量子点加入到20ml质量分数为2％的海藻酸钠水溶液(海藻酸钠是一种线性高分子，有三个链段通过糖苷键连接而成，分子每个结构单元中有两个仲羟基，这些仲羟基都具有醇羟基的反应性能。故使用二价阳离子可以使海藻酸钠交联成凝胶。凝胶化和交联主要通过古罗糖酸的钠离子与二价阳离子交换而得。二价阳离子在羧基部位进行离子取代，另一侧链海藻酸也可与二价阳离子相连，从而形成交联使得二价阳离子与两条海藻酸钠键相连)，随后添加1ml表面活性剂peo(聚氧乙烯)水醇液，在15000rpm/min的转速下混合均匀作为水相。另外，在10℃的低温条件下，将紫杉醇(ptx)添加到20ml二氯甲烷溶液(ptx的质量分数为0.5％)，通过超声破碎仪进行均匀混合作为油相。将上述水相及油相分别置于微量注射泵，水相走外通道，ptx-二氯甲烷溶液走内通道，设置输料速度分别为5ml/h、4ml/h，静电电压为14～16kv，通过同轴针头的静电气体喷流截断形成均一制备滴。将上述制备滴收集到200ml质量分数为1％的氯化钙溶液中，然后将溶液置于加热陶瓷板上进行搅拌交联固化，设定加热陶瓷板的加热温度恒定为55℃，调整搅拌速度为1000～1300rpm/min，得到尺寸为50～100μm的微球。将制备所得的微球用乙醇及超纯水进行充分洗涤，干燥后备用。

图2为具有近红外光热化疗功效的栓塞微球制备及应用示意，通过同轴针头的静电气体喷流截断形成均一制备滴，经交联固化后得到所述微球，利用黑磷量子点作为光热剂，经近红外光辐照可实现热诱导化疗药物的释放，从而实现光热疗-化疗的协同治疗功效。

实施例3：尺寸为200～300μm的近红外光热疗栓塞微球的制备

将15mg实施例1中制得的黑磷量子点加入到20ml质量分数为3％的海藻酸钠水溶液中，随后添加2ml表面活性剂peo水醇液，18000rpm/min高剪切混合均匀作为水相。另外，在10℃的低温条件下，将紫杉醇(ptx)添加到20ml二氯甲烷溶液(ptx的质量分数为1％)，通过超声破碎仪进行均匀混合作为油相。将水相及油相分别置于微量注射泵，水相走外通道，ptx-二氯甲烷溶液走内通道，设置输料速度分别为4ml/h、4ml/h，静电电压为10～12kv，通过同轴针头的静电气体喷流截断形成均一制备滴。将上述制备滴收集到200ml质量分数为2％的氯化钙溶液中，然后将溶液置于加热陶瓷板上进行搅拌交联固化，设定加热陶瓷板的加热温度恒定为50℃，调整搅拌速度为800～1000rpm/min，得到尺寸为200～300μm的微球。将制备的微球用乙醇及超纯水进行充分洗涤，干燥后备用。

实施例4：尺寸为400-900μm的近红外光热疗栓塞微球的制备

将20mg实施例1中制得的黑磷量子点加入到25ml质量分数为2％的海藻酸钠水溶液中，随后添加2ml表面活性剂peo水醇液，20000rpm/min高剪切进行混合均匀作为水相。另外，在10℃的低温条件下，将紫杉醇(ptx)添加到23ml二氯甲烷溶液(ptx的质量分数为1.5％)，通过超声破碎仪进行均匀混合作为油相。将水相及油相分别置于微量注射泵，水相走外通道，ptx-二氯甲烷溶液走内通道，设置输料速度分别为3ml/h、3ml/h，静电电压为5～10kv，通过同轴针头的静电气体喷流截断形成均一制备滴。将上述制备滴收集到200ml质量分数为4％的氯化钙溶液中，然后将溶液置于加热陶瓷板上进行搅拌交联固化，设定加热陶瓷板的加热温度恒定为40℃，调整搅拌速度为500～800rpm/min，得到尺寸为400～900μm的微球。将制得的微球用乙醇及超纯水进行充分洗涤，干燥后备用。

实施例5：近红外光热疗栓塞微球的表征

在25摄氏度的室温下对实施例3所制微球进行近红外光(808nm，1w/cm²)照射5min，图3为通过红外热像仪拍摄的微球经近红外激光照射升温后的照片，由图3发现，经近红外激光照射5min后可升温至84.3℃。

对实施例3制得的微球进行光电显微镜和扫描电子显微镜表征，图4所示为具有近红外光热化疗功效的栓塞微球光镜照片和sem(扫描电子显微镜)照片，图4a为实施例3制得的微球的光镜照片，从图中可以看到微球形貌、尺寸非常均一且表面光滑，图4b-d为实施例3制得的微球(尺寸为200-300μm)的sem照片。

此外，如图5所示，借助eds对微球的表面元素分布进行观察，证实c、o、p、ca元素在微球表面呈现分布均匀的状态。

实施例6：近红外光热疗栓塞微球的细胞活力检测及体外热疗评价

将hepg2细胞按照2000/孔的数目接种于96孔板，加入dmem培养基配，光学显微镜下观察到细胞铺满培养基底板后，加入配制好的0.05％胰蛋白酶进行消化，然后置于co2培养箱中培养。将细胞分为四个组，其中组1作为对照组不添加实施例3所制备的微球，而组2、3、4分别添加实施例3所制备的微球，浓度对应为10mg/ml、30mg/ml及50mg/ml，然后与细胞进行共孵育。作用12、24、48、72h后，向每孔加入含mtt(5mg/ml)的培养基20μl，在37℃孵育4h后加入150μl的dmso，在振荡器上混匀5min，用酶标仪读板对每个相应微球浓度下的时间点进行细胞活性检测，以不添加实施例3所制备微球的细胞对照组进行相对活力计算，结果以均数±s.d.表示。

此外，将hepg2细胞按约1×10⁴/孔的细胞数目接种于直径为35mm的培养皿中，添加10mg实施例3所制备的微球中进行共孵育24h。随后，将培养皿进行近红外激光辐照5min，通过光学显微镜观察细胞状态。

图6为所制备微球的细胞活性mtt测试结果。从结果可知，微球与hepg2细胞孵育12、24、48、72h并随着剂量从10mg/ml到50mg/ml增加，均没有产生明显的细胞毒性，表明所制备的栓塞微球具备良好的生物相容性。

图7所示为细胞的近红外光体外热疗状态对照图。图7a为hepg2细胞在显微镜下的图像，而当加入10mg的微球，施加近红外光(808nm，1w/cm²)辐照5min的热疗后细胞发生凋亡而坏死，如图7b，说明本发明制得的微球具备优异的光热转换性能。

实施例7：近红外光热疗栓塞微球的体外释药评价

称取30mg实施例3所制备的微球至离心管，加入含nan3(质量分数为0.02％)的pbs缓冲液(ph＝7.4)中，分别设置为加热组(置于恒温摇床，50℃)及对照组(室温)进行释药追踪。每隔4天分别吸取等量待测液进行测试，同时补充等量上述缓冲液进行后续考察，40天时结束。

图8所示为微球在考察期内不同条件下的紫杉醇释药曲线图，对照释药组(室温)在考察期的释药率为20％，而加热释药组(50℃)在考察期释的药率为84％，由此证明了热诱导能发挥增强药物释放从而达到协同功效。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。