本发明涉及生物医药
技术领域：
：，特别涉及脐带血间充质干细胞组合物在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用。
背景技术：
：：慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种常见的气流受限性呼吸系统疾病，其气流受限通常呈进行性发展，伴有吸入有害气体或颗粒后形成的慢性气道炎症反应。慢性阻塞性肺疾病主要特征是肺结构破坏，这与炎症反应、肺泡上皮细胞凋亡、内皮功能障碍、蛋白酶和抗蛋白酶失衡等有关。目前慢性阻塞性肺疾病的主要治疗方式是药物治疗，但并不能有效地阻止症状持续恶化和肺功能进行性下降，因此需要探索新的治疗药物。技术实现要素：本发明的主要目的是提供脐带血间充质干细胞组合物在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用，旨在减轻慢性阻塞性肺疾病肺内炎症，减轻或逆转慢性阻塞性肺疾病的病理改变。为实现上述目的，本发明提供脐带血间充质干细胞组合物在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用，包括以下技术方案：所述的脐带血间充质干细胞组合物包括脐带血间充质干细胞和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)。优选地，所述的脐带血间充质干细胞通过白细胞介素10和白细胞介素4的表达减轻慢性阻塞性肺疾病肺内炎症。优选地，所述的白细胞介素10能够抑制t辅助1(th1)细胞产生促炎细胞因子。优选地，所述的白细胞介素4在b细胞对ige合成的2型t-helper应答和同型class开关中起作用。优选地，所述的脐带血间充质干细胞组合物的制备方法为：s1：采用密度梯度离心-贴壁培养法培养脐带血间充质干细胞；s2：采用cm-dil标记脐带血间充质干细胞；s3：采用脂质体转染试剂，将bfgf-pcdna3.1质粒转染脐带血间充质干细胞。优选地，脐带血间充质干细胞组合物经尾静脉注入慢性阻塞性肺疾病大鼠体内。本发明的有益效果：一、携带碱性成纤维细胞生长因子基因的脐带血间充质干细胞组合物经尾静脉注入慢性阻塞性肺疾病大鼠体内可减轻病理改变，增强抗炎效果；通过抑制肺泡巨噬细胞cox-2/pge2，部分通过p38mapk和erk通路介导，减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症和肺气肿，同时可以通过促进内源性肺干细胞的增殖，减轻慢性阻塞性肺疾病模型肺损伤，减少肺泡壁凋亡；而且，移植入肺内的脐带血间充质干细胞可以分泌一种重要的上皮生长因子，滞留在肺内的骨髓间充质干细胞可能分化成肺泡上皮细胞并以旁分泌的方式调节其他肺泡上皮细胞；二、脐带血间充质干细胞通过提高抗炎因子白细胞介素10、白细胞介素4的表达，减轻慢性阻塞性肺疾病肺内炎症；在肺内分化成肺泡上皮细胞或支气管上皮细胞，减轻或逆转慢性阻塞性肺疾病的病理改变。附图说明图1：流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面标记物的表达；图2：空质粒及碱性成纤维细胞生长因子质粒转染脐带血间充质干细胞(×40)；图3：各组大鼠第28天的肺组织苏木精-伊红染色(×10)；图4：qrt-pcr检测各组大鼠肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4mrna的表达；图5：脐带血间充质干细胞组cm-dil和cc16双标细胞(×40)；图6：脐带血间充质干细胞组cm-dil和spc双标细胞(×40)；图7：pcdna3.1-bmscs组cm-dil和cc16双标细胞(×40)；图8：：pcdna3.1-bmscs组cm-dil和spc双标细胞(×40)；图9：bfgf-pcdna3.1-bmscs组cm-dil和cc16双标细胞(×40)；图10：bfgf-pcdna3.1-bmscs组cm-dil和spc双标细胞(×40)。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。在本发明实施例中，该脐带血间充质干细胞组合物在治疗慢性阻塞性肺疾病中的应用，包括以下方案：脐带血间充质干细胞的分离、培养、鉴定与碱性成纤维细胞生长因子基因转染：取6周龄健康sd大鼠，采用密度梯度离心-贴壁培养法提纯大鼠脐带血间充质干细胞，接种于塑料培养皿，使用含体积分数为10％胎牛血清的dmem-lg培养基，在37℃、体积分数为5％co2、100％饱和湿度条件下培养，每3d或4d按1∶3传代，流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面标志物表达，并用cm-dil标记。当脐带血间充质干细胞覆盖率达90％左右时，按0.5μl/cm2加入lipofectamine2000，按1μg/cm2加入bfgf-pcdna3.1质粒，于原培养箱孵育6h，弃去旧培养基，加入完全培养基，放入原培养箱相同条件培养24h；通过荧光显微镜观察可见绿色荧光，则证实碱性成纤维细胞生长因子转染成功，用g418筛选稳转细胞，稳定转染24h内移植。慢性阻塞性肺疾病大鼠模型制备及实验分组：选取健康2月龄sd大鼠150只，雌雄不限，体质量200-230g，随机取30只大鼠为正常对照组，其余120只大鼠采用脂多糖联合熏烟的复合刺激法制备成慢性阻塞性肺疾病模型。慢性阻塞性肺疾病模型制备：第1天、第14天经气管内注入脂多糖(200μg/次)，第2-30天(除外第14天)将大鼠放入特制的烟箱内(50cm×40cm×40cm，侧壁有两烟孔)，注入庐山牌香烟(焦油含量13mg，尼古丁含量1.2mg，江西南昌卷烟厂)烟雾，2次/d，每次40min(每次8支烟，分4次燃，每次烟燃尽约需9min，换烟30s)，为期1个月。实验分组：将制成的慢性阻塞性肺疾病大鼠随机分为4组：慢性阻塞性肺疾病组、bmscs组、pcdna3.1-bmscs组、bfgf-pcdna3.1-bmscs组，每组30只。上述分组后(包括正常对照组)立即进行下列干预，期间正常喂养。正常对照组：健康sd大鼠经尾静脉注射1mlpbs；慢性阻塞性肺疾病组：模型大鼠经尾静脉注射1mlpbs；bmscs组：模型大鼠尾经静脉注射cm-dil标记的第3代脐带血间充质干细胞1×107/1mlpbs；pcdna3.1-bmscs组：模型大鼠经尾静脉注射cm-dil标记的转染pcdna3.1质粒的第3代脐带血间充质干细胞1×107/1mlpbs；bfgf-pcdna3.1-bmscs组：模型大鼠经尾静脉注射cm-dil标记的转染bfgf-pcdna3.1质粒的第3代脐带血间充质干细胞1×107/1mlpbs。留取标本：各组在干预7，14，28d后各处死10只大鼠。①留取部分右肺中叶，经体积分数为10％甲醛溶液固定后，制备石蜡切片，切片约4μm厚度，行苏木精-伊红染色；②留取部分右肺中叶-80℃冰箱保存，用于qrt-pcr实验检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4的表达；③留取外周血，以2500r/min离心10min，取上层淡黄色血清，保存于-80℃冰箱，用于elisa实验检测外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平；④取部分右肺中叶，制备新鲜冰冻切片，切片约5μm，在荧光显微镜下观察冰冻切片cm-dil染色阳性细胞分布情况，选择cm-dil阳性细胞较多的切片进行免疫荧光染色，观察脐带血间充质干细胞在肺组织中的分化情况。肺组织白细胞介素10、白细胞介素4mrna的表达：取右肺中叶，匀浆研磨后，通过qrt-pcr法检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4的表达，反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃延伸30s，循环40次，得到产物即cdna，-20℃保存。内参β-actin引物f：5'-agcgagcatcccccaagtt-3'，r：5'-gggcacgaaggctacatcatt-3'，扩增产物大小为101bp；白细胞介素10引物f：5'-aagggttacttgggttgcca-3'，r：5'-agacacctttgtcttggagctt-3′，扩增产物大小为241bp；白细胞介素4引物f：5'-tctgtagaggtgtcagcggt-3'，r：5'-agtgttgtgagcgtggactc-3'，扩增产物大小为70bp。采用2-δδct法计算各实验组相对于正常对照组基因表达的相对倍数。脐带血间充质干细胞在肺组织中的分化：cm-dil阳性细胞较多的新鲜冰冻切片经一抗(兔抗鼠spc和cc16多抗1∶200稀释)4℃孵育过夜，37℃复温孵育30min；经二抗(羊抗兔fifc1∶200稀释)37℃孵育40min，观察同一视野下双染色细胞个数。主要观察指标①各实验组肺组织病理改变；②qrt-pcr实验检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4mrna的表达；③elisa实验检测外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平；④在荧光显微镜下观察冰冻切片cm-dil染色阳性细胞分布情况；⑤脐带血间充质干细胞在肺组织中的分化情况。统计学分析实验中涉及到计量资料用x±s表示，采用ssps17.0软件进行统计学分析，检验水平为α＝0.05。样本均数间的多重比较，方差行f检验判断方差齐性，方差齐性检验合格时用lsd-t检验，方差不齐时采用秩和检验，p<0.05为有差异有显著性意义，p<0.01为差异有非常显著性意义。脐带血间充质干细胞的形态、鉴定和标记、转染结果：原代脐带血间充质干细胞为典型的纺锤形、梭形或三角形，局部可见小集落形成。提取、培养的第4代细胞经流式细胞术检测显示cd29、cd44高表达，而基本不表达造血干细胞的标记cd34、cd45，见图1。碱性成纤维细胞生长因子质粒转染脐带血间充质干细胞24-48h，在荧光显微镜下观察可见部分细胞呈绿色荧光，提示质粒成功转染，见图2(图中a、c为第四代脐带血间充质干细胞；b为碱性成纤维细胞生长因子质粒转染脐带血间充质干细胞，在荧光显微镜下观察可见部分细胞呈绿色荧光，提示质粒成功转染；d为空质粒转染脐带血间充质干细胞，未见绿色荧光)。对照组未见绿色荧光。肺组织病理学改变：参照图3(图中，a为正常对照组；b为慢性阻塞性肺疾病组；c为bmscs组；d为pcdna3.1-bmscs组；e为bfgf-pcdna3.1-bmscs组)；各实验组分别在干预第28天留取部分右肺中叶进行病理苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察病理改变，慢性阻塞性肺疾病组病理改变相对于正常对照组：肺泡腔不规则扩大，可见部分肺间隔断裂，数个肺泡融合成一个肺大疱；支气管、肺间质血管周围可见炎症细胞浸润，见图3b，符合典型慢性阻塞性肺疾病的病理改变。bmscs组、pcdna3.1-bmscs组、bfgf-pcdna3.1-bmscs组：均有典型的慢性阻塞性肺疾病病理改变。在相同视野下，肺泡腔不规则扩大，可见部分肺泡间隔断裂，肺大疱形成，气管管壁及肺间质血管管壁有少数炎性细胞浸润。bmscs组、pcdna3.1-bmscs组之间无明显差异；与bmscs组、pcdna3.1-bmscs组比较，bfgf-pcdna3.1-bmscs组病变较轻，见图3c-e。各组大鼠外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平：各组在干预第7，14，28天留取外周血，通过双抗夹心elisa法检测外周血中自细胞介素10、白细胞介素4水平，结果显示：在相同时间节点，3个治疗组外周血中自细胞介素10、白细胞介素4水平高于慢性阻塞性肺疾病组(均p＜0.01)，bmscs组、pcdna3.1-bmscs组外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平差别不大，但bfgf-pcdna3.1-bmscs组较之二者相对较高，差异有显著性意义(均p＜0.05)，见表1。表1各组大鼠外周血中白细胞介素10、白细胞介素4水平table1levelsofinterleukin-10andinterleukin-4inratpenpheralblood表注：在相同时间点，与慢性阻塞性肺疾病组比较，ap＜0.05：与骨髓间充质干细胞组比较，bp＜0.05。bmscs：骨髓间充质干细胞：bfgf：碱性成纤维细胞生长因子。各组大鼠肺组织中自细胞介素10、白细胞介素4mrna的表达：各组分别在干预第7，14，28天留取部分右肺中叶，匀浆研磨后通过qrt-pcr检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4mrna表达。在相同时间节点，3个治疗组肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4表达高于慢性阻塞性肺疾病组(均p<0.01)，bmscs组、pcdna3.1-bmscs组肺组织中的白细胞介素10、白细胞介素4表达差别不大，但bfgf-pcdna3.1-bmscs组较之二者相对较高，差异有显著性意义(均p<0.05)，见图4。脐带血间充质干细胞在肺组织中的分化：各实验组分别在干预第28天留取部分右肺中叶进行新鲜冰冻切片，在荧光显微镜下观察cm-dil染色阳性细胞分布情况，选择cm-dil阳性细胞较多的切片进行免疫荧光染色，观察脐带血间充质干细胞在肺组织中分化情况。荧光显微镜下3个治疗组的肺组织切片中均有少数橙红色荧光的细胞，同时显淡绿色荧光(cm-dil和spc/cc16双染色标记)，见图5-10(图5：a为cm-dil染色为橙红色荧光、b为cc16-fifc染色为淡绿色荧光；图6：a为cm-dil染色为橙红色荧光、b为spc-fifc染色为淡绿色荧光；图7：a为cm-dil染色为红色荧光、b为cc16-fifc染色为绿色荧光；图8：a为cm-dil染色为红色荧光、b为spc-fifc染色为绿色荧光；图9：a为cm-dil染色为橙红色荧光、b为cc16-fifc染色为淡绿色荧光；图10：a为cm-dil染色为橙红色荧光、b为spc-fifc染色为淡绿色荧光)。肺泡壁有少量显橙红色荧光的细胞(cm-dil标记)，同时显淡绿色荧光(spc-fifc标记)，支气管壁有少量显橙红色荧光的细胞(cm-dil标记)，同时显淡绿色荧光(cc16-fifc标记)，相对于bmscs组、pcdna3.1-bmscs组，bfgf-pcdna3.1-bmscs组可发现双染的阳性细胞较多。以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的
技术领域：
：均包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3