一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统的制作方法

本发明具体涉及一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统，属于生物医用高分子领域。

背景技术：

癌症是世界上最具破坏性的疾病，化疗是目前治愈癌症最广泛使用的治疗方法之一。但常规的癌症化疗，在高毒性的药物作用于全身造成强烈毒副作用的同时，肿瘤药的药效却随之大幅降低。事实上，强毒副作用与低化疗效果成为了癌症病人的主要死亡原因之一。

在过去的几十年里，靶向给药系统因选择性给药肿瘤组织而受到广泛关注。然而，靶向给药系统仍有一定的局限性，因为细胞毒性药物在到达受影响部位之前会释放出不需要的药物，因此，理想的靶向给药系统有望在全身循环过程中传递治疗药物而不会过早渗漏，被肿瘤细胞吸收后迅速释放负载药物。

现在，科研工作者根据肿瘤的特异性环境设计制备特异性载体。肿瘤微环境具有很多特征，分别为葡萄糖缺乏、ph值比正常组织细胞低、低的氧血症、高乳酸水平和血管异常等，这些是很多传统癌症治疗结果不佳的重要原因；当然，也可以根据肿瘤微环境的这种特异性，制备出能够特异性靶向和释放药物的药物载体系统，例如ph响应性载体、氧化还原响应性载体和k⁺响应性载体等，这样就很大程度上降低了药物的毒副作用，并且提高了药物的利用率，达到极好的治疗效果。但是这种特异性治疗也有一定的局限性，它不能检测体内肿瘤的生长情况，无法把握给药量的多少。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统，相比传统的载药材料，该药物载体系统具备优异的生物成像性能、具有更高效的肿瘤细胞靶向给药能力，可以实时监测，并有效的提高药物利用率。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统，首先以硅烷化碳点为核，生成包裹硅烷化碳点的介孔硅，之后在所述介孔硅表面修饰氨基，载入模型药物，再通过该氨基与(3-羧丙基)三苯基溴化膦反应以及纳米金封装介孔硅的孔道，得到纳米金封堵的药物载体系统。

按上述方案，所述硅烷化碳点以近红外光发射的碳点为基体进行硅烷偶联，得到硅烷化碳点。其中，近红外光发射的碳点(nir-cds)的粒径在3～8nm范围内，其最佳发射波长范围650～700nm。

按上述方案，所述包裹硅烷化碳点的介孔硅的粒径在30～80nm范围内，其孔径范围3～8nm。

按上述方案，所述纳米金的粒径为2～10nm，采用静电吸附作用封装介孔硅的孔道。

上述纳米金封堵的介孔硅药物控释系统的制备方法，主要步骤如下：

步骤一：制备硅烷化碳点(cds-ipts)

将近红外光发射的碳点(cds)溶于无水乙腈中，在氮气氛围下加入异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ipts)后，于20～80℃下搅拌7～15h，然后干燥后，得硅烷化碳点(cds-ipts)；

步骤二：制备包裹硅烷化碳点的介孔硅纳米颗粒(简称碳点介孔硅纳米颗粒，cds@msns)

将步骤一所得cds-ipts与少量去离子水、正硅酸四乙酯(teos)混合，得到混合溶液；将十六烷基三甲基氯化铵(ctac)和三乙胺(tea)溶于去离子水，边搅拌边升温至60～100℃，然后缓慢滴加所得混合溶液，于70～100℃冷凝回流0.5～4h；回流反应结束后，加入乙醇，经离心、清洗、冻干后，得到包裹硅烷化碳点的介孔硅纳米颗粒(cds@msns)；

步骤三：制备氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2)

将步骤二所得cds@msns溶于乙醇中超声分散后，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，40～70℃下冷凝回流12～48h，然后离心、洗涤、冻干，得到氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2)；

步骤四：制备接枝三苯基膦(tpp)的硅烷化碳点介孔硅(cds@msns-tpp)

将(3-羧丙基)三苯基溴化膦(ctpb)溶于去离子水中，用pbs缓冲液调节其ph至5～6，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羧基丁二酰亚胺(nhs)后，冰水浴下搅拌反应12～48h，即得活化后的ctpb溶液；

同时，将cds@msns-nh2溶于pbs缓冲液中超声分散，加入模型药物(如阿霉素dox)，20～40℃下搅拌24～48h，然后加入活化后的ctpb溶液，于10～50℃下避光搅拌12～48h，然后离心、清洗，冻干后，得到接枝三苯基膦(tpp)的碳点介孔硅(cds@msns-tpp)；

步骤五：制备纳米金封堵的介孔硅药物控释系统(cds@msns-tpp@aunps)

将步骤四所得cds@msns-tpp溶解于pbs溶液超声分散后，加入适量纳米金溶液，然后常温避光搅拌1～5h，离心、清洗、冻干后，得到纳米金封堵的介孔硅药物控释系统(cds@msns-tpp@aunps)。

进一步地，步骤一中，cds、乙腈与ipts的优选比例为(1～8)mg：(5～20)ml：(40～150)ul。

进一步地，步骤二中，步骤一所得cds-ipts与去离子水、正硅酸四乙酯(teos)混合的优选比例为(3～5)mg：(3～6)ml：(1～3)ml；十六烷基三甲基氯化铵(ctac)和三乙胺(tea)、去离子水之间的优选比例为(0.5～1.5)g：(150～300)ul：(10～50)ml；混合溶液的体积约占步骤二中总溶液体积的15％～30％。

进一步地，步骤三中，cds@msns在乙醇中的浓度范围为1～4mg/ml；cds@msns与aptes之间的比例优选为(100～400)mg：(1～3)ml。

进一步地，步骤四中，ctpb在去离子水中的浓度范围为0.8～2mg/ml；edc、nhs与ctpb的质量比为(0.4～1.2)：(0.3～1.5g)：(0.05～0.2)。

进一步地，步骤四中，cds@msns-nh2在pbs缓冲液中的浓度范围为1～5mg/ml；阿霉素与cds@msns-nh2的质量份数比为(1～2g)：(4～8)；活化后的ctpb溶液与cds@msns-nh2的pbs溶液的体积比为1:(2～4)。

进一步地，步骤五中，cds@msns-tpp在pbs溶液(ph为7.4)中浓度为0.5～10mg/ml；纳米金溶液与pbs溶液的体积比为(5～40)：(20～100)，其中纳米金溶液的浓度为(0.3～0.8)mg/ml；pbs溶液的ph为7.0～8.0。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

首先，本发明所述提供的介孔硅药物控释系统，以近红外光发射的碳点为基体制备硅烷化碳点；然后以该硅烷化碳点为核，生成包裹硅烷化碳点的介孔硅，再在其表面修饰氨基后与(3-羧丙基)三苯基溴化膦反应并采用纳米金封装介孔硅的孔道，得到基于荧光碳点生物成像的药物载体系统。

第二，该介孔硅药物控释系统，通过硅烷偶联剂将碳点保护起来以稳定发射近红外光，能够实现药物控释系统的荧光生物成像，利于实现实时监测肿瘤细胞的生长情况，方便有针对性的进行给药；再者，通过接枝具有线粒体靶向的三苯基膦(tpp)，可以实现药物在线粒体处有效聚积；还采用纳米金来封堵介孔硅孔洞，可以有效的消耗谷胱甘肽，同时纳米金的粒径会变小，从介孔硅表面脱落，释放出介孔硅内的药物。

基于以上构思，本发明所述提供的介孔硅药物控释系统可以通过自身负电荷适应肿瘤部位epr效应实现在肿瘤区域的有效富集，药物载体进入肿瘤细胞后，药物载体在三苯基膦的作用下于线粒体处富集，纳米金在肿瘤细胞酸性条件下与谷胱甘肽相互作用而脱落，从而释放出阿霉素，诱导肿瘤细胞凋亡，而中空介孔硅内的碳点可以用来实时监控肿瘤细胞的凋亡情况。

附图说明

图1为实施例所采用的cds的tem图；

图2为实施例所采用的cds的荧光图像；

图3为实施例1所采用的cds@msns的sem图；

图4为实施例2所采用的各步骤产物的傅里叶红外图；

图5为实施例3所采用的各步骤产物的荧光图像；

图6为实施例2所采用的各步骤的电位图；

图7为实施例2所采用的各步骤的bet图；

图8为实施例2所采用的各步骤的孔径分布图

图9为实施例1所采用的纳米金在gsh的影响下的粒径变化图；

图10位实施例1所采用的终载体在gsh的影响下的体外释药曲线图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，合成近红外碳点(cds)的步骤如下：

称取0.5～1.5g谷胱甘肽，15～20g甲酰胺，超声混合30min后加入到50ml聚四氟乙烯的内胆中，装入到50ml聚四氟乙烯的高压反应釜中，140～200℃下反应8～14h，待其自然冷却后，将上述产品用10～30ml去离子水稀释，然后用分子量为3500的透析袋透析2～7天，之后将产品用0.22微米的微孔膜过滤，最后将产品旋蒸后60℃下真空干燥8～14h，得到近红外发射的碳点。

下述实施例中，合成硅烷化碳点(cds-ipts)的步骤如下：

称取1～8mg碳点溶入5～20ml无水乙腈中，氮气氛围下加入40～150微升异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ipts)，20～80℃下搅拌7～15h，然后20～70℃真空干燥8～14h，得硅烷化碳点。

下述实施例中，合成包裹硅烷化碳点的介孔硅纳米颗粒(cds@msns)的步骤如下：

称取0.5～1.5g十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，量取150～300微升三乙胺(tea)，溶于10～50ml去离子水，边搅拌边升温至60～100℃，然后滴加3～5mgcds-ipts、3～6ml去离子水与1～3ml正硅酸四乙酯(teos)的混合溶液，在70～100℃冷凝回流0.5～4h，反应结束后加入100～200ml乙醇，然后离心使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

下述实施例中，合成氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2)的步骤如下：

称取100～400mgcds@msns溶于100～300ml乙醇中，超声分散后加入2～5ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，40～70℃下冷凝回流12～48h，然后离心使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

下述实施例中，合成接枝三苯基膦的碳点介孔硅(cds@msns-tpp)的步骤如下：

称取50～200mg(3-羧丙基)三苯基溴化膦(ctpb)溶于20～80ml去离子水中，用ph为7.4的pbs缓冲液调节其ph至5～6，加入0.4～1.2g1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，0.3～1.5gn-羧基丁二酰亚胺(nhs)，4℃(冰水浴)下搅拌12～48h，即得活化后的ctpb溶液；

称取200～400mgcds@msns-nh2溶于80～200mlph为8.0的pbs缓冲液中，超声分散后，加入50～100mgdox，20～40℃下搅拌24～48h，将上述活化后的ctpb溶液倒入其中，10～50℃下继续避光搅拌12～48h；然后离心使其沉淀，用去离子水和乙醇清洗，冻干后待用。

下述实施例中，纳米金的合成步骤如下：

配置1.2mm四氯金酸(haucl4)的水溶液待用；配置0.56mm柠檬酸三钠的水溶液待用；配置0.1m硼氢化钠(nabh4)的水溶液待用；量取0.6ml去离子水放入冰箱中冻成冰块；配置1.25mmgsh的pbs溶液，调节其ph至7.4，待用。

量取10ml1.2mmhaucl4的溶液与10ml0.56mm柠檬酸三钠的溶液混合，将0.6ml的冰块倒入其中，然后冰水浴下快速搅拌，快速搅拌的同时加入0.1mnabh4的溶液，搅拌1h。nabh4溶液加入到上述混合液中后，溶液迅速变为粉红色。该粉红色溶液即为纳米金溶液，经检测纳米金溶液的浓度为0.5mg/ml。

下述实施例中，合成纳米金封堵的介孔硅药物控释系统(cds@msns-tpp@aunps)的步骤如下：

称取50～200mgcds@msns-tpp溶解于20～100mlph为7.4的pbs溶液中，超声分散后，加入5～40ml纳米金溶液，常温避光搅拌1～5h，离心使其沉淀，用ph为7.4的pbs溶液清洗两次，冻干待用。

实施例1

一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统的制备方法，具体包括如下步骤：

1.制备近红外发射碳点纳米颗粒(cds)：

称取0.6g谷胱甘肽，19.4g甲酰胺，超声混合30min后加入到50ml聚四氟乙烯的内胆中，装入到50ml聚四氟乙烯的高压反应釜中，160℃下反应10h，待其自然冷却后，将上述产品用20ml去离子水稀释，然后用分子量为3500的透析袋透析两天，之后将产品用0.22微米的微孔膜过滤，最后将产品旋蒸后60℃下真空干燥12h，得到近红外发射的碳点。

由图1可知，该近红外碳点的粒径范围是3～5nm，分散均匀的纳米球。由图2可知，该近红外碳点(nir-cds)的最佳激发波长为420nm，最佳发射波长为680nm。

2.制备硅烷化碳点纳米颗粒(简称硅烷化碳点cds-ipts)：

称取上述近红外发射的3mg碳点溶入5ml无水乙腈中，氮气氛围下加入60微升异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ipts)，40℃下搅拌12h，然后40℃真空干燥12h，得硅烷化碳点cds-ipts；

上述步骤中注意：异氰酸丙基三乙氧基硅烷(ipts)极其活泼，可以与水进行反应，因此选用的溶剂乙腈一定要是无水级的，而且要在氮气氛围下进行反应(推荐在手套箱中进行该步反应)。

3.制备包裹硅烷化碳点的介孔硅纳米颗粒(cds@msns)：

将步骤2中制得的3.5mgcds-ipts溶于4ml去离子水后，与1.5ml正硅酸四乙酯(teos)超声混合，得到混合溶液；

另称取0.5g十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，量取180微升三乙胺(tea)，溶于20ml去离子水，边搅拌边升温至95℃，缓慢滴加前述混合溶液，95℃冷凝回流1h；反应结束后加入100ml乙醇，然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

由图3可知，所合成的cds@msns的粒径在100nm左右，尺寸分布均匀，分散性好。

4.制备氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2):

称取200mgcds@msns溶于100ml乙醇中，超声分散后加入2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，50℃下冷凝回流24h，然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

5.制备接枝三苯基膦(tpp)的碳点介孔硅(cds@msns-tpp):

称取50mg(3-羧丙基)三苯基溴化膦(ctpb)溶于30ml去离子水中，用ph为7.4的pbs缓冲液调节其ph至5～6，加入0.7175g1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，0.4315gn-羧基丁二酰亚胺(nhs)，4℃(冰水浴)下搅拌24h，即得活化后的ctpb溶液。

称取200mgcds@msns-nh2溶于100mlph为8.0的pbs缓冲液中，超声分散，加入80mgdox，25℃下搅拌24h，将上述活化后的ctpb溶液倒入其中，35℃下继续搅拌24h。然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用ph为7.4的pbs缓冲溶液清洗，冻干后，得cds@msns-tpp，待用。

由图4可知，氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2)和接枝三苯基膦(tpp)的碳点介孔硅(cds@msns-tpp)的成功合成。

6.制备纳米金封堵的介孔硅药物控释系统(cds@msns-tpp@aunps):

称取80mgcds@msns-tpp溶解于30mlph为7.4的pbs溶液中，超声分散后，加入4ml0.5mg/ml纳米金溶液，常温避光搅拌1h，离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用ph为7.4的pbs溶液清洗两次，冻干待用。

由图6可知，每一步骤的电位发生变化，说明各步骤产物接枝成功。

实施例2

一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统的制备方法，具体包括如下步骤：

1.制备近红外发射碳点纳米颗粒(cds)：与实施例1相同；

2.制备硅烷化碳点纳米颗粒(cds-ipts)：与实施例1相同；

3.制备包裹碳点的介孔硅纳米颗粒(cds@msns)：

将步骤2中制得的3.5mgcds-ipts溶于4ml去离子水后，与1.5ml正硅酸四乙酯(teos)超声混合，得到混合溶液；

另称取0.5g十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，量取180微升三乙胺(tea)，溶于20ml去离子水，边搅拌边升温至80℃，缓慢滴加前述混合溶液，80℃冷凝回流1h，反应结束后加入100ml乙醇，然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

4.制备氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2):

称取200mgcds@msns溶于100ml乙醇中，超声分散后加入1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，50℃下冷凝回流24h，然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

5.制备接枝三苯基膦(tpp)的碳点介孔硅(cds@msns-tpp):

称取50mg(3-羧丙基)三苯基溴化膦(ctpb)溶于30ml去离子水中，用ph为7.4的pbs缓冲液调节其ph至5～6，加入0.7175g1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，0.4315gn-羧基丁二酰亚胺(nhs)，4℃(冰水浴)下搅拌36h，即得活化后的ctpb溶液。

称取200mgcds@msns-nh2溶于100mlph为8.0的pbs缓冲液中，超声分散，加入80mgdox，25℃下搅拌24h，将上述活化后的ctpb溶液倒入其中，35℃下继续搅拌12h；然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇清洗，冻干后，得cds@msns-tpp，待用。

由图7可知，本实施例制备的cds@msns的bet达到900cm³g^-1，回滞环说明其是中空结构；由图7和图8可知，cdsmsns-nh2和cds@msns-tpp的bet依次降低、孔径依次减小，进一步说明氨基和三苯基膦的接枝成功。

6.制备纳米金封堵的介孔硅药物控释系统(cds@msns-tpp@aunps):与实施例1相同。

实施例3

一种纳米金封堵的介孔硅药物控释系统的制备方法，具体包括如下步骤

1.制备近红外发射碳点纳米颗粒(cds)：与实施例1相同；

2.制备硅烷化碳点纳米颗粒(cds-ipts)：与实施例1相同；

3.制备包裹碳点的介孔硅纳米颗粒(cds@msns)：与实施例2相同；

4.制备氨基功能化的碳点介孔硅纳米颗粒(cds@msns-nh2):

称取200mgcds@msns溶于100ml乙醇中，超声分散后加入1.8ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，50℃下冷凝回流12h，然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇反复清洗三次，冻干后待用。

5.制备接枝三苯基膦(tpp)的碳点介孔硅(cds@msns-tpp):

称取50mg(3-羧丙基)三苯基溴化膦(ctpb)溶于30ml去离子水中，用ph为7.4的pbs缓冲液调节其ph至5～6，加入0.7175g1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，0.4315gn-羧基丁二酰亚胺(nhs)，4℃(冰水浴)下搅拌12h，即得活化后的ctpb溶液。

称取200mgcds@msns-nh2溶于100mlph为8.0的pbs缓冲液中，超声分散，加入80mgdox，25℃下搅拌24h，将上述活化后的ctpb溶液倒入其中，35℃下继续搅拌16h。然后离心(10000rpm/min×10min)使其沉淀，用去离子水和乙醇清洗，冻干后，得cds@msns-tpp待用。

6.制备纳米金封堵的介孔硅药物控释系统(cds@msns-tpp@aunps):与实施例1相同。

由图5可知，cds@msns的荧光曲线相对于cds的荧光曲线发生了一定程度的红移，这是因为cds所处的微环境发生变化，极性增强，疏水性降低，使得荧光曲线发生红移；cds@msns-nh2又出现蓝移且荧光增强，这是因为-nh2在紫外可见光区有吸收并伴随cds@msn-nh2本身电子能级的跃迁使得cds@msns-nh2出现蓝移，其荧光增强是因为产生了p-π共轭作用，一定程度上增强了π电子的共轭；cds@msns-tpp和cds@msns-tpp@aunps荧光强度逐渐减弱，这是因为同样质量浓度的各步骤产物中，它所含有的cds的比例逐步降低，使得其荧光强度有所减弱。因此，本发明所述介孔硅药物控释系统具有实现荧光生物成像的性质，可以用来监测肿瘤细胞的生长情况，有利于有针对性的进行给药。

应用测试

1.谷胱甘肽对纳米金封堵孔洞的影响：

将1ml0.5mg/ml的纳米金溶液与1ml1.25mmgsh的pbs溶液混合，常温下搅拌2h，测试其粒径。由图9可知，金纳米在谷胱甘肽的溶液中，其粒径会变小，这使得纳米金封堵后的载体可以在肿瘤细胞成功脱落纳米金，达到药物的成功释放。

2.谷胱甘肽浓度对药物释放的影响：

体外药物释放实验分别在三种不同gsh浓度(0mm，1.25mm，10mm)的pbs缓冲溶液(ph均为7.4)中进行。首先各称取实施例1制备的10mgcds@msns-tpp@aunps分散在对应的三种缓冲溶液中，然后快速地转移到分子量3500的透析袋中并分别直接将透析袋浸入装有35ml0mmgsh，1.25mmgsh，10mmgsh的三种pbs缓冲溶液中(透析袋内和透析袋外的gsh浓度一样)，放在37℃恒温摇床震荡120h。设定时间间隔并从其中分别取出5ml缓冲溶液，然后对应的补加5ml缓冲溶液使得离心管内溶液体积保持恒定。用紫外分光光度计测定每个时间间隔取出液，记录493nm处溶液的吸光度，并用dox在hf中的标准曲线计算出其浓度。

由图10可知，本发明提供的介孔硅药物控释系统在10mmgsh的缓冲液中可以释放大量的药物，而在0mmgsh和1.25mmgsh中药物的释放率接近20％，这说明本发明提供的纳米金封堵效果很好，由图9和图10可知，纳米金在谷胱甘肽溶液中会被消耗，使得其粒径变小，从而在介孔硅表面脱落，释放出介孔硅里面的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。