一种用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于医用材料领域，具体涉及一种用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料及其制备方法和用途。


背景技术：

2.我国人口众多，经济处于高速发展阶段，由车祸、工业伤等引起的开放性骨折所导致的骨缺损往往都需要骨移植治疗。同时，由于庞大的人口基数，骨肿瘤发病人数不容忽视，其中，溶骨样骨肿瘤或骨肿瘤切除后所导致的骨缺损，往往也需要骨移植。此外，炎症以及先天性疾病等因素也常导致骨缺损，需要进行骨移植。在我国，每年有超过5百万例骨移植手术，并且正以每年10％的速度增长。骨缺损的治疗给国家、人民带来有巨大的经济、精神负担。
3.自体骨移植是治疗骨缺损最好的方法，但其来源有限，并且会给患者造成二次伤害。因此，考虑到患者的需求，研究一种可替代自体骨移植的骨缺损修复材料十分有必要。目前临床应用的骨修复材料主要有磷酸钙生物陶瓷材料、高分子材料和金属材料。以羟基磷灰石为代表的生物陶瓷及高分子材料力学性能差，无法用于负重区域骨缺损的修复。钽、钛等医用金属材料力学性能及生物相容性较好，但无法降解，骨缺损修复过程中难以形成新生骨对内植物的完美替代。而镁等医用金属虽然能降解，但是降解速率过快，与骨的生长速度不匹配，无法在修复过程中起到力学支撑作用。
4.同时，不同患者的骨缺损部位结构有差异，根据不同患者的需求设计个性化的骨缺损修复支架，与骨缺损部位更匹配，更有利于骨缺损的修复。
5.因此，一种既具有良好的力学性能，降解速度也适宜，在降解过程中依然对骨缺损部位起到力学支撑作用，又能满足患者个性化需求的骨修复支架材料在骨修复领域具有良好的前景。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供一种用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料及其制备方法和用途。
7.本发明提供了一种用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料，它是由铁锰合金粉末通过选区激光熔化技术制备而成；所述铁锰合金粉末中铁元素和锰元素的质量比为(65～75)：(25～35)。
8.进一步地，所述铁锰合金粉末由锰元素、磷元素、硫元素、氧元素、氮元素和铁元素组成；其中，锰元素的质量百分比为32.15
±
0.76％，磷元素的质量百分比为0.45
±
0.04％，硫元素的质量百分比为0.39
±
0.70％，氧元素的质量百分比为0.016
±
0.002％，氮元素的质量百分比为0.010
±
0.0041％，铁元素的质量百分比为66.98
±
2.15％。
9.进一步地，所述锰元素的质量百分比为32.15％，磷元素的质量百分比为0.45％，
硫元素的质量百分比为0.39％，氧元素的质量百分比为0.016％，氮元素的质量百分比为0.010％，铁元素的质量百分比为66.984％。
10.进一步地，所述铁锰合金粉末的粒径小于63μm；优选为小于53μm。
11.进一步地，所述铁锰合金粉末以铁锰合金棒材为原料，通过雾化法制备而成；
12.优选地，所述雾化法为气流雾化法。
13.进一步地，所述铁锰合金粉的制备方法包括如下步骤：
14.采用气流雾化法制备得到前述的铁锰合金粉末，并筛分出直径小于63μm的细粉，即得；优选地，筛分出直径小于53μm的细粉。
15.进一步地，所述多孔骨缺损修复金属支架材料的屈服强度为135.70～243.26mpa；所述多孔骨缺损修复金属支架材料的弹性模量为1.04～14.88gpa；所述多孔骨缺损修复金属支架材料的孔隙率为35～80％。
16.进一步地，所述多孔骨缺损修复金属支架材料的屈服强度为136.90～185.00mpa；所述多孔骨缺损修复金属支架材料的弹性模量为9.04～11.74gpa；所述多孔骨缺损修复金属支架材料的孔隙率为46.72
±
0.23％。
17.本发明还提供了一种前述的用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料的制备方法，它包括如下步骤；
18.(1)利用软件对需要打印的支架进行模型设计；
19.(2)设定打印参数：激光功率为250～320w，扫描速度为700-1000mm/s，扫描间距为0.1～0.15mm，扫描层厚30～50μm；
20.(3)采用选区激光熔化技术按照模型设计打印前述的铁锰合金粉末，即得；或，采用选区激光熔化技术按照模型设计打印前述的铁锰合金粉末，得支架材料，将支架材料后处理后，即得。
21.进一步地，所述打印参数为激光功率为260w，扫描速度为780mm/s，扫描间距为0.1mm，扫描层厚40μm。
22.进一步地，所述后处理为真空退火热处理，清洗，烘干；
23.其中，所述真空退火热处理的真空度≤1
×
10-3
pa，温度为850～860℃，保温时间为60～75min；
24.所述清洗为采用3-7wt％的氢氟酸清洗，清洗时间为30～40s；支架材料冷却后再进行清洗。
25.本发明还提供了前述的用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料在制备骨缺损修复支架中的用途。
26.进一步地，所述骨缺损为负重区域的骨缺损。
27.进一步地，所述负重区域的骨缺损为皮质骨骨缺损。
28.通过利用软件修改、调整模型设计，本发明3d打印材料(铁锰合金粉末)结合选区激光熔化技术可打印出与任意形状负重区域骨缺损均完美匹配的多孔骨缺损修复金属支架材料。
29.本发明中，铁锰合金写为fe30mn。
30.本发明特定的铁锰合金粉末作为打印材料，与3d打印中的选区激光熔化技术相结合，可打印出与骨缺损形状完美匹配的多孔可生物降解fe30mn金属骨支架材料，满足患者
个性化需求。同时，该fe30mn金属骨支架材料生物相容性良好、力学性能良好、降解速度适宜：既能克服金属材料无法降解、难以形成新生骨对内植物替代的问题，又能在降解后仍能提供良好的力学性能，克服现有技术中骨修复材料降解后力学性能差的问题，在骨缺损修复过程中有效地提供力学支撑。本发明多孔可生物降解fe30mn金属骨支架材料适宜用于负重区域骨缺损(如皮质骨)的修复，具有良好的应用前景。
31.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
32.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
33.图1为本发明实施例1制备多孔骨缺损修复金属支架材料的设计模型。
34.图2为本发明实施例1制备多孔骨缺损修复金属支架材料的实物图。
35.图3为本发明实施例2制备多孔骨缺损修复金属支架材料的设计模型。
36.图4为本发明实施例2制备多孔骨缺损修复金属支架材料的实物图。
37.图5为本发明多孔骨缺损修复金属支架材料及纯fe材料的x射线衍射结果图。
38.图6为本发明实心fe30mn金属骨支架材料(a)和实心纯fe材料(b)的极化曲线。
39.图7为兔股骨髁负重区域骨缺损造模及材料植入。a暴露股骨远端外侧；b电钻钻孔行骨缺损造模；c兔股骨髁骨缺损展示；d fe30mn材料植入兔股骨髁骨缺损。
40.图8为兔股骨远端取材后标本大体观。a为e组术后12周，可见兔股骨远端骨缺损表面被一层菲薄的软组织覆盖。b为a组术后12周，可见fe30mn与骨接触紧密，未见感染、松动等征象。c为e组术后24周，可见骨缺损表面被一层菲薄的类骨样组织及软组织覆盖。d为a组术后24周，可见骨缺损处完全封闭。
41.图9为fe30mn(a组)兔肝、肾切片he染色。a和b为肝汇管区和肾小球结构放大50倍；c，d为肝汇管区和肾小球结构放大100倍。
42.图10为fe30mn(a组)兔股骨下段植入材料区域x片检查。a和b为术后12周；c，d为术后24周。
43.图11为fe30mn植入前(0周)，术后12周，24周micro-ct测得表面积结果的比较。*表示差异有统计学意义，p<0.05。**表示表示差异有统计学意义，p<0.01。
44.图12为fe30mn植入前(0周)，术后12周，24周micro-ct测得体积结果的比较。*表示差异有统计学意义，p<0.05。**表示表示差异有统计学意义，p<0.01。
45.图13为将fe30mn股骨髁micro-ct扫描数据经mimics 21.0渲染后，在矢状位断面皮质骨重建上可定性显示材料周边及内部孔隙内的新生骨。a为fe30mn术后12周，b为fe30mn术后24周。
46.图14为兔股骨髁沿冠状面将fe30mn/股骨髁复合体切开后的描电镜图片。
47.图15为fe30mn孔隙，eds面扫描图。
48.图16为fe30mn孔隙，eds线扫描图。
49.图17为品红-亚甲基蓝染色评估fe30mn在骨缺损处修复情况。a-e为fe30mn术后12
周，f-h为fe30mn术后24周。
50.图18为品红-亚甲基蓝染色评估e组空白组骨缺损修复情况。a，b为术后12周，c，d为术后24周。
51.图19为fe30mn植入兔体内取出后材料生物力学测试。植入实验兔体内12、24周后，fe30mn的弹性模量与初始时间(未植入兔体内)时相比，差异无统计学意义(p>0.05)。同样的，植入实验兔体内12、24周后，fe30mn的屈服强度与初始时间(未植入兔体内)时相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
具体实施方式
52.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。其中，真空熔炼气雾化设备的型号为md-pfk50/70-2.5，厂商为邯郸市旭瑞合金材料有限公司。
53.实施例1、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料
54.1、铁锰合金粉末(本发明3d打印材料)的制备
55.将铁锰合金棒材清洗、烘干后，利用真空熔炼气雾化设备，按照常规气雾化法以铁锰合金棒材为原料制备铁锰合金粉末，所得铁锰合金粉末由锰元素、磷元素、硫元素、氧元素、氮元素和铁元素组成，所述锰元素的质量百分比为32.15％，磷元素的质量百分比为0.45％，硫元素的质量百分比为0.39％，氧元素的质量百分比为0.016％，氮元素的质量百分比为0.010％，铁元素的质量百分比为66.984％。并采用振动筛分方法筛分出直径为53μm以下的细粉，即得本发明3d打印材料。
56.2、利用3d打印制备多孔骨缺损修复金属支架材料
57.3d打印使用选区激光熔化技术，具体步骤如下：
58.(1)利用软件对需要打印的支架进行模型设计，模型如图1所示，具体参数为底面直径6mm，高10mm。
59.(2)设定打印参数，具体如下：激光功率为260w，扫描速度为780mm/s，扫描间距为0.1mm，扫描层厚40μm。
60.(3)取本发明3d打印材料按照打印参数进行打印，即得到本发明多孔骨缺损修复金属支架材料(fe30mn金属骨支架材料)，底面直径6mm，高10mm，实物如图2所示。
61.实施例2、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料
62.1、铁锰合金粉末(本发明3d打印材料)的制备
63.具体制备方法同实施例1中的“1、铁锰合金粉末(本发明3d打印材料)的制备”。
64.2、利用3d打印制备多孔骨缺损修复金属支架材料
65.3d打印使用选区激光熔化技术，具体步骤如下：
66.(1)利用软件对需要打印的支架进行模型设计：每个多孔fe30mn的单个孔径为400μm，孔与孔之间的连接杆是400μm，图3为单一孔隙单元的模型图。
67.(2)设定打印参数，具体如下：激光功率为260w，扫描速度为780mm/s，扫描间距为0.1mm，扫描层厚40μm。
68.(3)取本发明3d打印材料按照打印参数进行打印，即得到本发明多孔骨缺损修复金属支架材料(fe30mn金属骨支架材料)，实物如图4所示。
69.实施例3、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料
70.1、铁锰合金粉末(本发明3d打印材料)的制备
71.将铁锰合金棒材清洗、烘干后，利用真空熔炼气雾化设备，按照常规气雾化法以铁锰合金棒材为原料制备铁锰合金粉末，所得铁锰合金粉末由锰元素、磷元素、硫元素、氧元素、氮元素和铁元素组成，所述锰元素的质量百分比为32.91％，磷元素的质量百分比为0.49％，硫元素的质量百分比为1.09％，氧元素的质量百分比为0.018％，氮元素的质量百分比为0.014％，铁元素的质量百分比为65.478％。并采用振动筛分方法筛分出直径为53μm以下的细粉，即得本发明3d打印材料。
72.2、利用3d打印制备多孔骨缺损修复金属支架材料
73.3d打印使用选区激光熔化技术，具体步骤如下：
74.(1)利用软件对需要打印的支架进行模型设计：本实施例设计的金属骨架网络结构为圆柱形，孔隙率为55％，直径为50cm，高为350cm。单元胞为六面体结构，由12条杆构成。杆的长度为3mm，杆径为0.3mm，杆间角度为90
°
。
75.(2)设定打印参数，具体如下：激光功率为300w，扫描速度为750mm/s，扫描间距为0.15mm，扫描层厚50μm。
76.(3)取本发明3d打印材料按照打印参数进行打印，即得到支架材料，支架材料采用真空退火热处理。真空度为0.5
×
10-3
pa，热处理温度850℃，保温时间60min，随炉冷却，采用7wt％的氢氟酸(采用蒸馏水配制)清洗毛坯表面，清洗时间30s。采用烘箱烘干表面，温度80℃，烘烤时间15min。紫外线除菌，包装，即得。
77.实施例4、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料
78.1、铁锰合金粉末(本发明3d打印材料)的制备
79.将铁锰合金棒材清洗、烘干后，利用真空熔炼气雾化设备，按照常规气雾化法以铁锰合金棒材为原料制备铁锰合金粉末，所得铁锰合金粉末由锰元素、磷元素、硫元素、氧元素、氮元素和铁元素组成，所述锰元素的质量百分比为31.39％，磷元素的质量百分比为0.41％，硫元素的质量百分比为0.21％，氧元素的质量百分比为0.014％，氮元素的质量百分比为0.006％，铁元素的质量百分比为67.97％。并采用振动筛分方法筛分出直径为53μm以下的细粉，即得本发明3d打印材料。
80.2、利用3d打印制备多孔骨缺损修复金属支架材料
81.3d打印使用选区激光熔化技术，具体步骤如下：
82.(1)利用软件对需要打印的支架进行模型设计：本实施例设计的金属骨架网络结构为圆柱形，孔隙率为78％，直径为50cm，高为350cm。单元胞为六面体结构，由12条杆构成。杆的长度为3mm，杆径为0.3mm，杆间角度为90
°
。
83.(2)设定打印参数，具体如下：激光功率为280w，扫描速度为850mm/s，扫描间距为0.12mm，扫描层厚40μm。
84.(3)取本发明3d打印材料按照打印参数进行打印，即得到支架材料，支架材料采用真空退火热处理。真空度为0.2
×
10-3
pa，热处理温度855℃，保温时间70min，随炉冷却，采用5wt％的氢氟酸(采用蒸馏水配制)清洗毛坯表面，清洗时间35s。采用烘箱烘干表面，温度70℃，烘烤时间20min。紫外线除菌，包装，即得。
85.以下通过具体的试验例说明本发明的有益效果。
86.试验例1、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料的表征
87.1、试验方法
88.分别采用下述方法测量本发明多孔骨缺损修复金属支架材料的磁性、孔隙率和孔隙结构、力学性能。
89.(1)磁性
90.采用实施例1的多孔骨缺损修复金属支架材料(fe30mn金属骨支架材料)，共4例，用于x射线衍射分析。
91.方法：x射线在不同物质中衍射效应不同，x射线衍射相分析技术即是利用上述基本原理对物质结构进行分析。试样接受x射线照射后受激发，产生二次荧光x射线，即所谓的标识x射线。测定衍射角位置(峰位)，并与衍射数据库编号标准pdf卡比对，可以对化合物进行定性分析。本发明x射线衍射分析测试部分参数为灯丝电压40kv，电流40ma，扫描范围5-80
°
，扫描速度2
°
/min。
92.(2)孔隙率和孔隙结构
93.采用实施例1的多孔骨缺损修复金属支架材料(fe30mn金属骨支架材料)，共5例，测其孔隙率。测孔隙率使用的主要仪器为电子天平、烧杯。
94.测孔隙率的具体方法如下：
95.(1)电子天平校准，其感量不超过0.1mg；
96.(2)测量蒸馏水温度，根据蒸馏水温度查表获得蒸馏水的密度ρ
水
；
97.(3)用游标卡尺测量试样的长宽高，并计算体积v
测
；
98.(4)测量试样在空气中的质量，测量五次取平均，记为m1；
99.(5)测量试样在蒸馏水中的质量，测量五次取平均，记为m2；
100.(6)根据公式计算支架的孔隙率，公式如式(1)和式(2)所示。
[0101][0102]
孔隙率＝v
排
/v
测
ꢀꢀ
式(2)
[0103]
(3)力学性能
[0104]
采用实施例1的多孔骨缺损修复金属支架材料(fe30mn金属骨支架材料)，共5例，用于力学性能测试。力学性能测试使用的主要仪器为万能材料试验机(型号5565，instron/美国)。
[0105]
测试流程：使用万能力学机对5例fe30mn金属骨支架材料进行压缩试验。压缩速率选择为2mm/min，试验停止临界设为样本形变超过为5mm，或压强减小20％。记录原始数据以后，导入origin软件(originlab corp,northampton,massachusetts)后，拟合出应力应变曲线，并对样本的弹性模量、屈服强度进行计算。
[0106]
2、试验结果
[0107]
(1)磁性
[0108]
本发明fe30mn金属骨支架材料的xrd图谱如图5所示，xrd物相分析结果与衍射数据库编号标准pdf卡比对后显示，4例fe30mn材料中fe元素均为铁的奥氏体，即γ-fe，是顺磁性的，可以接受核磁共振检查。
[0109]
(2)孔隙率和孔隙结构
[0110]
本发明fe30mn金属骨支架材料的孔隙率为46.72(
±
0.23)％、孔径为400μm。本发明fe30mn金属骨支架材料孔隙率与某些松质骨相近，而孔径范围为100-400μm时最适宜骨长入。可见，本发明多孔骨缺损修复金属支架材料的多孔结构与某些松质骨结构相近，松质骨孔隙率大，更加利于骨缺损修复时的骨长入。
[0111]
(3)力学性能
[0112]
5例fe30mn金属骨支架材料的弹性模量和屈服强度如表1所示。
[0113]
表1各例fe30mn金属骨支架材料的力学性能
[0114]
例数屈服强度(mpa)弹性模量(gpa)1136.9010.028402187.909.040133182.709.600184174.8011.744015185.0011.07320
[0115]
由表1所示的数据可知：5例fe30mn金属骨支架材料的平均弹性模量为10.30
±
3.99gpa，平均屈服强度为173.46
±
21.01mpa。
[0116]
不同部位骨的力学性能有较大的差异。根据文献报道，皮质骨的弹性模量、屈服强度大约在11～15gpa，104～121mpa范围；松质骨的弹性模量、屈服强度大约在1.1～2.0gpa，0.6～16.3mpa范围。可见，本发明的3d打印多孔可生物降解的fe30mn金属骨支架材料可以满足负重区域(皮质骨)骨缺损修复的力学支撑要求。
[0117]
试验例2、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料的体外降解
[0118]
1、试验方法
[0119]
本研究采用动电位极化法，测量形状和大小完全相同的本发明3d打印实心fe30mn金属骨支架材料和实心纯fe材料的面腐蚀速率。实心fe30mn金属骨支架材料和实心纯fe材料各5例。
[0120]
(1)样本准备：把待测样本置入环氧树脂中，进行机械抛光处理。而后把样本置于电解液中立即进行测试，使用前需用异丙醇清洗。测试过程在电化学工作站(ch-604a,ch instruments,inc.,austin,tx)上进行。
[0121]
(2)测试参数设定及过程：稳定1h以达到开路电势。扫描速率为1mvs-1
，电位窗口设定在高于开路电势500mv和低于开路电势200mv范围内。采用三电极电解池，其中铂为对电极，ag或agcl为参比电极，样本为工作电极。为模拟体内的生理环境，测试过程均在ph值为7.4，并在含有0.35g/l碳酸氢钠的hanks平衡盐溶液(hbss h1387,sigmaaldrich,canada)中进行，且温度维持在37.4℃。
[0122]
(3)降解速率计算：降解速率cr(mm/year)根据cr＝k(i
corr
/ρ)ew公式计算，其中k为常量(3.27
×
10-3
mmgμa-1
cm-1
year-1
)；i
corr
为腐蚀电流密度(μa-1
cm-2
)；ρ为密度(gcm-3
)；ew为等效重量(基于fe和mn的氧化反应计算；纯fe的ew＝27.92g eq-1
)。
[0123]
2、试验结果
[0124]
实心fe30mn金属骨支架材料(fe30mn)及实心纯fe材料(fe)在hbss中行金属电化学腐蚀实验，电化学腐蚀实验后腐蚀参数如表2所示，表2显示了fe30mn及fe金属电化学腐
蚀实验中腐蚀电位(e
corr
)，腐蚀电流密度(i
corr
)，阳极极化曲线斜率(β
a
)，阴极极化曲线斜率(β
c
)及腐蚀速率(corrosion rate,cr)。测定出的极化曲线如图6所示。由金属电化学腐蚀实验结果可知：fe30mn和fe材料的腐蚀电位(e
corr
)分别为-0.691
±
0.029v和-0.723
±
0.033v，差异无统计学差异。fe30mn腐蚀电流密度大于fe，差异有统计学意义(p<0.01)。根据cr＝k(
icorr
/ρ)ew公式，腐蚀速率可由平均腐蚀电流密度计算。其中腐蚀速率(cr)单位为毫米/年(mm/a)，腐蚀电流密度(i
corr
)单位是安培/平方厘米(a/cm2)，ew是等效质量，ρ是两种材料的标准密度。可以看出，fe30mn合金有着比纯fe材料更快的腐蚀速率。可以利用3d打印技术，通过调整fe30mn的孔隙率，从而调整其表面积，进而调节其降解速率。
[0125]
表2实心fe30mn金属骨支架材料及实心纯fe材料电化学腐蚀实验后腐蚀参数，均数(标准差)
[0126][0127]
*表示上述腐蚀参数中，两组间对比差异有统计学意义(p<0.05)。
[0128]
试验例3、本发明用于负重区域的多孔骨缺损修复金属支架材料的体内降解
[0129]
一、试验方法
[0130]
1、实验动物与分组
[0131]
于四川大学华西科技园购买健康、体重在3-3.5kg范围内、spf级成年雄性新西兰大白兔54只，并于标准恒温恒湿条件下饲养(饲养环境温度18～29℃，相对湿度达40％～70％，日温差≤3℃，洁净度一万级，噪音≤60db)。对购买的实验动物进行体检，包括：(1)躯干、肢体是否完好，有无外伤、畸形、感染；(2)精神、饮食、活动、大小便、睡眠；(3)适应性饲养、观察7天后，合格的动物纳入实验。动物实验所有相关操作均符合四川大学伦理委员会标准。
[0132]
将合格的新西兰大白兔，予兔双侧股骨髁造底面直径为6mm，高为10mm的圆柱形骨缺损模型。骨缺损造模后，植入圆柱体fe30mn金属骨支架材料为a组。骨缺损造模后，旷置处理无任何植入物的是空白组，即e组。未行骨缺损造模的一组实验兔为正常对照组，即f组。
[0133]
2、兔股骨股缺损的建立及材料的植入
[0134]
兔股骨股缺损的建立的具体手术步骤如下(部分术中图片如图7所示)：
[0135]
a.手术器械使用高温高压蒸汽灭菌。
[0136]
b.使用戊巴比妥30mg/kg进行肌肉注射对实验兔进行麻醉，双侧膝关节周围备皮，将兔双下肢固定于轻微内旋位，用碘伏予术区消毒，常规铺巾。
[0137]
c.于兔股骨远端外侧作长约3cm左右的切口，切开皮肤、皮下、深筋膜，从兔大腿外侧肌间隙钝性分离肌肉，直至暴露股骨远端外侧。
[0138]
d.用电钻从兔股骨髁外侧向内侧钻入，造底面直径为6mm，高为10mm圆柱形骨缺
损，骨缺损长轴与兔股骨长轴垂直。
[0139]
e.a组骨缺损造模后在缺损处植入实施例1制备的fe30mn金属骨支架材料。e组造模完成后旷置、不植入任何材料。于对侧兔股骨远端同样地行切开、暴露、钻孔及植入fe30mn金属骨支架材料或旷置等操作。
[0140]
f.碘伏、生理盐水反复冲洗，明胶海绵填充止血。缝合深筋膜后，全层缝合皮肤，碘伏消毒。
[0141]
g.术毕动物清醒后可进饮，2小时后可进食。术后实验兔于华西科技园动物实验中心饲养，饲养方案同前。术后3天内，每天予实验兔肌注40万iu青霉素一次，以预防感染。
[0142]
未造模的兔子作为空白对照组(f组)。a组、e组和f组每组有新西兰大白兔9只。
[0143]
3、对实验动物观察及相关指标检测
[0144]
3.1动物术后一般情况的观察
[0145]
对所有术后实验兔的一般情况观察和记录，包括术后四肢活动情况、进食情况、日常活动、创面有无感染，创面及周围有无皮下积气和血肿形成；造模区域或附近区域有无骨折等。
[0146]
3.2血液铁锰离子含量及肝肾功检测
[0147]
术后12周、24周，抽取a组、e组和f组每组各3只兔的耳缘静脉血，送实验室检测，并计算平均值。检测指标主要包括血中铁、锰离子浓度，肝肾功等指标。
[0148]
3.3大体标本观察
[0149]
于术后12周、24周两个时间点分别处死a组中3只实验兔，处死e组中2只实验兔，处死f组中1只实验兔。暴露实验兔股骨中下段及胫骨上段，用磨钻(strong 90n)于膝关节水平以上约4-5cm处截断股骨。于膝关节线水平，松解关节囊，切断韧带，将胫骨从膝关节离断。仔细去除标本上软组织后，观察、拍照并放于4％中性甲醛溶液中固定。室温条件下，阴凉处避光保存，固定48小时。将固定好的标本，用纯水清洗2-3遍。
[0150]
3.4肝、肾切片he染色
[0151]
于术后24周，a组实验兔被处死后，立即取其肝、肾制作组织切片。具体流程如下：
[0152]
(1)病理切片的制作
[0153]
1)取材：实验兔被处死后，取肝、肾，切薄后放置于包埋盒内。
[0154]
2)固定：将组织块浸泡在4％的中性甲醛中固定48h，固定完毕后，流水冲洗24h，去除多余的固定液。
[0155]
3)脱水：将已固定的材料块进行修剪，通过酒精梯度脱水。
[0156]
4)透明：脱水后，将椎材料块浸入二甲苯i 20min、二甲苯ii 20min。
[0157]
5)浸蜡：将透明后的材料块浸入蜡液。
[0158]
6)石蜡包埋：将浸蜡后的组织块平放入含有蜡液的模具中，使材料块与蜡液凝固在一起，制备成蜡块。
[0159]
7)修块：将蜡块中的多余石蜡切除，并将所需切片修理平整。
[0160]
8)切片：使用切片机连续切片，切片厚度为5um，并将石蜡包埋的组织薄片贴附于载玻片上，置于恒温箱中烘烤至完全干燥。
[0161]
(2)苏木精-伊红(he)染色
[0162]
1)物品准备：透明剂，100％乙醇，伊红染液，苏木素染液，氨水，盐酸，200ml磨口玻
璃瓶，染色缸，中性树脂，盖玻片，计时器。
[0163]
2)配置试剂：配制浓度为95％、90％、80％、75％、70％的乙醇各500ml，浓度为0.25％的氨水200ml，1％的盐酸酒精200ml(溶剂为75％的乙醇)。依次在磨口玻璃瓶上贴好标签：脱蜡1，脱蜡2，100％乙醇，95％乙醇1，90％乙醇，80％乙醇，70％乙醇，苏木素，盐酸酒精，氨水，75％乙醇，伊红，脱水1，脱水2，透明1，透明2，倒入对应的试剂各200ml(脱蜡1和2是透明剂，脱水1和2是100％乙醇)。
[0164]
3)脱蜡复水:将白片放入染色缸中，放到65
°
烤箱1h，拿出后迅速倒入脱蜡1试剂计时10min，脱蜡2试剂计时10min，100％乙醇试剂计时5min，95％乙醇1试剂计时2min，90％乙醇试剂计时2min，80％乙醇试剂计时2min，在水洗3min。
[0165]
4)he染色：脱蜡复水后的片子放入染色缸中倒入苏木素试剂染色5min，水洗3min，盐酸酒精分化10s，水洗3min，氨水促蓝1min，水洗3min，75％乙醇试剂10s，伊红1min，水洗3min，脱水1试剂1min，脱水2试剂1min；通风橱晾干，透明1试剂5min，透明2试剂5min，在放入通风橱晾干，封片。
[0166]
5)在光学显微镜下观察实验兔肝、肾组织形态。
[0167]
3.5 x线检测
[0168]
于术后12周、24周，a组实验兔被处死后，按3.3中步骤修剪兔股骨下段后，行正侧位x线片检测。分析内植物位置及局部骨修复情况。
[0169]
3.6 mico-ct扫描及fe30mn降解腐蚀量分析
[0170]
于术后12周、24周，a组实验兔被处死并修剪标本后，将标本平放置于mico-ct扫描仪载物台上，mico-ct扫描参数：层厚间距32μm，扫描范围35mm
×
25mm
×
20mm，扫描工作电压90kv，电流88μa，扫描时间为14min/样本。得到mico-ct的dicom原始数据后，导入mimics软件，选择hu值15000-17980重建fe30mn材料，计算fe30mn的表面积和体积。
[0171]
3.7标本扫描电镜检测
[0172]
于术后12周、24周，a组实验兔被处死后，按3.3中步骤修剪兔股骨下段，使兔股骨远端包含材料的情况下，尽量减少股骨干的长度。用10％中性甲醛溶液固定48h后，70％-100％乙醇梯度脱水并用浸润液浸润。用硬组织切片机沿冠状位将组织块及fe30mn材料切开。将样本放入临界点干燥仪行二氧化碳临界点干燥。干燥完成后将材料用碳带固定于样本台上，在7x10-2
mmhg的压力下离子溅射镀金30秒。扫描电镜上观察形貌及eds测量孔隙内物质成分。
[0173]
3.8标本组织学染色及观察
[0174]
(1)硬组织切片的制备
[0175]
术后12周、24周，a组和e组实验兔被处死后，取兔股骨远端，修剪后将标本固定、梯度乙醇脱水，并使用光固化树脂浸透、包埋。用硬组织切片机沿冠状位将组织块及fe30mn材料切片，厚度为10μm。
[0176]
(2)染色
[0177]
a组及e组行品红-亚甲基蓝染色。
[0178]
3.9标本生物力学分析
[0179]
(1)于术后12周，24周处死a组实验兔后，同样暴露其股骨中下段及胫骨上段，用磨钻(strong 90n)于膝关节水平以上约4-5cm处截断股骨。于膝关节线水平，将胫骨从膝关节
离断。仔细去除标本上软组织后，然后用磨钻靠近兔股骨髁最远端截掉大约5mm的远端软骨和骨质，使兔股骨髁远端形成一个平整的截面。再用磨钻将标本近端修整，使近端平面与股骨远端平面平行，且股骨近端平面到股骨远端平面的距离为20mm。将所有标本收集好后，于当天进行生物力学测试。另将a组一部分标本中fe30mn直接取出后，行生物力学检测，评价fe30mn植入兔体内经体内降解后的力学性能变化。力学性能检测使用万能材料试验机(型号5565，instron/美国)，相关参数为：压缩实验中设置压缩速率为2mm/min，试验停止临界设为样本形变超过为5mm，或压强减小20％。根据原始数据，拟合曲线，并计算出fe30mn/股骨髁复合体的刚度，以及fe30mn经体内降解后的弹性模量和屈服强度。
[0180]
4、统计学方法
[0181]
所有数据均采用均数
±
标准差(mean
±
sd)表示。采用单因素方差分析(one-wayanova)进行统计学分析。若方差齐时，则采用lsd检验方法进行两两比较，若方差不齐时用dunnett方法进行修正。两样本率的比较使用四个表卡方检验，四个表理论频数为t，当1≤t＜5时，用四格表卡方检验的校正公式；当t＜1时，使用四格表资料的fisher确切概率法。采用spss12.0软件进行统计分析，p<0.05为差异有统计学意义。
[0182]
二、试验结果
[0183]
1、动物术后一般情况的观察
[0184]
实验动物均在术后2小时内麻醉苏醒。连续观察，手术当天、术后第1天、第2天连续使用青霉素40万iu，肌肉注射，每天一次。术后第1天，实验兔一般情况稍差，食欲减低和活动减少。术后第2天后，一般情况发生好转，进食进水及活动逐渐增加。术后第3天后，一般情况继续好转，进食进水及活动逐渐恢复。术后双侧肢体不需辅助任何外固定且负重活动无限制，动物步态恢复正常。术后1周切口处缝线自行脱落，未见切口发生肿胀感染、出血及渗出等并发症，手术切口一期愈合。
[0185]
a组和e组所有接受手术的实验动物在整个实验阶段均存活。e组(blank组)中，有2只兔分别于术后7天、12天出现单侧肢体畸形，活动障碍，经x线片检查示股骨下段骨折。使用四格卡方检验的fisher确切概率法计算，blank组兔股骨骨折情况，与fe30mn组相比，差异有统计学意义(p<0.05)。
[0186]
2、血液铁锰离子含量及肝肾功检测
[0187]
将fe30mn材料(a组)植入兔股骨髁远端骨缺损以后，12周、24周时实验兔血液指标如表3所示。术后12周，与e组(blank组)及f组(control组)相比，a组兔血液中fe、mn离子含量及肝肾功指标值的差异无统计学意义(p>0.05)。同样的，术后24周，与e组及f组相比，a组兔血液中fe、mn离子含量及肝肾功指标值的差异亦无统计学意义(p>0.05)。上述两个时间点，a组兔血液中fe、mn离子含量及肝肾功指标值均在正常值范围内。证实可降解fe30mn降解后不会引起兔血液中fe，mn离子浓度增加，具备一定安全性。
[0188]
表3 a组，e组和f组术后12周、24周兔血液指标比较
[0189][0190]
3、大体标本观察
[0191]
于术后12、24周处死实验动物，对a组，e组兔股骨远端骨缺损部位进行大体观察(图8)。
[0192]
术后12周，a组fe30mn组植入材料区域表面均有纤维瘢痕组织覆盖，周围软组织无明显炎症反应。去除表面纤维瘢痕组织后，可见有类骨样组织覆盖在fe30mn多孔材料表面。植入的fe30mn多孔材料与周围骨组织结合紧密，无明显缝隙存在。多孔材料孔隙内可见类骨样组织填充。用小止血钳轻轻旋动材料，材料与周围骨组织结合强度高，无法被旋动。术后24周，上述fe30mn多孔材料表面进一步被类骨样组织完全覆盖。
[0193]
术后12周，e组(空白组)骨缺损区域表面亦可见纤维瘢痕组织覆盖，去除表面纤维瘢痕组织后，仍可见骨缺损。术后24周，e组骨缺损区域表面有少量类骨样组织覆盖。
[0194]
4、肝、肾切片he染色
[0195]
术后24周，a组兔肝脏切片he染色显示：肝小叶形态正常、结构完整，肝细胞索整齐排列。肝细胞大小一致，胞内偶见脂滴。肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区结构清晰，无明显炎性细胞浸润。未见肝细胞肿胀、坏死(图9a和图9b)。
[0196]
术后24周，a组兔肾脏切片he染色显示：肾小球无明显病变，未见充血、水肿。肾小球毛细血管袢开放良好，小球系膜细胞及基质未见明显增生。肾小管上皮细胞形态正常、边界清晰、胞浆致密清澈，未见水肿。肾小管管腔内未见管型。肾间质无静脉扩张充血，视野中无明显炎细胞浸润(图9c和图9d)。
[0197]
从病理学上，证实fe30mn对肝肾无毒、安全。
[0198]
5、x线检测
[0199]
术后12、24周，a组兔处死后行x线照片，如图10。术后12周时(图10a和图10b)，x片可见内植物材料与周围骨质接触紧密，界面未见透亮带，均未见骨膜反应、死骨、骨溶解，亦未见内植物松动、移位及骨折。术后24周时(图10c和图10d)，除可见术后12周时征象外，还可见兔股骨远端骨周围及内植物周围有较多骨痂影形成。
[0200]
6、micro-ct扫描fe30mn材料腐蚀量分析及定性观察骨长入
[0201]
fe30mn材料植入实验兔体内后，术后12周，24周处死兔。分别于植入前(0周)，术后12周，24周时行fe30mn材料兔股骨micro-ct。在mimics软件中，选择hu值15000-17980重建fe30mn材料。计算出不同时间点fe30mn的表面积及体积如图11，12和表4所示。随着植入实验兔体内时间的延长，经micro-ct测量、mimics重建出的3d打印多孔可生物降解fe30mn金属骨支架材料的表面积及体积逐渐减小。术后12周时，fe30mn的表面积分别减小到植入前(0周)的97.71％，fe30mn的体积分别减小到植入前(0周)的90.83％；术后24周时，fe30mn的表面积分别减小到植入前(0周)的88.55％，fe30mn的体积分别减小到植入前(0周)的74.55％。该部分数据证实，fe30mn在体内具备相对较慢的降解速率(用于骨缺损修复的可
降解金属主要是mg，li等的研究报道(li z,gu x,lou s,zheng y:the development of binary mg-ca alloys for use as biodegradable materials within bone.biomaterials 2008,29(10):1329-1344.)将镁钙合金(mg-1ca)植入实验兔体内，术后3月移植物基本完全降解。witte等研究报道(witte f,ulrich h,palm c,willbold ejjobmrpa:biodegradable magnesium scaffolds:part ii:peri-implantbone remodeling.2007,81(3):757-765.和witte f,ulrich h,rudert m,willbold ejjobmrpa:biodegradable magnesium scaffolds:part i:appropriate inflammatory response.2007,81(3):748-756.)多孔镁基合金az91d植入实验兔体内，术后3月az91d也基本完全降解。可见，镁基合金降解速度较快，随着多孔镁基金属的降解，其屈服强度进一步减小。而本发明支架具备相对较慢的降解速率)，在骨长入过程中可以持续为负重区域骨缺损提供足够的支撑。
[0202]
术后12周、24周，将fe30mn micro-ct扫描后的dicom数据导入mimics 21.0进行渲染，在矢状位断面皮质骨重建上可定性观察到材料周边及内部孔隙内的新生骨，如图13。该部分证实多孔fe30mn有较好的骨长入。
[0203]
表4 fe30mn植入前(0周)，术后12周，24周micro-ct测得表面积、体积结果，均数(标准差)
[0204][0205]
7、标本扫描电镜检测
[0206]
术后24周，fe30mn材料孔隙内部均可见大量不规则新生骨组织长入，新生骨组织成颗粒状、片状、岛屿状，向材料中心延伸。材料部分孔隙被完全覆盖(图14a-b)。图14a-d展示了fe30mn孔隙内新生骨组织长入情况及材料边缘与骨结合部位紧密连接的情况。而e组空白组，sem下仍可见较大骨缺损，无任何组织长入(图14e，f)。
[0207]
对fe30mn材料孔隙新生骨组织进行能量色散x射线光谱(energy-dispersive x-ray spectroscopy,eds)(oxford instruments,uk)检测，面扫描(mapping scan)结果如图15所示，ca、p元素浓集区与材料切面孔隙新生骨组织分布范围一致，其中主要以ca元素为主。孔隙以外材料区域，eds面扫描显示，其主要元素为fe，mn。eds线扫描如图16所示：ca，p的谱峰出现区域与材料切面孔隙内新生骨组织分布范围一致。fe，mn谱峰出现区域与孔隙以外材料区域一致。该部分证实fe30mn有较好的骨长入。
[0208]
8、标本组织学染色及观察
[0209]
术后12周、24周品红-亚甲基蓝结果分别见17、图18。术后12周，a组材料周边可见新生骨小梁形成，骨小梁纤细(图17a-e)。材料/骨组织界面见蓝色软骨形成(图17a-c)，亦可见粉红色不成熟骨(图17d，图17e)。术后24周，可见fe30mn材料周边、材料/骨组织界面可见大量红染新生骨痂形成，其中见大量成骨细胞。骨痂由界面向材料内部逐渐延伸。材料内
部孔隙内可见新生骨(图17f-h)。该部分证实fe30mn有较好的骨长入。
[0210]
e组空白组术后12周，可见骨缺损周边主要以纤维组织和脂肪组织填充，有少量散在成骨。骨缺损断裂处清晰可见，无纤维组织、骨组织修复(图18a，图18b)。术后24周，e组空白组骨缺损周边散在成骨进一步增多但不连续，其间仍然填充着大量纤维组织及脂肪组织，骨缺损断裂处仍可清晰观察到空白、无任何组织填空修复的区域(图18c， 图18d)。
[0211]
9、标本生物力学分析
[0212]
9.1 fe30mn植入兔体内取出后材料生物力学测试
[0213]
fe30mn材料植入实验兔股骨髁骨缺损内，于术后12周、24周取出后，使用万能力学机对材料进行压缩测试，fe30mn组3个样本，测试后计算平均值，结果见表5和图19。随着植入实验兔体内时间的延长，fe30mn的弹性模量逐渐减小。植入实验兔12周后，fe30mn的弹性模量较初始时间(未植入兔体内)时减小了4.56％；植入实验兔体内24周后，fe30mn的弹性模量较初始时间(未植入兔体内)时减小了12.14％(b组)。植入实验兔体内12、24周后，fe30mn的弹性模量与初始时间(未植入兔体内)时相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
[0214]
同样的，随着植入实验兔体内时间的延长，fe30mn的屈服强度也逐渐减小。植入实验兔体内12周后，fe30mn的屈服强度分别较初始时间(未植入兔体内)时减小了4.55％；植入实验兔体内24周后，fe30mn的屈服强度分别较初始时间(未植入兔体内)时减小了7.63％。植入实验兔体内12、24周后，fe30mn的屈服强度与初始时间(未植入兔体内)时相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
[0215]
表5.fe30mn植入兔体内取出后材料生物力学测试，均数(标准差)
[0216][0217]
9.2 fe30mn植入术后12周、24周，fe30mn/股骨髁复合体刚度测试
[0218]
fe30mn材料植入实验兔股骨髁骨缺损后12周、24周，将fe30mn实验兔股骨远端取出、适当修剪，使用万能力学机对其进行压缩测试，结果见表6。术后12周、24周，股骨髁骨缺损修复处四组fe30mn/股骨髁复合体的刚度与f组(正常对照组)相比，差异无统计学意义，(p>0.05)，且刚度均明显优于e组(空白对照组)，差异有统计学意义(p<0.01)。fe30mn/股骨髁复合体的刚度两两比较，差异均无统计学意义(p>0.05)。
[0219]
表6.术后12周、24周，fe30mn/股骨髁复合体刚度与e组及f组比较，均数(标准差)
[0220][0221]
该试验证实fe30mn植入兔体内后，12周、24周经降解后，仍能为负重区域提供较好
的支撑。
[0222]
综上，本发明特定的铁锰合金粉末作为打印材料，与3d打印中的选区激光熔化技术相结合，可打印出与骨缺损形状完美匹配的多孔可生物降解fe30mn金属骨支架材料，满足患者个性化需求。同时，该fe30mn金属骨支架材料生物相容性良好、力学性能良好、降解速度适宜：既能克服金属材料无法降解、难以形成新生骨对内植物替代的问题，又能在降解后仍能提供良好的力学性能，克服现有技术中骨修复材料降解后力学性能差的问题，在骨缺损修复过程中有效地提供力学支撑。本发明多孔可生物降解fe30mn金属骨支架材料适宜用于负重区域骨缺损(如皮质骨)的修复，具有良好的应用前景。