一种新型聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物纳米载药微球的制备方法与流程

本发明属于高分子药物释放载体制备技术领域，具体涉及一种新型聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物纳米载药微球的制备方法。

背景技术：

纳米药物载体是指具有纳米尺度的用于药物释放的载体。利用纳米药物载体可以实现对化疗药物、蛋白和核酸药物等的携载。目前，多种材料被广泛的应用于构建纳米药物载体且部分已处于商品化或临床研究阶段。两亲性嵌段共聚物由于其独特的结构可在水中自组装成纳米微球，可有效改善疏水药物在水中的溶解度。

两亲性嵌段共聚物中的亲水嵌段主要是聚氧乙烯(peo)或称为聚乙二醇(peg)等，疏水嵌段主要是聚乳酸(pla)、聚己内酯(pcl)、聚乙交酯(pga)、聚乳酸乙醇酸酯(plga)、聚戊内酯(pvl)和聚氨基酸等。此类载体具有强载药能力、稳定性好、体内循环时间长和靶向输送等特点。

聚γ丁内酯(pbl)是一种以γ丁内酯为单体开环聚合得到的具有优异生物相容性和降解性能的高分子聚酯材料，聚γ丁内酯与聚γ羟基丁酸(p4hb)具有完全相同的化学结构，聚γ羟基丁酸已经通过美国食品药品监督管理局(u.s.foodanddrugadministration，u.s.fda)批准，并应用于手术缝合线和补片等领域。然而，迄今为止，仅有一例基于γ丁内酯开环聚合制备多嵌段共聚物作为植入器械药物控释涂层的应用研究(us7897168b2)。因此，研发一种新型聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物纳米载药微球，在理论研究和工业应用方面均具有重要的意义和价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型聚乙二醇-聚γ丁内酯(peg-pbl)两嵌段共聚物纳米载药微球的制备方法，操作简单、省时高效、易于产业化。同时，进行了细胞相容性评价以及抗癌活性实验。

本发明提供的制备新型聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物纳米载药微球的制备方法，通过溶剂挥发法制备，包括步骤：

(1)将聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物、药物和挥发性有机溶剂搅拌混合成均一油相溶液a；

(2)向溶液a中加入去离子水，经微射流匀质机多次匀质后，得均匀乳液b；

(3)乳液b室温下搅拌挥发除去有机溶剂获得到载药微球悬液c；

(4)将悬液c高速冷冻离心，离心所得固体冷冻干燥，即制备得基于peg-pbl的纳米载药微球。

(5)药物释放是在ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs溶液)中于37℃下进行7天，在相应时间点取出释放介质，并补充新鲜pbs溶液。

(6)培养l929细胞，进行细胞相容性评价。利用mtt法检验l929细胞与纳米微球共培养后的相对生长率，分别在24h、48h和72h，测量蓝紫色结晶甲瓒的吸光度值，然后通过公式计算得到细胞相对生长率。

(7)培养a549细胞，进行抗癌活性实验。利用mtt法检验a549细胞与载药纳米微球共培养后的相对生长率，设置一系列载药纳米微球的浓度梯度，检验不同浓度下载药微球的抗癌活性。通过测量蓝紫色结晶甲瓒的吸光度值，然后通过公式计算得到细胞相对生长率，由此评价载药纳米微球的抗癌活性。

上述方法中，所述步骤s1中聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物如式(ⅰ)所示，

其中m为聚合度，4≤m≤2000；n为聚合度，2≤n≤1000

上述方法中，所述步骤s1中物理包埋疏水性药物为在水溶液中或亲水环境下低溶解度的任意活性药物，包括并不限于抗癌药物(如阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、喜树碱类或紫杉类药物)、止痛或抗炎药物(如吲哚美辛)、中枢神经系统药物、外周神经系统药物、循环系统药物、呼吸系统药物、消化系统药物、抗过敏药物和激素类药物。

细胞相容性：mtt法是检验细胞存活的一种方法。通过mtt实验来评价嵌段共聚物材料的体外细胞的毒性，方便快速地筛选生物医用材料^[129]。生物相容性实验中最通用的细胞系是l-929细胞。当静脉注射囊泡溶液时，需要评价其是否对血管内皮细胞产生毒性。当囊泡溶液进入血液后，最先接触的是血管内皮细胞。因此常选择l-929细胞来评价嵌段共聚物材料的细胞相容性。

采用mtt法评价载药微球和游离药物的抗癌活性。选取a549细胞进行实验，紫杉醇载药微球内药物浓度在0.025～50μg/ml之间。

上述方法中，所述步骤(1)中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙腈、乙醚、丙酮中的任意一种。

上述方法中，所述步骤(1)中油相中共聚物的浓度为1～50g/l，药物浓度为0.1～10g/l。

上述方法中，所述步骤(1)中搅拌速度为100～2000rpm，搅拌时间为10-30min。

上述方法中，步骤(2)中油水体积比为0.1～5。

上述方法中，步骤(2)中所述微射流匀质机中的容腔压力为40mpa～200mpa。

上述方法中，步骤(2)中所述微射流匀质机中的容腔由如下三种尺寸容腔中的两个复配得到：75μm、400μm和10mm。

上述方法中，步骤(2)中微射流匀质次数为2-5次。

上述方法中，步骤(3)中所述搅拌速度为100～2000rpm，搅拌时间为5～24h。

上述方法中，步骤(4)中高速冷冻离心得速率为15000～25000rpm，时间为8～20min。

上述方法中，步骤(4)中所述载药纳米微球粒径10～1000nm。

上述方法中，步骤(5)中，将盛有载药纳米微球溶液的透析袋放入含有30mlpbs溶液的离心管中，然后将离心管放入恒温水浴振荡箱中，振荡速率为100rpm，温度设置为37℃。

上述方法中，步骤s6、s7中，细胞相对活性由测试样品和阴性对照的od

值之比计算：

相对活性(％)＝(od实验组/od阴性对照)×100％

本发明的有益效果：

本发明采用新型peg-pbl两嵌段共聚物作为药物载体，载药微球具有优异的生物相容性，可获得稳定性药物缓释微球且缓释性能可调；以微射流为辅助手段，实现了peg-pbl载药微球粒径在以下1000nm的精确控制，且呈现很好的单分散状态。

通过细胞相容性评价，证明空白peg-pbl纳米微球的体外毒性较小，细胞相对活性在80％以上，说明该纳米微球具有不错的生物相容性。

通过抗癌细胞活性实验，证明peg-pbl载药纳米微球的抗癌活性较好，同时，对比游离药物的抗癌活性，其具有较明显的缓释效果。

附图说明

为更清晰地描述本发明实施例或技术方案，下面将对附图做简要介绍，以下图示仅为本发明实施例的部分图，本领域技术人员可根据提供附图获得其他附图。

图1为本发明实施例1中制备的载有阿霉素的peg-pbl载药微球的透射电镜照片。

图2为本发明实施例3中制备的载有紫杉醇的peg-pbl载药微球的透射电镜照片。

图3为本发明实施例3中制备的载有阿霉素的peg-pbl载药微球药物释放曲线。

图4为本发明实施例4中通过细胞相容性评价mtt法检验空白peg-pbl纳米微球的体外毒性，由公式计算出纳米微球与细胞共培养24h、48h和72h后测得的细胞活性柱状图。

图5为本发明实施例5中通过抗癌细胞活性实验检验不同浓度载药纳米微球的抗癌活性，以空白纳米微球和游离药物作为对照。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述方法思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包含在本发明的范围内。

实施例1、载阿霉素peg-pbl纳米微球的制备

称取100mgpeg-pbl(重均分子量为10000，共聚比例1:1)、20mg阿霉素，加入4ml二氯甲烷中，500rpm搅拌10min使peg-pbl和药物溶解，再向其中加入30ml去离子水，在100mpa压力下，将初乳液加入至微射流匀质机中，选择75μm和400μm流道加工，并反复匀质3次。100rpm搅拌12h使溶剂挥发，最后将载药微球悬液在4℃，20000rpm离心10min所得固体冷冻干燥除水后置于4℃保存。

所得peg-pbl和阿霉素的纳米载药微球，平均粒径为100nm，药物包封率为85％。

实施例2、载紫杉醇peg-pbl纳米微球的制备

称取150mgpeg-pbl(重均分子量为10000，共聚比例1:1)、20mg紫杉醇，加入4ml二氯甲烷中，800rpm搅拌10min使peg-pbl和药物溶解，再向其中加入30ml去离子水，在100mpa压力下，将初乳液加入至微射流匀质机中，选择75μm和400μm流道加工，并反复匀质3次。100rpm搅拌12h使溶剂挥发，最后将载药微球悬液在4℃，20000rpm离心10min所得固体冷冻干燥除水后置于4℃保存。所得peg-pbl和紫杉醇的纳米载药微球，平均粒径为100nm，药物包封率为90％。

实施例3、载紫杉醇peg-pbl纳米微球的制备

称取200mgpeg-pbl(重均分子量为15000，共聚比例1:2)、20mg紫杉醇，加入4ml二氯甲烷中，1000rpm搅拌10min使peg-pbl和药物溶解，再向其中加入30ml去离子水，在40mpa压力下，将初乳液加入至微射流匀质机中，选择75μm和400μm流道加工，并反复匀质3次。100rpm搅拌24h使溶剂挥发，最后将载药微球悬液在4℃，20000rpm离心15min所得固体冷冻干燥除水后置于4℃保存。

所得peg-pbl和紫杉醇的纳米载药微球，平均粒径为150nm，药物包封率为80％。

实施例4、细胞相容性

将对数生长期的l-929细胞用dmem培养基(10％小牛血清，100μg/ml青霉素，100μg/ml链霉素)稀释至1×10⁴细胞/ml的浓度，并在96孔板的每个小孔中添加100μl的细胞溶液。将细胞接种于37℃，含5％co2的co2培养箱中。24小时后，用100μl0.05，0.1，0.2，0.5和1mg/ml聚乙二醇-聚γ丁内酯两嵌段共聚物溶液或新鲜培养基替换原培养基，含有10％小牛血清。200μl新鲜培养基用作阴性对照，200μl苯酚水溶液用作阳性对照，24、48和72小时后，每个孔加入30μl的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt，5mg/ml)。经6小时孵育后除去所有培养基，并加入150μldmso。然后将板振荡10分钟。使用酶标仪在570nm下测量od值。所有实验平行进行三次。用以下等式由测试样品和阴性对照的od值之比计算细胞相对活性：

相对活性(％)＝(od实验组/od阴性对照)×100％

采用mtt法评价载药量为10％的载药胶束的体外细胞毒性。选取人肺癌细胞(a549细胞)，培养在含有10％小牛血清，100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基中。胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至1×10⁵个/ml。细胞悬液制备好后，将细胞以每孔100μl接种于96孔板中，然后置于37℃，含有5％co2的培养箱中。24h细胞贴壁后，将培养基替换为100μl新鲜培养基或含有药物浓度为0.025μg/ml，0.25μg/ml，2.5μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml的载药胶束溶液的dmem培养基。同时，评价了相同浓度的游离药物的细胞毒性。使用100μl新鲜培养基溶液作为阴性对照，100μl苯酚水溶液作为阳性对照。共培养72h后，移除培养基，加入20μl5mg/ml的mtt溶液。孵育5小时后，移除所有的培养基，加入150μl二甲基亚砜(dmso)。然后，将96孔板置于振荡器上振荡10min，使用酶标仪在570nm波长处测量吸光度值(od值)。细胞的相对生长率(rgr)由测试样品与阴性对照的平均od值的比值计算得到。