替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

背景技术：

弓形虫是一种细胞内寄生性原虫，是引起人兽共患弓形虫病的病原体，广泛分布于我国及世界各地。弓形虫病不仅是人类最常见的感染性疾病之一，而且亦是免疫抑制及免疫缺陷人群的主要致死病因之一。近些年来，艾滋病合并弓形虫感染已日益成为一个世界性的、严重的公共卫生问题。

弓形虫感染通常呈隐性感染，但当机体免疫功能低下时，处于隐性感染阶段的弓形虫活化，不断增殖严重危害机体器官。艾滋病患者感染弓形虫后会出现不同地临床症状，严重时可导致病人死亡。在hiv感染期间，有20～47％会出现弓形虫脑病。艾滋病患者感染弓形虫通常采用磺胺嘧啶类药物治疗，然而随着90年代hiv抑制类药物的出现，临床发现由弓形虫感染致死的艾滋病患者数量明显下降。但只有很少的几种抗逆转录病毒药物抑制弓形虫增殖的效果被评估了。hiv抑制类药物主要有几个不同类别包括蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、侵入抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂和非核苷逆转录酶抑制剂。选择不同类型的hiv抑制类药物可能影响艾滋病感染者弓形虫感染的结果。然而，到目前为止用于治疗艾滋病毒感染的hiv抑制类药物是否对弓形虫的生长有直接抑制作用，以及它们与常规抗弓形虫药物(磺胺嘧啶和乙胺嘧啶)之间可能的药动学的相互作用尚不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯能够抑制弓形虫生长。

本发明提供了如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用；

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和磺胺嘧啶的组合物在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和乙胺嘧啶的组合物在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯、磺胺嘧啶和乙胺嘧啶的组合物在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

本发明还提供了如式i所示化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和磺胺嘧啶的组合物在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和乙胺嘧啶的组合物在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯、磺胺嘧啶和乙胺嘧啶的组合物在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种预防或治疗弓形虫感染疾病的药物，所述药物包括替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和以下化合物中的一种或两种：磺胺嘧啶和乙胺嘧啶。

本发明提供了本发明提供了替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯能够抑制弓形虫生长。阐明hiv抑制类药物是否对弓形虫抑制作用，可为将来治疗弓形虫感染的艾滋病患者提供合理药物治疗方案。试验结果表明，替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对浓度低于30μm时不影响hff的形态及生长；替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对弓形虫具有明显的抑制作用，其ic50为5.10±1.01；替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对磺胺嘧啶或乙胺嘧啶不产生拮抗作用反而，两者可以起到添加作用，说明替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯可与磺胺嘧啶或乙胺嘧啶联合治疗弓形虫病。

附图说明

图1为本发明提供的替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对弓形虫增殖的ic50结果。

具体实施方式

本发明提供了如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用；

本发明所述化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯(tenofovirdisoproxilfumarate)如式i所示。本发明对所述替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。本发明所述替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯制备得到的药物能够抑制弓形虫生长。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和磺胺嘧啶的组合物在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和乙胺嘧啶的组合物在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯、磺胺嘧啶和乙胺嘧啶的组合物在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用。

本发明还提供了如式i所示化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和磺胺嘧啶的组合物在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和乙胺嘧啶的组合物在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了包含如式i所示的化合物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯、磺胺嘧啶和乙胺嘧啶的组合物在制备预防或治疗弓形虫感染疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种预防或治疗弓形虫感染疾病的药物，所述药物包括替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯和以下化合物中的一种或两种：磺胺嘧啶和乙胺嘧啶。

下面结合具体实施例对本发明所述的替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.寄生虫和细胞培养

弓形虫rh株速殖子培养在人包皮成纤维细胞中，将rh速殖子接到25t或者75thff细胞瓶中，当大约有75％的虫体逸出时，用细胞刮子将hff从瓶底刮起，将细胞悬液转移到15ml无菌的离心管中，用18g针头破碎3-5次后，再用27g针头破碎3-5次，使宿主hff细胞在机械作用下破碎，让在宿主细胞内的虫体逸出，用3μm滤器过滤虫体，除去细胞碎片并通过血球计数板对弓形虫计数。

2.药物和化学品

抗逆转录病毒的化合物购买于medchemexpress(monmouthjunction,nj,usa)。乙胺嘧啶和磺胺嘧啶购买于sigmachemicalco.(st.louis,mo).所有的化合物都溶解在100％的二甲基亚砜(dmso)，最终浓度为10mm。dmso的最终浓度不超过0.3％(v/v)，该浓度对细胞活力没有影响。乙胺嘧啶和磺胺嘧啶也溶于dmso中分别作为阳性对照，dmso单独的作为阴性对照。

3.细胞活力分析

利用celltiteraqueousonesolutioncellproliferationassay试剂盒观察hiv抑制类药物替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对hff细胞的毒性。将hff细胞接种到96孔板中，让hff细胞贴壁培养4h，然后加入相应浓度的替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯，继续培养至48h，然后在细胞培养基中加入四唑组分[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazolium,innersalt；mts(a)]和电子耦合试剂(phenazineethosulfate；pes)，37℃孵育3小时后，用酶标仪测定在490nm处的吸光度。通过graphpadprism5软件计算替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对hff细胞毒性的ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)

4.hiv抑制类药物体外抗弓形虫增殖效果

实验分为：实验组、阴性对照组、阳性对照组、空白组。其中阴性对照组中加入相应体积的dmso；阳性对照组分为乙胺嘧啶阳性对照组和磺胺嘧啶阳性对照组；空白组加入相应体积的dmem溶液。

将生在24孔板中的hff接入5×10⁴刚刚逸出的速殖子，置于37℃、5％co2条件下培养，4h后吸弃旧培养液以及洗去尚未进入细胞内的虫体。实验组加入相关浓度的替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯(1μm,5μm，10μm，15μm，20μm，30μm)。

5.hiv抑制类药物体与磺胺嘧啶或乙胺嘧啶之间的相互作用

观察替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯是否与乙胺嘧啶或者磺胺嘧啶是否有一定的协同或者拮抗作用。在将生在24孔板中的hff接入5×10⁴刚刚逸出的速殖子，置于37℃、5％co2条件下培养，4h后吸弃旧培养液以及洗去尚未进入细胞内的虫体，按照表1加入相应的替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯是和乙胺嘧啶或者磺胺嘧啶。然后观察弓形虫的生长情况。

表1探究替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯是否与乙胺嘧啶或者磺胺嘧啶之间的相互作用

在培养箱中培养5天后，收集感染细胞，提取dna，具体步骤如下：

(1)贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，然后11,200×g离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮

(2)加入20μlproteinasek溶液，混匀

(3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，13,400×g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。

(6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，13,400×g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中

(7)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，13,400×g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7

(9)将吸附柱cb3放回收集管中，13,400×g离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液

(10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，13,400×g离心2min，将溶液收集到离心管中。

利用rt-pcr进行虫体定量，目的基因为弓形虫b1基因：序列为：

b1-qpcr-f:ggaggactggcaacctggtgtcg(seqidno.1)；

b1-qpcr-r：ttgtttcacccggaccgtttagcag(seqidno.2)。

应用appliedblosystems7500fastreal-timepcrsystem和steponeplus^tmreal-timepcrsystem进行操作。

1、pcr反应液组分配置如表2所示(反应液配制在冰上进行)

表2pcr反应液组分配置表

2、进行realtimepcr反应。反应程序如下：1，95度预变性30秒；2，95度变性5秒；60度延伸30秒；步骤2-3重复40个循环；溶解曲线：95度15秒；60度1分钟；95度15秒。

然后利用10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，虫子提取的dna用来做为标准曲线来定位虫子的数量，每个组至少有三个生物学重复。

通过graphpadprism5软件计算相关替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对弓形虫增殖的ic50，试验结果如图1和表3所示。

表3不同浓度替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯与空白对照的生长百分比结果

1.替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对浓度低于30μm时不影响hff的形态及生长。

2.替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对弓形虫具有明显的抑制作用，其ic50为5.10±1.01，具体抑制情况见图1。

3.替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对磺胺嘧啶或乙胺嘧啶不产生拮抗作用反而，两者可以起到添加作用。具体效果见表4。

表4与磺胺嘧啶或乙胺嘧啶联用的替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯对弓形虫的抑制作用

替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>山东大学

<120>替诺福韦富马酸替诺福韦二吡呋酯在制备抑制弓形虫生长的药物中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggaggactggcaacctggtgtcg23

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttgtttcacccggaccgtttagcag25