本发明涉及二氢卟吩制剂技术领域，尤其涉及一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂及其制备方法。
背景技术：
光动力疗法(photodynamictherapy，pdt)是20世纪80年代初发展起来的一种肿瘤治疗新技术，即用特定波长的光辐照摄入光敏剂的病灶组织，由光敏剂诱发产生线态氧等细胞毒活性氧物质而导致靶组织细胞坏死或凋亡。它是一无创或微创性，非产热性的、利用光化学反应引起靶组织和靶细胞破坏的治疗方法。在光动力疗法中，氧气、光源和光敏药物被融合在一起，是一种主要影响靶组织的选择性治疗形式。
肿瘤光动力治疗药二氢卟吩e6单酯，具有环状四吡咯结构，是叶绿素降解产物经半合成而成，具有结构明确、红光治疗区(λ>600nm)最大吸收波长红移至660-700nm且吸收系数高一个数量级、光敏作用强、体内清除速度快、皮肤光毒性小，理化性质稳定等优点，通过在恶性组织内对一定波长光的能量传递，使周围介质中的分子氧化成为单线态氧(1o2)等活性氧物质，进一步与生物分子中的氧化敏感基团作用，导致其氧化失活，最终引起肿瘤细胞死亡而显示治疗作用。
小鼠药效学研究表明，二氢卟吩e6单酯对人肺癌a549、人宫颈癌hela和人肝癌有显著抑制作用，并呈现出剂量(药剂量和光剂量)效应关系。
荷瘤小鼠单剂量静注给药3mg/kg二氢卟吩e6单酯后，药物浓度随血液循环广泛地分布到血流丰富的组织脏器，0.5h或2h达到最高药物浓度，0.25h-4h范围内药物组织分布处于高浓度区域，而注射给药24h后荷瘤小鼠各组织器官中的药物浓度均显著降低。其中二氢卟吩e6单酯在肝、肺中分布浓度最高，心、肾次之，脾脏和肿瘤相对较低，肌肉、脂肪、皮肤、脑极少。但相对而言，二氢卟吩e6单酯药物在肿瘤组织有较高的分布浓度，且随时间推移药物浓度下降幅度缓慢，24h仍维持一定的组织药物水平。由于皮肤中分布极少，其皮肤毒性很小，尤在太阳光下的皮肤光毒性更小，优于现有的市售光敏剂。且在一小时内达峰，故治疗在一小时内完成。
但是二氢卟吩e6以游离形式给药后，虽然在肿瘤组织具有选择性好等优点，但也存在在体内的半衰期特别短、在心脏中浓度高、生物利用度较低等缺点。故研究一种能通过改变药物的分布来有效降低抗肿瘤药物的毒副作用并提高治疗指数的靶向制剂很有必要。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，通过将二氢卟吩e6单酯制备成脂质体，并制备成冻干制剂，既大大的提升了二氢卟吩e6的稳定性，同时也大大增加了药物在体内的靶向性。
本发明的技术方案如下：
一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，包括如下质量比的各原料组分：
脂质体：软磷脂:胆固醇＝(3-4):1；
二氢卟吩e6单酯，药脂比，二氢卟吩e6单酯:脂质体＝1:(35-40)；
内相缓冲溶液，与脂质体的质量体积比为,脂质体:内相缓冲溶液＝(8-12):1(mg/ml)；
ph调节剂；
其中，所述二氢卟吩e6单酯的烷基为乙基或甲基。
优选的，所述软磷脂为大豆软磷脂。
优选的，所述内相缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，所述ph调节剂为0.2m磷酸。
优选的，所述内相缓冲液ph为8.5-9.5。
优选的，所述内相缓冲溶液中还添加有质量分数为0.5％的吐温80。
上述的二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，制备方法如下：
1)按照配比准确称取软磷脂、胆固醇和二氢卟吩e6单酯，将软磷脂和胆固醇溶于适量溶剂中，完全溶解后，置于旋蒸仪中，40℃，180r/min减压蒸馏除去溶剂得到膜状物；
2)向步骤1)中得到的膜状物中加入内相缓冲液，常温下控制温度为45-50℃，氮气保护下，常压，180r/min继续旋蒸30min，得空白脂质体材料；
3)避光条件下，将二氢卟吩e6单酯溶解在少量内相缓冲液中，逐滴加入到步骤2)的脂质体溶液中，使得溶解能够较为充分，同时用ph调节剂调节ph至6.6-7.4，形成ph梯度差，便于向空白脂质体内转移，冰浴中200w1s/1s超声10min溶解后，30-40℃静止2h即得脂质体。低频超声能够促进溶解，同时对脂质体的粒径也有较好的控制，保证脂质体的粒径能够在100nm左右，更易被肝、脾巨噬细胞摄取。
4)在3)中得到的脂质体中加入体系总质量3-5％的冻干保护剂，搅拌溶解后，分别通过孔径为0.8、0.45、0.22μm的滤膜，装入棕色中性硼硅西林瓶中，半压胶塞，经4℃预冻1h、-18℃预冻3h、-35℃预冻5h后，在冷阱温度-55℃，真空冷冻干燥36-48h后，抽真空，压盖，轧铝盖即得冻干制剂。
优选的，所述步骤1)中溶剂为氯仿和甲醇按照体积比5:1混合而成的。
优选的，所述步骤4)中冻干保护剂为蔗糖、乳糖或甘露醇。
本发明中的有益效果：本发明通过将稳定性欠佳的二氢卟吩e6单酯包埋至脂质体内，可大量提升其稳定性，通过控制软磷脂及胆固醇量，保证制得的脂质体稳定较好，水化时通过加入表面活性剂，使得脂质体制备过程中不易团聚，通过低频超声既能够促溶，又可保证制得的脂质体粒径适宜；由于二氢卟吩e6的碱溶特性，控制脂质体内相ph在8.5-9.5，同时控制在脂质体外相ph在中性左右，在ph梯度的驱动下，便于其跨膜进入脂质体内部，可大大提升包埋率。
由于脂质体液体状态下稳定性相对较差，因此，将制得的脂质体冻干制得冻干制剂，控制预冻的工艺，使得预冻温度均低于最低共熔点，保证彻底冻干，同时加入冻干保护剂，使得冻干后复溶时脂质体能够保证有较好形态和粒径。
本申请中的脂质体制备的设备简单，成本较低，不需要高压匀质机等大型生产设备，通过简单的低频超声即可，制得脂质体稳定性较好，操作方法简单，宜于控制，适合于生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，包括如下质量比的各原料组分：
脂质体：大豆软磷脂:胆固醇＝4:1；
二氢卟吩e6单酯，药脂比，二氢卟吩e6单酯:脂质体＝1:40；
内相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，ph为8.5，含有质量分数为0.5％的吐温80，与脂质体的质量体积比为，脂质体:内相缓冲溶液＝10:1(mg/ml)；
ph调节剂为0.2m磷酸，适量；
所述二氢卟吩e6单酯的烷基为乙基或甲基，胆固醇用量为100mg，其余组分用量按比例进行添加。
上述的二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，制备方法如下：
1)按照配比准确称取软磷脂、胆固醇和二氢卟吩e6单酯，将软磷脂和胆固醇溶于适量溶剂(氯仿:甲醇＝5:1)中，完全溶解后，置于旋蒸仪中，40℃，180r/min减压蒸馏(抽真空至0.09mpa)除去溶剂得到膜状物；
2)向步骤1)中得到的膜状物中加入内相缓冲液，常温下控制温度为45℃，氮气保护下，常压，180r/min继续旋蒸30min，得空白脂质体材料；
3)避光条件下，将二氢卟吩e6单酯溶解在少量内相缓冲液中，逐滴加入到步骤2)的脂质体溶液中，使得溶解能够较为充分，同时用ph调节剂调节ph至6.8，冰浴中200w1s/1s超声10min溶解后，35℃静止2h即得脂质体。
4)在3)中得到的脂质体中加入溶液体系总质量4％的蔗糖，搅拌溶解后，分别通过孔径为0.8、0.45、0.22μm的滤膜，装入棕色中性硼硅西林瓶中，半压胶塞，经4℃预冻1h、-18℃预冻3h、-35℃预冻5h后，在冷阱温度-55℃，真空冷冻干燥48h后，抽真空，压盖，轧铝盖即得冻干制剂。
实施例2。
一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，包括如下质量比的各原料组分：
脂质体：大豆软磷脂:胆固醇＝4:1；
二氢卟吩e6单酯，药脂比，二氢卟吩e6单酯:脂质体＝1:36；
内相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，ph为9.0，含有质量分数为0.5％的吐温80，与脂质体的质量体积比为，脂质体:内相缓冲溶液＝12:1(mg/ml)；
ph调节剂为0.2m磷酸，适量；
所述二氢卟吩e6单酯的烷基为乙基或甲基，胆固醇用量为20mg，其余组分用量按比例进行添加。
上述的二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，制备方法如下：
1)按照配比准确称取软磷脂、胆固醇和二氢卟吩e6单酯，将软磷脂和胆固醇溶于适量溶剂(氯仿:甲醇＝5:1)中，完全溶解后，置于旋蒸仪中，40℃，180r/min减压蒸馏(抽真空至0.09mpa)除去溶剂得到膜状物；
2)向步骤1)中得到的膜状物中加入内相缓冲液，常温下控制温度为45℃，氮气保护下，常压，180r/min继续旋蒸30min，得空白脂质体材料；
3)避光条件下，将二氢卟吩e6单酯溶解在少量内相缓冲液中，逐滴加入到步骤2)的脂质体溶液中，使得溶解能够较为充分，同时用ph调节剂调节ph至7.2，冰浴中200w1s/1s超声10min溶解后，35℃静止2h即得脂质体。
4)在3)中得到的脂质体中加入溶液体系总质量4％的乳糖，搅拌溶解后，分别通过孔径为0.8、0.45、0.22μm的滤膜，装入棕色中性硼硅西林瓶中，半压胶塞，经4℃预冻1h、-18℃预冻3h、-35℃预冻5h后，在冷阱温度-55℃，真空冷冻干燥36h后，抽真空，压盖，轧铝盖即得冻干制剂。
实施例3
一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，包括如下质量比的各原料组分：
脂质体：大豆软磷脂:胆固醇＝3.5:1；
二氢卟吩e6单酯，药脂比，二氢卟吩e6单酯:脂质体＝1:38；
内相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，ph为9.0，含有质量分数为0.5％的吐温80，与脂质体的质量体积比为，脂质体:内相缓冲溶液＝8:1(mg/ml)；
ph调节剂为0.2m磷酸，适量；
所述二氢卟吩e6单酯的烷基为乙基或甲基，胆固醇用量为40mg，其余组分用量按比例进行添加。
上述的二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，制备方法如下：
1)按照配比准确称取软磷脂、胆固醇和二氢卟吩e6单酯，将软磷脂和胆固醇溶于适量溶剂(氯仿:甲醇＝5:1)中，完全溶解后，置于旋蒸仪中，40℃，180r/min减压蒸馏(抽真空至0.09mpa)除去溶剂得到膜状物；
2)向步骤1)中得到的膜状物中加入内相缓冲液，常温下控制温度为45℃，氮气保护下，常压，180r/min继续旋蒸30min，得空白脂质体材料；
3)避光条件下，将二氢卟吩e6单酯溶解在少量内相缓冲液中，逐滴加入到步骤2)的脂质体溶液中，使得溶解能够较为充分，同时用ph调节剂调节ph至7.2，冰浴中200w1s/1s超声10min溶解后，35℃静止2h即得脂质体。
4)在3)中得到的脂质体中加入溶液体系总质量5％的蔗糖和甘露醇，搅拌溶解后，分别通过孔径为0.8、0.45、0.22μm的滤膜，装入棕色中性硼硅西林瓶中，半压胶塞，经4℃预冻1h、-18℃预冻3h、-35℃预冻5h后，在冷阱温度-55℃，真空冷冻干燥42h后，抽真空，压盖，轧铝盖即得冻干制剂。
实施例4
一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，包括如下质量比的各原料组分：
脂质体：大豆软磷脂:胆固醇＝4:1；
二氢卟吩e6单酯，药脂比，二氢卟吩e6单酯:脂质体＝1:40；
内相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，ph为9.5，含有质量分数为0.5％的吐温80，与脂质体的质量体积比为，脂质体:内相缓冲溶液＝10:1(mg/ml)；
ph调节剂为0.2m磷酸，适量；
所述二氢卟吩e6单酯的烷基为乙基或甲基，胆固醇用量为100mg，其余组分用量按比例进行添加。
上述的二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，制备方法如下：
1)按照配比准确称取软磷脂、胆固醇和二氢卟吩e6单酯，将软磷脂和胆固醇溶于适量溶剂(氯仿:甲醇＝5:1)中，完全溶解后，置于旋蒸仪中，40℃，180r/min减压蒸馏(抽真空至0.09mpa)除去溶剂得到膜状物；
2)向步骤1)中得到的膜状物中加入内相缓冲液，常温下控制温度为45℃，氮气保护下，常压，180r/min继续旋蒸30min，得空白脂质体材料；
3)避光条件下，将二氢卟吩e6单酯溶解在少量内相缓冲液中，逐滴加入到步骤2)的脂质体溶液中，使得溶解能够较为充分，同时用ph调节剂调节ph至7.4，冰浴中200w1s/1s超声10min溶解后，35℃静止2h即得脂质体。
4)在3)中得到的脂质体中加入溶液体系总质量4％的蔗糖，搅拌溶解后，分别通过孔径为0.8、0.45、0.22μm的滤膜，装入棕色中性硼硅西林瓶中，半压胶塞，经4℃预冻1h、-18℃预冻3h、-35℃预冻5h后，在冷阱温度-55℃，真空冷冻干燥42h后，抽真空，压盖，轧铝盖即得冻干制剂。
实施例5
一种二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，包括如下质量比的各原料组分：
脂质体：大豆软磷脂:胆固醇＝4:1；
二氢卟吩e6单酯，药脂比，二氢卟吩e6单酯:脂质体＝1:36；
内相缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，ph为9.5，含有质量分数为0.5％的吐温80，与脂质体的质量体积比为，脂质体:内相缓冲溶液＝12:1(mg/ml)；
ph调节剂为0.2m磷酸，适量；
所述二氢卟吩e6单酯的烷基为乙基或甲基，胆固醇用量为50mg，其余组分用量按比例进行添加。
上述的二氢卟吩e6单酯脂质体冻干制剂，制备方法如下：
1)按照配比准确称取软磷脂、胆固醇和二氢卟吩e6单酯，将软磷脂和胆固醇溶于适量溶剂(氯仿:甲醇＝5:1)中，完全溶解后，置于旋蒸仪中，40℃，180r/min减压蒸馏(抽真空至0.09mpa)除去溶剂得到膜状物；
2)向步骤1)中得到的膜状物中加入内相缓冲液，常温下控制温度为45℃，氮气保护下，常压，180r/min继续旋蒸30min，得空白脂质体材料；
3)避光条件下，将二氢卟吩e6单酯溶解在少量内相缓冲液中，逐滴加入到步骤2)的脂质体溶液中，使得溶解能够较为充分，同时用ph调节剂调节ph至6.8，冰浴中200w1s/1s超声10min溶解后，35℃静止2h即得脂质体。
4)在3)中得到的脂质体中加入溶液体系总质量4％的乳糖和甘露醇，搅拌溶解后，分别通过孔径为0.8、0.45、0.22μm的滤膜，装入棕色中性硼硅西林瓶中，半压胶塞，经4℃预冻1h、-18℃预冻3h、-35℃预冻5h后，在冷阱温度-55℃，真空冷冻干燥42h后，抽真空，压盖，轧铝盖即得冻干制剂。
相关指标测定
1、粒径检测：将制得的脂质体混悬液利用zatasize1000hsa型激光散射粒径仪测定；同时冻干制品采用注射用水溶解后测定平均粒径，结果见表1：
表1冻干前后脂质体平均粒径
可以看出，冻干前后，脂质体的平均粒径变化不大，均为100nm左右，因此可以较好的进入到肝脏、脾脏当中。
2、包封率测定：采用葡聚糖凝胶柱色谱法进行测定。
具体方法如下，在不断搅拌下缓缓将经水溶胀12h的sephadexg-50加入底部装有筛板的玻璃柱(15mm×300mm)，排除气泡，用水以0.67ml·min-1的流速冲洗平衡后即得凝胶柱。精密吸取脂质体混悬液0.2ml加于sephadexg-50凝胶柱顶部，用水以2/3ml·min-1的流速洗脱，收集脂质体部分洗脱液至25ml棕色量瓶中，用10％曲拉通x-100溶液破乳并定容，摇匀后精密吸取该溶液20μl进样测定，计算被包封药物的浓度(c1)；同理，另精密移取脂质体混悬液0.2ml，用10％曲拉通x-100破乳并定容，摇匀后同法测定，计算混悬液中游离的和被包封药物总浓度(c0)。根据公式：包封率＝c1/c0×100％，计算脂质体平均包封率。同理，将冻干后的脂质体复溶后，进行包封率的测定。
结果如表2：
表2冻干前后脂质体包封率
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。