FOXM1基因抑制剂在骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地，涉及foxm1基因抑制剂在骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎中的应用。

背景技术：

骨性关节炎是关节软骨退行性变的一类疾病，在我国中老年患者中常见，它的发生严重影响了我国中老年患者的生活治疗，被称为“不死的癌症”。其按照病因分为原发性和继发性骨关节炎，其中原发性骨关节炎病因不明，可能与职业过度消耗、肥胖等因素相关；继发性骨关节炎与青年时外伤、炎症反应、代谢异常和神经缺陷等病因有关。临床上主要表现为疼痛、压痛、肿胀及关节变形等症状，发生这些症状后等待患者往往只有是外科关节置换手术这一条出路。

骨髓间充质干细胞是临床治疗骨关节炎的一条新思路，因为干细胞所具有的多能性，即其具有成软骨、成骨及抗炎等作用。国内外已经开始批量批准骨髓间充质干细胞进入临床治疗骨关节炎，然而在基础科研方面骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的分子机制还不甚明了。并且，研究发现根据患者病情的好坏，需要增加干细胞的疗效。但是，一味的增加干细胞浓度不会明显增强疗效，同时也会发生免疫排斥等副反应。因此，寻找一种在有限的干细胞浓度情况下，增强干细胞对骨关节炎疗效的方法势在必行。

forkheadboxm1(foxm1)是转录因子叉头框超家族的一员，是一种调控细胞周期和蛋白增值转录因子，目前针对于foxm1的研究主要集中在肿瘤领域。研究发现，foxm1与干细胞的自我更新、稳定及衰老高度相关，并且可以影响间充质干细胞的促血管新生及促成骨功能。但是，foxm1是否参与了骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎这个过程目前尚未有人报道，并且foxm1是否可以促进软骨新生与分化也尚未得知。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供foxm1基因抑制剂在骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种骨髓间充质干细胞的制备方法。

本发明的第二个目的是提供间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供foxm1基因抑制剂和/或foxm1蛋白抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供foxm1基因抑制剂和/或foxm1蛋白抑制剂作为在间充质干细胞治疗骨关节炎的增强剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供foxm1基因和/或foxm1蛋白在作为筛选间充质干细胞治疗骨关节炎疗效的增强剂的靶点中的应用。

本发明的第六个目的是提供foxm1基因和/或foxm1蛋白在作为治疗骨关节炎的治疗靶点的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明首次确定了foxm1基因的表达和在骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎中的作用：1、骨髓间充质干细胞可以正常成骨、成脂及成软骨；2、骨髓间充质干细胞可以有效的增强兔子关节炎后的关节软骨再生；3、通过提取损伤部分的软骨mrna发现foxm1差异性表达，同时软骨相关基因与炎症因子相关基因也同步发生表达；4、在体外用foxm1的sirna进行干扰，发现干扰foxm1可以有效提高软骨细胞增殖、软骨细胞分裂指数及软骨细胞数量；5、干扰foxm1后炎症相关因子的mrna表达水平明显下降。

由此可以知道提取的骨髓间充质干细胞质量可靠，并可以良好的促进关节炎后的软骨修复；foxm1与软骨标志物高度相关，且差异性表达；体外干预foxm1发现软骨细胞分化加速，并且有良好的抗炎效果。因此，干扰foxm1可有效增强骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的疗效，为提高在有限干细胞细胞浓度治疗骨关节炎的疗效提供一条新的基础科研思路与临床可行性。

因此本发明要求保护一种骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

s1.抽取骨髓，用无血清imdm培养基冲洗、离心、重悬；

s2.与等体积percoll液充分混合，离心吸取中间白粉色的絮状物；

s3.用无血清imdm培养基洗涤，加15％胎牛血清的imdm培养基进行培养；

s4.细胞贴壁后，用15％胎牛血清的imdm培养基进行首次换液，之后每3天换液一次，使用10％胎牛血清的imdm培养基；

s5.细胞长满瓶底进行传代培养。

优选地，抽取髌骨骨髓。

本发明还要求保护以下内容：

间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的制剂中的应用。

foxm1基因抑制剂和/或foxm1蛋白抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，优选地，所述药物还含有药学上可接受的辅料。

foxm1基因抑制剂和/或foxm1蛋白抑制剂作为在间充质干细胞治疗骨关节炎的增强剂中的应用。

所述治疗骨关节炎为：关节软骨的增殖增多、分裂指数增大、细胞计数增加及相关炎症因子减少中的一种或几种。

优选地，所述foxm1基因抑制剂为sirna。

优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。

更优选地，所述间充质干细胞为以所述制备方法制备得到的。

进一步，本发明还要求保护：

foxm1基因和/或foxm1蛋白在作为筛选间充质干细胞治疗骨关节炎疗效的增强剂的靶点中的应用；

foxm1基因和/或foxm1蛋白在作为治疗骨关节炎的治疗靶点的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次确定了foxm1在骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎中的作用，抑制foxm1后软骨细胞分化加速，并且有良好的抗炎效果，可有效增强骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的疗效，为提高在有限干细胞细胞浓度治疗骨关节炎的疗效提供一条新的基础科研思路与临床可行性。因此，其可以作为药物靶点或基因治疗中的靶基因开发新型药物或生物制剂。这有望为骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎提高疗效，减少其副作用。同时也将为foxm1在骨关节炎中的基础研究及临床应用提供新的策略与方向。

附图说明

图1为从左向右依次为骨髓间充质干细胞明场、成软骨、成骨以及成脂图片。

图2为骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎疗效的检测图；a为alct模型ct检测图片；b为aclt模型墨汁染色检测图片；c为ci模型大体检测图片。

图3为骨关节炎关键因子表达情况。

图4为在兔原代软骨细胞中检测foxm1与软骨修复的关系；a图为软骨细胞ki67荧光染色及统计学图片；b为软骨细胞随时间细胞数量变化图片；c为软骨细胞的分裂指数图片。

图5为foxm1干预后，用q-pcr检测骨关节炎相关炎症因子表达情况；a图为il-6的mrna含量；b图为tnf-α的mrna含量；c图为il-1的mrna含量；d图为il-1β含量。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实验所用动物及饲养

实验用大白兔背景为新西兰大白兔，由广东省实验动物中心提供。本发明所用的实验动物均在中山大学疾病模式动物中心进行饲养。在关节炎模型制造中，兔子性别均为雌性且均为18月龄。动物饲养期间自由饮水摄食，每12小时交替照明，温度21±2℃，湿度40％～70％。

实施例1新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞的提取

一、实验方法

提取大白兔骨髓间充质干细胞：无菌条件下，抽取周龄4周以下并且体重0.5kg左右的新西兰大白兔的髂骨的骨髓5ml。后用无血清imdm冲洗至离心管中，再用无血清imdm冲洗其表面(用量约4ml)，至终体积约15ml，离心1000r/min5min，弃上清，用3ml无血清imdm重悬，加入另一含有3mlpercoll液的离心管内，此时将两管液体充分吹打混合、离心1000r/min30min，吸取中间白粉色的絮状物(以往仅吸取乳白色单个核细胞层)，用无血清imdm洗2次，每次10ml液体1000r/min10min离心，弃上清，再加15％胎牛血清的imdm15ml，接种至25cm²塑料培养瓶中。细胞以1×10⁶/ml接种于25cm²塑料培养瓶中后置于37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养，24h可见细胞贴壁，此时首次换液(培养液为15％胎牛血清的imdm)，然后每3d换液1次(培养液为10％胎牛血清的imdm)。约7d细胞长满瓶底，此时进行传代培养，传代用0.25％胰蛋白酶消化5min，胎牛血清终止消化，按此法反复传代培养增殖。

将上述提取的大白兔骨髓间充质干细胞，用成骨诱导培养基(赛业公司)诱导3周后，用茜素红染色；用成软骨培养基(赛业公司)诱导3周后，用阿利辛蓝染色；用成脂培养基(赛业公司)诱导3周后，用油红o染色。

二、实验结果

茜素红染色证明干细胞存在良好的成骨能力；阿利辛蓝染色证明干细胞存在良好的成软骨能力；油红o染色证明干细胞存在良好的成脂能力。结果如图1所示，提取的兔骨髓间充质干细胞具有良好的分化能力，可以用于下一步应用试验。

实施例2骨髓间充质干细胞对骨关节炎治疗的疗效

一、实验方法

1、动物关节炎模型造模的构建方式

采用18月龄雌性新西兰大白兔制造双腿骨关节炎模型，共25只。骨关节炎模型是先采用较符合骨关节炎病程的经典的前后交叉韧带切除模型(aclt)，此模型20只；后采用较容易观察软骨修复的骨关节炎模型，即关节软骨钻孔模型(ci)，此模型5只。此两种模型均需先用丙泊酚诱导麻醉，而后用异氟醚维持麻醉，切皮时再用利多卡因局部麻醉，从而保证手术顺利进行，也维护了动物伦理。之后分别进行aclt和ci的造模。

aclt：膝关节外侧切开皮肤并剥离肌肉，直视下发现前交叉韧带，切断后发现后交叉韧带，再切断后交叉韧带。关节腔用生理盐水冲洗并缝合。

ci：同aclt切开结缔组织进入关节腔，直视下观察到股骨内外侧髁附近非承重区，用直径5mm的钻头进行垂直钻孔，注意只钻通软骨侧，不破坏骨质即不出血。

造模手术后关节包扎制动并换药，常规抗生素支持7天。

2、干细胞的注射治疗

造模手术8周后，观察兔子关节变形及疼痛等情况，并进行ct检测，符合关节炎条件的造模动物进行干细胞关节腔注射：兔子左腿进行干细胞关节腔注射(干细胞治疗组)，右腿进行无干细胞的pbs注射(单纯损伤组)，干细胞的注射量为：3×10⁶/ml，注射1ml。注射后4周再以相同条件注射一次，再饲养4周后。

3、取材及检测

骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎8周后(第一次注射4周后，再注射一次4周后)进行ct检测膝关节关节面扫描，观察骨缺损及畸形等情况(仅aclt模型)；ct扫描后，空气栓塞处死兔子，并取膝关节。

aclt模型取材后把关节面浸入墨汁中2分钟(5只)，然后拿出来在pbs里洗3遍(一遍5分钟)，最后明场拍照(此方法为墨汁染色)。即有墨汁残留的地方为还未修复的损伤区；为了更明显的观察软骨的修复情况，进行了ci模型检测，ci模型只进行明场拍摄关节面即可。

二、实验结果

结果显示，关节炎模型无干细胞的pbs注射关节腔的兔子右膝关节的ct扫描，存在结构模糊，关节两侧有骨赘生成，关节力线改变，关节面有大量骨缺损等情况。在图2的aclt墨汁染色中，与单纯损伤组相比，干细胞治疗组的黑色染色区域(即损伤区)减少。在ci模型中，与损伤组相比，干细胞治疗组的损伤区域覆盖了一层白色的再生的软骨，而损伤组则没有。ci模型侧面观可发现，bmsc组相比于ci组，关节两侧没有发现明显的骨赘形成。结果表明，骨髓间充质干细胞可以有效促进骨关节炎的软骨修复。

实施例3骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎关键因子的检测

一、实验方法

干细胞关节腔第一次注射8周后(干细胞治疗组和单纯损伤组)，取关节面软骨细胞(共15只)，提取方法为：取骨关节炎造模成功大白兔，空气栓塞处死后，取膝关节并用活力碘或75％酒精浸泡，带入超净台。打开用一次性换药碗或者护理包，将无菌巾铺在超净台里，投入无菌器具。无菌打开关节囊，止血钳夹下股骨头软骨帽，无菌盐水清洗后置于无菌安培瓶。眼科剪剪碎软骨，之后用10倍体积以上0.5％的2型胶原酶消化6～12h，离心即可获得细胞，如有组织块，并不影响细胞培养，因为组织块里面也会爬出细胞。

提取关节面软骨细胞mrna后，分析foxm1基因等相关在干细胞治疗组和单纯损伤组的表达情况。

二、实验结果

结果如图3显示，foxm1基因在损伤组和治疗组中差异性表达，并且软骨相关基因与foxm1呈负相关表达，炎症因子与其呈正相关表达，最后与细胞周期相关因子呈负相关关系。结果提示，foxm1可能与骨髓间充质干细胞治疗关节炎中的的炎症反应、细胞周期及软骨修复有关。

实施例4兔原代软骨细胞中检测foxm1与软骨修复的关系

一、实验方法

将实施例3制备的原代软骨细胞，并用实施例1制备的骨髓间充质干细胞与原代软骨细胞共培养，细胞比例大概是干细胞比软骨细胞为5：1。随后用foxm1-sirna(sata，sc-43769)进行干预抑制，具体操作方式按照产品说明书进行，干预成功的为干扰组，未进行干扰的为对照组。

eud是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时能够有效的插入正在复制的dna分子中，即表达在核上。因此，edu染色可以有效快速的检测细胞增殖，即可有效的检测处在s期的细胞百分数。

在干扰组加完sirna后24小时与对照组用pbs洗3遍，之后进行ki67染色。染色后放置于细胞增殖机器上，观测细胞随时间变化的增殖情况；另一部分细胞进行盖玻片培养法培养，稳定培养24小时之后，用秋水仙素处理1小时(即用秋水仙素抑制此时细胞的有丝分裂，固定细胞的分裂活动)，之后计算1000个细胞中洋葱根尖样细胞(即分裂相细胞)数目，最后用百分比表示；两组细胞稳定培养24小时后，再用细胞计数仪进行细胞计数。

二、实验结果

图4结果显示，干扰组的软骨细胞增殖细胞相比于对照组细胞明显增多，软骨细胞总体数量也明显增多。这说明敲除foxm1基因后，可以明显增加骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎后的软骨细胞数量，即干扰foxm1可以有效协助骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎。

实施例5foxm1基因的抑制剂协同骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎时炎症相关因子的表达

一、实验方法

如实施例4，两组细胞按照实施例4的方法，sirna(sata，sc-43769)干预后培养24小时后，提取软骨细胞rna。进行q-pcr检测，检测炎症相关因子。

详细的步骤是，用rna提取试剂盒(碧云天公司)提取两组细胞的总rna。经过rna纯度及总rna完整性检测合格后，进行逆转录。逆转录后制备15μl的反应溶液，并用纯水稀释20倍后震荡上机，检测结果。

涉及的引物信息如下：

il-6，f：gaagagcgccgctgagaat，r：gtgcagagggtttaatgtcaact；tnf-α：f：ggatctcaaagacaaccaac，r：acagagcaatgactccaaag；il-1：f：gagccccaaaagcaagaggaa，r：tgcgggcatacggtttcatc；il-1β：f：ccttgtgcaagtgtctgaagc，r：cccaagtcaagggcttggaa；

二、实验结果

q-pcr结果显示，干扰组相比于对照组，骨关节炎相关炎症因子：il-6、il-1β、il-1均降低且差异有统计学意义，tnf-α也有明显的降低趋势。这表明干扰foxm1后，体外原代软骨细胞炎症反应水平降低，从而显示foxm1基因的抑制剂协同骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎与是由于有foxm1基因干预了关节局部的炎症反应。