链球菌中毒性休克综合征的制作方法

[0001]
本发明涉及预防和治疗由a群链球菌引起的疾病。具体而言，本发明涉及用于治疗或预防a群链球菌相关中毒性休克综合征的抗体或抗体片段。


背景技术：

[0002]
a群链球菌(酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)，gas)感染在社会各阶层中非常普遍，估计有超过6亿的链球菌性咽炎病例和超过1.6亿的链球菌化脓性皮病病例。绝大多数病例是良性的，并可以用抗生素和基本保健成功地治疗。但是，链球菌疾病可能发展到喉咙和皮肤以外，从而引起侵袭性gas(igas)疾病，包括链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome,stss)。此外，未经治疗的感染可引起链球菌后后遗症，包括风湿性心脏病和肾小球肾炎。igas疾病和链球菌后后遗症在澳大利亚土著居民(aboriginal)和托雷斯海峡岛民(torres strait islander)人群中以及在世界范围内社会地位低下的人群中尤为普遍。
[0003]
在全球范围内，这些疾病状况每年造成超过500,000人丧生。现在，保守估计将gas列为全球感染相关死亡率的第四大最常见原因(仅次于hiv、结核病和肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae))。这些数字被认为是“冰山一角”，无论是发达国家还是不发达国家，目前都存在igas疾病的流行。
[0004]
stss主要是由与人mhc ii分子(在肽结合沟之外)和t细胞受体可变链非特异性结合的超抗原毒素引起的，导致多克隆t细胞激活，通常>20％的cd20+t细胞被激活。这导致的th1细胞因子风暴是造成低血压和多器官衰竭(包括肝脏、肾脏、凝血系统和呼吸系统)的提议的因果关系。
[0005]
在小鼠模型中已经证明，超抗原介导的死亡需要t细胞。在使用葡萄球菌超抗原(staphylococcal superantigen,seb)的模型中，还证明抗tnf预处理可以阻断中毒性休克的致死性[2]。stss的死亡率很高，即使在高收入国家也会超过50％。任何链球菌感染后均可发生这种疾病状况，但最常见的是在皮肤感染后发生。它通常与坏死性筋膜炎、肌炎或深瘀伤(deep bruising)相关。水痘、蜂窝组织炎和直接皮肤穿刺可能是重要的辅因子。
[0006]
超抗原(superantigen,sag)是所有致病性gas和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)菌株分泌的低分子量胞外蛋白(exo-protein)。gas有11种血清学上不同的超抗原。11种中的9种位于存在于噬菌体中的基因上。它们可以激活原代t细胞，不需要抗原处理。超抗原显示出与人mhc iiβ链结合的高亲和力和与tcrβ链结合的低亲和力。超抗原对小鼠mhc的高亲和力比对人mhc的亲和力低几个数量级[3]，因此，正常小鼠不是研究超抗原介导的疾病的合适模型。在11种可能存在于gas中的超抗原中，大多数stts病例都是由链球菌致热外毒素(streptococcal pyrogenic exotoxin,spe)a或spec中的一种或另一种引起的[4]。
[0007]
开发预防stss的疫苗的努力是有限的。一团队已经开发出针对spea和spec的类毒素，并证明对兔子进行接种可以产生中和毒素，并保护兔子免受经微型渗透泵施用的天然
毒素侵害的抗体。兔子没有暴露于链球菌感染[4,5]。这种疫苗方法苦于需要接种多种类毒素来预防仅链球菌疾病的一个方面。
[0008]
hla转基因小鼠已被用作使用来自金黄色葡萄球菌超抗原的明确无毒片段开发候选疫苗的模型[3]。这些小鼠没有受到生物体的攻击，而是受到了重组超抗原的攻击。
[0009]
被动免疫疗法已视为治疗stss的一种手段。已经证明，静脉注射免疫球蛋白(ivig)可显著降低stss病例死亡率[6]。该研究使用了历史对照，但在最近一项对67名患者和前瞻性对照进行的瑞典研究中，死亡率为仅接受抗生素治疗的44例患者中的22例(50％)，对比接受ivig加抗生素治疗的23例中的3例(13％)(p<0.01)[7]。但是，据估计，ivig中超抗原抗体滴度必须大于40，才能获得临床益处。这大约是在ivig中发现的特异性抗体的量，因此建议使用多剂量ivig。ivig的高昂成本、批次之间的差异[8]和供应困难都凸显了对替代辅助疗法的需要。
[0010]
发明概述
[0011]
本发明人令人惊讶地发现，在具有或不具有结合a群链球菌超抗原片段或其变体的抗体或抗体片段的情况下，结合a群链球菌m蛋白片段或其变体的抗体或抗体片段令人惊奇地有效抵御a群链球菌相关疾病病症或疾病状况，例如链球菌中毒性休克综合征。
[0012]
因此，在宽泛的形式中，本发明涉及使用结合a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物的抗体或抗体片段和任选的结合a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或其衍生物的抗体或抗体片段来被动免疫、治疗或预防a群链球菌相关疾病病症或疾病状况，例如包括链球菌中毒性休克综合征(stss)的侵袭性gas(igas)疾病。
[0013]
在另一宽泛的形式中，本发明涉及使用a群链球菌m蛋白片段、其变体或衍生物和任选的a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物来接种或免疫、治疗或预防a群链球菌相关疾病病症或疾病状况，例如包括链球菌中毒性休克综合征(stss)的侵袭性gas(igas)疾病。
[0014]
本发明的一个方面提供了被动免疫哺乳动物以抵御链球菌中毒性休克综合征的方法，所述方法包括向该哺乳动物施用抗体或抗体片段的步骤，所述抗体或抗体片段结合a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物，或针对a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物而产生，从而被动免疫哺乳动物以抵御哺乳动物的链球菌中毒性休克综合征。
[0015]
在前述方面的一个具体实施方案中，该方法还包括向哺乳动物施用结合a群链球菌超抗原或针对该超抗原而产生的抗体或抗体片段的步骤。
[0016]
本发明的另一方面提供了治疗或预防哺乳动物的链球菌中毒性休克综合征的方法，所述方法包括向哺乳动物施用以下的步骤：a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物，和/或结合a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物或针对a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物而产生的抗体或抗体片段，从而治疗或预防哺乳动物的链球菌中毒性休克综合征。
[0017]
在前述方面的一个具体实施方案中，该方法还包括以下步骤：向哺乳动物施用a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物，和/或结合a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物或针对a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物而产生的抗体或抗体片段。
[0018]
本发明的另一方面提供了适合施用于哺乳动物的组合物，所述组合物包含结合a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物或针对a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物而产生的抗体或抗体片段。
[0019]
在本方面的一个实施方案中，组合物还包含结合a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物或针对a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物而产生的抗体或抗体片段。
[0020]
对于前述方面，抗体或抗体片段合适地是单克隆抗体或抗体片段。在前述方面的一个具体实施方案中，单克隆抗体或抗体片段是重组人源化单克隆抗体或其片段。
[0021]
在相关方面，本发明涉及适合施用于哺乳动物的组合物，所述组合物包含：a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物和a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物。
[0022]
本发明的另一相关方面提供了结合a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物或针对a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物而产生的单克隆抗体或其片段；和/或结合a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物或针对a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物而产生的抗体或抗体片段。
[0023]
优选地，单克隆抗体或片段是重组人源化单克隆抗体或其片段。
[0024]
该方面还提供了编码重组人源化单克隆抗体或其片段的分离的核酸，包含分离的核酸的基因构建体和/或包含基因构建体的宿主细胞。
[0025]
在前述方面的具体实施方案中，m蛋白片段是或包含m蛋白的保守区。在一个实施方案中，m蛋白片段是、包含或包含于p145肽中。
[0026]
在一个具体实施方案中，m蛋白片段是、包含于或包含j8肽、其片段、变体或衍生物。
[0027]
在另一具体实施方案中，所述片段是、包含于或包含p17肽、其片段、变体或衍生物。
[0028]
在前述方面的另一具体实施方案中，超抗原是链球菌致热外毒素(spe)a或spec。
[0029]
适当地，根据前述方面，哺乳动物是人。
[0030]
本文所用的不定冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”在本文中用于表示或涵盖单数或复数元素或特征，并且不应理解为表示或定义“一个/种”或“单/种”元素或特征。
[0031]
除非上下文另外要求，否则术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”或类似术语旨在表示非排他性包括，从而所列举的元素或特征列表不仅仅包括那些所述或所列元素，而是可以包括未列举或陈述的其他元素或特征。
[0032]
在氨基酸序列的上下文中，“基本上由...组成”是指所述氨基酸序列以及n或c末端的另外一个、两个或三个氨基酸。
[0033]
附图简述
[0034]
图1:(a-b)gas sn1在hla-b6小鼠中的感染性。使原初hla-b6和b6小鼠(n＝10/组)经皮肤感染gas sn1。在感染后第6天，挑选小鼠，并评估皮肤细菌负荷(a)。通过在感染后第3、4、5和6天对血液样品铺平板来评估全身感染的存在(b)***p<0.001。(c-d).sn1感染小鼠血清的蛋白质印迹分析。分析从sn1感染的balb/c(c)以及sn1和ns33(不表达超抗原的c群链球菌)感染的hla-b6和b6小鼠(d)收集的血清样品，以检测其血清中spec的存在。使样品在4-15％sds-page凝胶上运行。从凝胶中转移蛋白质后，用一抗即兔抗spec igg探测膜，然后用绵羊抗兔igg-ap检测，并使用bcip/nbt底物显影。来自sn1感染小鼠的血清样品中约26kda处的条带对应于阳性对照样品中的rspec。
[0035]
图2:(a)spec在鼠模型中的促有丝分裂活性。响应sn1 spec的脾细胞增殖。用来自
sn1 gas感染小鼠的无菌过滤的含spec血清或用rspec体外刺激hla-b6和b6小鼠的脾细胞。作为对照，还包括来自超抗原阴性gas株(ns33)和cona感染的小鼠的无菌过滤血清。72h(小时)后评估脾细胞的增殖，并将数据表示为刺激指数(stimulation index,si)。通过添加抗rspec抗体证实了反应的特异性，该抗体抑制了响应于血清和rspec的脾细胞增殖。(b-c).脾细胞增殖后的细胞因子特征(profile)。在与各种刺激剂一起孵育后72h，测量了hla-b6和b6小鼠脾细胞中的细胞因子反应。使用cba试剂盒测量培养物上清液中tnf(b)和ifn-γ(c)的浓度。通过添加抗rspec抗体确认了反应的特异性。采用单因素anovah和tukey事后法(tukey’s post-hoc method)计算各组之间的显著性。*p＜0.05和**p＜0.01。si定义为存在抗原时的每分钟计数/不存在抗原时的每分钟计数。
[0036]
图3.(a).j8-dt抵御gas sn1感染的保护效果。在第0、21和28天为hla-b6小鼠接种j8-dt或pbs。免疫后两周，使小鼠经皮肤感染gas sn1。在感染后第6天，挑选小鼠，并显示皮肤(cfu/病灶)、血液(cfu/ml)和脾脏(cfu/脾脏)的细菌负荷。(b).检测血清中毒素的蛋白质印迹分析。使在sn1感染后第6天收集的来自接种的组群和对照组群的合并的血清样品在在4-15％sds-page凝胶上运行。从凝胶中转移蛋白质后，用兔抗spec igg探测膜，然后用绵羊抗兔igg-ap检测，并使用bcip/nbt底物显影。pbs小鼠血清样品中26kda处的条带对应于阳性对照样品中的rspec。(c-d).对来自接种的感染小鼠的血清诱导的增殖进行评估。用来自sn1感染、接种(j8-dt+sn1)的小鼠或未接种疫对照(pbs+sn1)小鼠的浓度预先优化的血清，刺激来自2个不同个体的pbmc。pha和rspec用作刺激的对照。通过添加各种量的rspec抗血清评估反应的特异性。在存在原初血清(sera)情况下pbmc用作中和特异性的对照。在72h后，通过[3h]胸苷摄取测量增殖。数据是每个实验中3次重复的平均值
±
sem，实验重复两次。显示了来自两个个体的代表性数据。采用单因素anova和tukey事后法计算显著性。*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。
[0037]
图4.(a-c).rspec抗血清中和rspec。在存在各种量的rspec抗血清或无血清的情况下，用不同浓度的rspec刺激来自3个不同个体的pbmc。pha用作对照。72h后，通过[3h]胸苷摄取来测量增殖。数据是每个实验中3次重复的平均值
±
sem，实验重复两次。刺激指数(si)定义为存在抗原时的每分钟计数/不存在抗原时的每分钟计数。采用单因素anova和tukey事后法来计算显著性。*p＜0.05和***p＜0.001。
[0038]
图5.(a)用与j8-dt抗血清一起孵育的gas进行的攻击研究。将gas 2031(emm1)菌株在40℃下与1:50稀释的j8-dt抗血清一起旋转孵育1h。洗涤后，将细菌接种体腹膜内注射到scid小鼠中。48h后，挑选小鼠，并收获血液。显示了个体小鼠中的细菌负荷。(b)rspec抗血清在体内中和spec。感染后第5天，向sn1感染的balb/c小鼠腹膜内施用抗rspec或原初血清。为了评估体内spec中和，在抗血清给药之前(0h)、然后在抗血清给药后6h和24h收集血清样品。显示了在不同时间点小鼠血清中spec的存在。(c)rspec抗血清治疗对皮肤细菌负荷的影响。感染后第5天，向sn1感染的balb/c小鼠腹膜内施用抗rspec或原初血清。治疗后24h，挑选小鼠，并评估细菌负荷。显示了治疗的和未治疗的小鼠皮肤中的细菌负荷。使用非参数、未配对的mann-whitney u检验进行统计分析，以比较这两组。**p<0.01。
[0039]
图6.(a-b)在鼠皮肤感染模型中人分离株的毒力。使balb/c小鼠组群经皮肤感染途径感染gas sn1或gas ns33菌株。在攻击后第3、6或9天，挑选小鼠，并收集皮肤活检(a)和脾脏(b)样品以确定细菌负荷。结果以盒须图(box and whisker plot)显示，其中盒中的线
表示中位数，盒末端表示上四分位数和下四分位数，而须则表示最小值至最大值。(c)在第6天收集的个体小鼠血清样品中的spec检测。如所述，还评估了sn1/ns33感染后第6天来自每只个体小鼠的血清样品的spec的存在。显示了代表性图像。*表示脾脏培养物阳性的小鼠。使用非参数、未配对的mann-whitney u检验进行统计分析，以在每个时间点比较这两组。**p<0.01和***p<0.001。
[0040]
图7.(a)spec在鼠模型中的促有丝分裂活性。响应于sn1 spec的脾细胞增殖。用来自sn1 gas感染小鼠的无菌过滤的含spec血清或用rspec体外刺激hla-b6和b6小鼠的脾细胞。作为对照，还包括来自超抗原阴性gas菌株(ns33)和cona感染的小鼠的无菌过滤血清。72h后，评估脾细胞的增殖，并将数据表示为刺激指数(si)。通过添加抗rspec抗体证实了反应的特异性，该抗体抑制了响应于血清和rspec的脾细胞增殖。(b-c).脾细胞增殖后的细胞因子特性。在与各种刺激剂一起孵育后72h，测量了hla-b6和b6小鼠脾细胞中的细胞因子反应。使用cba试剂盒(bd biosciences)测量培养物上清液中tnf(b)和ifn-γ(c)的浓度。通过添加抗rspec抗体证实了反应的特异性。采用单因素anova和tukey事后法来计算各组之间的显著性。*p<0.05和**p<0.01。si定义为存在抗原时的每分钟计数/不存在抗原时的每分钟计数。(d-f).响应于来自gas sn1或gas ns33感染小鼠血清的刺激，人pbmc的增殖。在感染gas sn1或gas ns33后，在存在不同时间点收集的血清的情况下，培养来自三个不同个体的pbmc。72小时后，通过[3h]胸苷摄取来测量增殖。数据是每个实验中3次重复的平均值
±
sem，实验重复两次。
[0041]
图8.(a-b).gas sn1在hla-b6小鼠中的体内感染性。原初hla-b6和b6小鼠(n＝10/组)经gas感染的腹膜内途径感染gas sn1。小鼠接受了106、107或108cfu的sn1。在感染后24小时，对小鼠的临床症状进行评分，以评估疾病严重性。显示了hla-b6和b6小鼠的临床评分。(b)评分后，将挑选小鼠，并评估血液和脾脏中的细菌负荷。结果以盒须图显示，其中盒中的线表示中位数，盒末端表示上四分位数和下四分位数，而须则表示最小值至最大值。采用单因素nova和tukey事后法来计算对照组和测试组之间的显著性。(c)来自sn1感染的hla-b6和b6小鼠的血清的蛋白质印迹分析。分析了从sn1感染的小鼠收集的血清样品，以检测其血清中的毒素。使样品在4-15％sds-page凝胶上运行。从凝胶中转移蛋白质后，用一抗即兔抗spec igg探测膜，然后用绵羊抗兔igg-ap检测，并使用bcip/nbt底物显影。还使rspec蛋白作为阳性对照来运行。(d-f)腹膜内感染sn1后hla-b6小鼠的血清细胞因子特性。在感染后24h，挑选感染sn1的小鼠。使用cba试剂盒，测量从接受最高剂量(1x10
8 cfu)的sn1的组群采集的血液样品的血液细胞因子水平。显示了tnf、ifn-γ和il-2反应。采用单因素anova和tukey事后法来计算各组之间的显著性。*p<0.05和**p<0.01。si定义为存在抗原时的每分钟计数/不存在抗原时的每分钟计数。
[0042]
图9.(a-b).gas sn1在hla-b6小鼠中的感染性。使原初hla-b6和b6小鼠(n＝10/组)经皮肤感染了gas sn1或gas ns33。在感染后第6天，挑选小鼠，并评估皮肤细菌负荷(a)。通过在感染后第3、4、5和6天对血液样品铺平板来评估全身感染的存在(b)。结果以盒须图显示，其中盒中的线表示中位数，盒末端表示上四分位数和下四分位数，而须则表示最小值至最大值。(c)来自sn1或ns33感染小鼠的血清的蛋白质印迹分析。分析从sn1或ns33感染的hla-b6和b6小鼠收集的血清样品，以检测其血清中spec的存在。使样品在4-15％sds-page凝胶上运行。从凝胶中转移蛋白质后，用一抗即兔抗spec igg探测膜，然后用绵羊抗兔
igg-ap检测，并使用bcip/nbt底物显影。来自sn1感染小鼠的血清样品中26kda处的条带对应于阳性对照样品中的rspec。(d-f).皮肤感染后hla-b6和b6小鼠血清中的细胞因子反应。在感染sn1或ns33后第6天，测量hla-b6和b6小鼠血清中的细胞因子反应。使用cba试剂盒测量tnf(c)、ifn-γ(d)和il-2的浓度。采用单因素anova和tukey事后法计算各组之间的显著性。***p＜0.001。
[0043]
图10.(a).j8-dt抵御gas sn1感染的保护效果。在第0、21和28天向hla-b6小鼠接种j8-dt或pbs。免疫后两周，使小鼠经皮肤感染gas sn1。在感染后第6天，挑选小鼠，并显示皮肤(cfu/病灶)、血液(cfu/ml)和脾脏(cfu/脾脏)的细菌负荷。(b).检测血清中毒素的印迹分析。使在sn1感染后第6天收集的来自接种组群和对照组群的合并的血清样品在4-15％sds-page凝胶上运行。从凝胶中转移蛋白质后，用兔抗spec igg探测膜，然后用绵羊抗兔igg-ap检测，并使用bcip/nbt底物显影。pbs小鼠的血清样品中26kda处的条带对应于阳性对照样品中的rspec。(c-d).皮肤感染后hla-b6小鼠血清中的细胞因子反应。在感染sn1后第6天，测量了接种的hla-b6小鼠和对照hla-b6小鼠血清中的细胞因子反应。使用cba试剂盒测量il-4和il-10(c)以及tnf和ifn-γ(d)的浓度。采用单因素nova和tukey事后法计算各组之间的显著性。***p＜0.001。(e-g).评估接种的小鼠/对照感染的小鼠的血清诱导的增殖。用来自接种疫的sn1感染(j8-dt+sn1)小鼠或未接种的sn1感染(pbs+sn1)小鼠的浓度预先优化的血清刺激来自3个不同个体的pbmc。pha和rspec用作刺激的对照。通过添加各种量的rspec抗血清评估反应的特异性。在存在原初血清的情况下pbmc用作中和特异性的对照。72小时后，通过[3h]胸苷摄取测量增殖。数据是每个实验中3次重复的平均值
±
sem，实验重复两次。显示了来自两个个体的代表性数据。采用单因素anova和tukey事后法来计算显著性。*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。
[0044]
图11.接种的血清和对照血清刺激后pbmc的细胞因子反应。用来自接种的sn1感染小鼠或对照sn1感染小鼠的浓度预先优化的血清刺激来自三个不同个体的pbmc。最佳浓度的rspec和pha用作刺激的阳性对照。通过将预先优化量(20μl)的rspec抗血清添加到选定的含有接种的sn1感染血清或对照sn1感染血清或rspec的孔中，来评估rspec抗血清的抑制效果。单独的培养基孔用作阴性对照。体外培养72小时后，使用cba试剂盒测量细胞因子反应。数据是每个实验中3次重复的平均值
±
sem，实验重复两次。使用非参数、未配对的mann-whitney u检验进行统计分析，以比较这两组。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
[0045]
图12.(a)rspec抗血清体内中和spec。使hla-b6小鼠经皮肤感染gas sn1。在感染后第5天，向小鼠腹膜内施用抗rspec或原初血清。为了评估体内spec中和，在抗血清给药之前(0小时)然后在抗血清给药后6h和24h收集血清样品。显示了在不同时间点在治疗和未治疗的hla-b6小鼠血清中spec的存在。(b)rspec抗血清的治疗潜力。为了评估rspec抗血清的治疗潜力，在血清给药后6h和24h挑选指定数量的小鼠。显示了治疗和未治疗的小鼠皮肤和血液中的细菌负荷。结果以盒须图显示，其中盒中的线表示中位数，盒末端表示上四分位数和下四分位数，而须则表示最小值至最大值。ns p>0.05。
[0046]
图13.组合免疫疗法的治疗潜力(a)，感染和治疗方案的时间线(b)。用剂量预先优化的gas sn1腹膜内感染四组hla-b6小鼠(n＝3-5/组)。感染后18小时，对小鼠的临床症状进行评分，并向小鼠静脉内施用200μl抗j8-dt、抗rspec、抗j8-dt和抗rspec的组合或原初血清。在质粒后24h(感染后42h)，评估小鼠的临床评分，然后挑选小鼠。收获血液和脾脏样
品，并对其处理和铺平板，以量化细菌。显示了小鼠血液和脾脏中的细菌负荷。(c)在治疗前后对所有小鼠的临床症状进行评分，以评估疾病严重性。显示了抗血清治疗之前(0h)和之后(24h)所有组群的临床评分。(d-g)为了评估体内spec中和，在抗血清给药前(0小时)然后在抗血清给药后24h收集了所有组群的血清样品。显示了在治疗前后，用j8-dt抗血清(d)、rspec抗血清(e)、j8-dt+rspec抗血清(f)或pbs抗血清(g)血清治疗的hla-b6小鼠中spec的存在。进行mann-whitney检验，以将各组与对照pbs治疗组进行比较。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和ns p>0.05。
[0047]
图14.响应于strepa抗原和各种抗血清的脾细胞增殖和抑制。(a)评估响应于sn1感染的血清的增殖及抗血清对其的抑制。在存在或不存在j8-dt、rspec、j8-dt+rspec或pbs抗血清的情况下，评估响应于来自sn1 gas感染小鼠的含spec的血清的脾细胞增殖。(b)还包括用rspec、rm1或rspec+rm1刺激的脾细胞，作为对照。使用j8-dt、rspec或j8-dt+rspec抗血清作为阻断剂。72小时后，评估脾细胞的增殖，将数据表示为刺激指数(si)。**p<0.01、***p<0.001和ns p>0.05。
[0048]
图15.使用sigma的genelute细菌gdna提取试剂盒从过夜稳定期培养物中提取基因组dna。使用nanodrop1000证明gdna合格，然后使用2ug的gdna扩增超抗原。然后按照图像说明运行凝胶。
[0049]
图16.gas人分离株在鼠血液中的体外生长。使gas分离株在具有1％新胨(neopeptone)的thb中o/n生长。将每个分离株连续稀释高达10-6
，并与新鲜肝素化鼠血液以1:3的比例一起孵育。在37℃孵育3h后，测量鼠血液中的细菌生长，并将其与起始培养物中的cfu计数进行比较。表现出cfu增加>20倍的分离株定义为在小鼠模型中引起全身性链球菌感染的潜力更高的分离株。显示的数据是每个分离株的平均值
±
sem。
[0050]
图17.响应于用gas sn1或gas ns33感染的小鼠的血清进行的刺激，人pbmc的增殖反应。用从gas sn1或gas ns33感染的小鼠收集的不同体积的血清刺激来自三个不同个体的pbmc。pha用作对照。72小时后，通过[3h]胸苷摄取来测量增殖。数据是每个实验中3次重复的平均值
±
sem，实验重复两次。采用单因素anova和tukey事后法来计算各组之间的显著性。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
[0051]
发明详述
[0052]
本发明至少部分基于以下发现：在具有或不具有结合a群链球菌(gas)超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物的抗体或抗体片段的情况下，结合a群链球菌m蛋白、其片段、变体或衍生物的抗体或抗体片段令人惊奇地有效抵御a群链球菌相关疾病病症或疾病状况，例如包括链球菌中毒性休克综合征(stss)的侵袭性gas疾病。
[0053]
因此，在宽泛形式中，本发明涉及使用结合a群链球菌m蛋白片段或其变体的抗体或抗体片段和任选的结合a群链球菌超抗原蛋白、其片段或变体的抗体或抗体片段来被动免疫、治疗或预防a群链球菌相关疾病病症或疾病状况，例如包括链球菌中毒性休克综合征(stss)的侵袭性gas疾病。
[0054]
在另一宽泛的形式中，本发明涉及使用a群链球菌m蛋白片段、其变体或衍生物和任选的a群链球菌超抗原蛋白、其片段、变体或衍生物接种或免疫、治疗或预防a群链球菌相关疾病病症或疾病状况，例如包括链球菌中毒性休克综合征(stss)的侵袭性gas(igas)疾病。
[0055]
如本文所用，术语“a群链球菌(group a streptococcus)”、“a群链球菌(group a streptococci)”、“a群链球菌(group a streptococcal)”、“a群链球菌(group a strep)”和缩写“gas”是指lancefield血清群a的链球菌，它们是酿脓链球菌的革兰氏阳性β溶血性细菌。gas的重要毒力因子是m蛋白，该蛋白具有较强的抗吞噬作用，与血清h因子结合，从而破坏c3转化酶并防止c3b的调理作用。这些链球菌还包括有毒的“突变体”，例如诸如graham et al.,2002,pnas usa 99 13855中描述的covr/s或covrs突变体，但不限于此。
[0056]
由a群链球菌引起的疾病、病症和疾病状况包括蜂窝组织炎、丹毒、脓疱病、猩红热、诸如急性咽炎等咽喉感染(链球菌性喉炎)、菌血症、诸如链球菌中毒性休克综合征(stss)等侵袭性gas疾病、坏死性筋膜炎、急性风湿热和急性肾小球肾炎，但不限于此。在具体实施方案中，疾病或疾病状况是或包括链球菌中毒性休克综合征(stss)。
[0057]“蛋白质”是指氨基酸多聚体。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，d-或l-氨基酸是本领域众所周知的。
[0058]
术语“蛋白质”包括并涵盖“肽”和“多肽”，肽通常用于描述具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质，多肽通常用于描述具有超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。
[0059]“片段”是蛋白质的片段、结构域、部分或区域(例如m蛋白、p145、p17、j8或j14，或针对其产生的或针对其的超抗原或抗体)，其构成少于100％蛋白质的氨基酸序列。应当理解，片段可以是单个片段，或者可以单独或与其他片段重复。
[0060]
通常，片段可包含、基本组成为或组成为全长蛋白质的高达5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600个氨基酸。
[0061]
适当的是，片段是“免疫原性的”，这是指该片段在施用于哺乳动物时可以引发抗体反应。
[0062]
本文通常使用的“抗体”是或衍生自免疫球蛋白基因复合物的蛋白质产物，包括诸如igg、igm、igd、iga和ige等同种型和诸如igg1、igg2a等亚型，但不限于此。抗体和抗体片段可以是多克隆或单克隆的，天然的或重组的。抗体片段包括fc、fab或f(ab)2片段和/或可以包含单链fv抗体(scfv)。这类scfv可以例如根据分别在美国专利号5,091,513、欧洲专利号239,400或论文winter&milstein,1991,nature 349:293中描述的方法制备。抗体还可包括多价重组抗体片段，例如包含多个scfv的双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)和/或四链抗体(tetrabody)，以及二聚化激活的片体(demibody)(例如wo/2007/062466)。举例而言，可以根据holliger et al.,1993proc natl acad sci usa 90 6444或kipriyanov,2009methods mol biol 562 177描述的方法制备此类抗体。适用于抗体产生、纯化和使用的众所周知的方案可见于coligan et al.,current protocols in immunology(现代免疫学方法)(john wiley&sons ny,1991-1994)的第二章和harlow,e.&lane,d.antibodies:a laboratory manual(抗体：实验室手册),cold spring harbor,cold spring harbor laboratory,1988。
[0063]
产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。可以使用的示例性方案描述于例如coligan et al.,current protocols in immunology，同上，和harlow&lane,1988,同上。在具体实施方案中，多克隆抗体可以从暴露于或感染a群链球菌的个体的人血
清中获得或纯化。或者，可以在生产物种例如马中产生针对纯化的化学合成的或重组的m蛋白、超抗原或其免疫原性片段或变体的多克隆抗体，然后在施用之前纯化。
[0064]
可以使用例如最初在&milstein的文章(&milstein,1975,nature 256,495)中描述的标准方法，或者通过例如在coligan et al.,current protocols in immunology(同上)中描述的其最近的改进版，通过使衍生自已经用本发明的一种或多种分离的蛋白质、其片段、变体或衍生物接种的生产物种的脾细胞或其他产生抗体的细胞永生，来产生单克隆抗体。单克隆抗体或其片段可以是重组形式。如果单克隆抗体最初是由非人类哺乳动物的脾细胞产生的，则这对于“人源化”单克隆抗体或片段可能是特别有利的。
[0065]
在一个实施方案中，抗体或抗体片段结合m蛋白、其片段或变体和/或针对m蛋白、其片段或变体产生。
[0066]
本文所用的“m蛋白片段”是gas m蛋白的具有免疫原性和/或能够被抗体或抗体片段结合的任何片段。通常，该片段是、包含或包含于gas m蛋白或其片段的c-重复区的氨基酸序列。非限制性实例包括p145，p145为具有氨基酸序列lrrdldasreakkqvekale(seq id no:1)的20mer。最小的p145表位序列是sreakkqvekal(seq id no:5)。
[0067]
在具体实施方案中，m蛋白片段是或包含seq id no:5或其变体或衍生物的最小p145表位。
[0068]
在这方面，p145氨基酸序列的片段可以存在于p17、j14或j8肽中。因此，在具体实施方案中，m蛋白片段、其变体或衍生物的组成为、基本组成为或包含p17肽、j14肽或j8肽。
[0069]
在本发明之前进行的工作中，对p145肽的某些修饰可以实质上改善针对a群链球菌的免疫原性。在一个实施方案中，p17肽是修饰的p145肽，其包含对应于seq id no:1的残基13的n残基和seq id no:1的残基17处的r氨基酸。
[0070]
优选地，p17包含修饰的p145最小表位，该最小表位包含对应于seq id no:5的残基6的n残基和seq id no:1的残基10处的r氨基酸。
[0071]
在一个实施方案中，p17肽包含氨基酸序列lrrdldasreaknqverale(seq id no：2)。
[0072]
在一个实施方案中，p17肽包含修饰的p145最小表位片段，该片段包含氨基酸序列sreaknqveral(seq id no:6)。
[0073]
pct/au2018/050893概括了其他p145肽变体，pct/au2018/050893通过引用并入本文。下文提供了示例性p145变体：
[0074]
p145 lrrdlda sreakkqvekal e(seq id no:1)
[0075]
p*1.lrrdlda eneakkqvekal e(seq id no:13)
[0076]
p*2.lrrdlda edeakkqvekal e(seq id no:14)
[0077]
p*3.lrrdlda ereaknqvekal e(seq id no:15)
[0078]
p*4.lrrdlda ereakkqveral e(seq id no:16)
[0079]
p*5.lrrdlda ereakkqvemal e(seq id no:17)
[0080]
p*6.lrrdlda vneakkqvekal e(seq id no:18)
[0081]
p*7.lrrdlda vdeakkqvekal e(seq id no:19)
[0082]
p*8.lrrdlda vreaknqvekal e(seq id no:20)
[0083]
p*9.lrrdlda vreakkqveral e(seq id no:21)
[0084]
p*10.lrrdlda vreakkqvemal e(seq id no:22)
[0085]
p*11.lrrdlda sneaknqvekal e(seq id no:23)
[0086]
p*12.lrrdlda sneakkqveral e(seq id no:24)
[0087]
p*13.lrrdlda sneakkqvemal e(seq id no:25)
[0088]
p*14.lrrdlda sdeaknqvekal e(seq id no:26)
[0089]
p*15.lrrdlda sdeakkqveral e(seq id no:27)
[0090]
p*16.lrrdlda sdeakkqvemal e(seq id no:28)
[0091]
p*17lrrdlda sreaknqveral e(seq id no:6)
[0092]
p*18.lrrdlda sreaknqvemal e(seq id no:29)
[0093]
如本文所用，“j14肽”可包含氨基酸序列(seq id no:3)或其片段或变体，该氨基酸序列是p145内具有最小b和t细胞表位的肽，p145被鉴定为不含潜在有害的t细胞自身表位，但是含有调理性b细胞表位的gas m蛋白c区肽。j14是含有来自m蛋白c区的14个氨基酸(以粗体显示)并且侧翼是酵母衍生的gcn4序列的嵌合肽，gcn4序列对于维持肽的正确螺旋折叠和构象结构是必不可少的。
[0094]
如本文所用，“j8肽”是包含至少部分地衍生于或对应于gas m蛋白c区肽的氨基酸序列的肽。j8肽适当地包含构象b细胞表位，并且缺乏潜在有害的t细胞自身表位。优选的j8肽氨基酸序列是(seq id no:4)或其片段或变体，其中加粗的残基对应于gas m蛋白的残基344-355。在该实施方案中，j8是进一步包含侧翼的gcn4 dna结合蛋白序列的嵌合肽，gcn4 dna结合蛋白序列有助于维持j8肽的正确螺旋折叠和构象结构。
[0095]
在其他实施方案中，抗体或抗体片段结合gas超抗原和/或针对gas超抗原产生。
[0096]
如本文所用，“超抗原”是由全部或大部分致病性gas菌株分泌的低分子量胞外蛋白。gas中有11种血清学上不同的超抗原，称为spe-a、spe-c、spe-g、spe-h、spe-i、spe-j、spe-k、spe-l、spe-m、ssa和smez。链球菌超抗原显示出与人mhc iiβ链的高亲和力结合，而与tcrβ链相对低的亲和力结合。链球菌超抗原蛋白结构表现出保守的两个结构域结构，并且存在跨越分子中心的长的溶剂可及的α-螺旋。n末端结构域是具有寡核苷酸/寡糖结合(ob)折叠的混合的β-桶状结构。较大的c端结构域为β-抓握折叠(β-grasp fold)，由扭曲的β片层构成，该扭曲的β片层被中心α4-螺旋封端，该螺旋针对四链反平行扭曲的片层而堆积。链球菌超抗原是极其稳定的蛋白质，可抵抗热和酸的变性，这是通过n和c末端结构域的紧密堆积来实现的。该结构通过在c末端结构域顶部伸展的n末端的部分进一步稳定。值得注意的是，所有链球菌超抗原的最保守部分是在α4-螺旋与n末端ob折叠结构域内侧之间建立界面的区域。在gas中可能存在的11种超抗原中，大多数stts病例都是由链球菌致热外毒素(spe)a或spec中的一种或另一种引起的。
[0097]
如本文所用，蛋白质“变体”与参考氨基酸序列共享可确定的氨基酸序列关系。如上所述，参考氨基酸序列可以是m蛋白、超抗原或它们的片段的氨基酸序列。“变体”蛋白可具有参考氨基酸序列的一个或多个缺失或被不同氨基酸取代的氨基酸。本领域众所周知，在不改变免疫原性片段和/或蛋白质的活性(保守取代)的情况下，一些氨基酸可以被取代或缺失。优选地，蛋白质变体与参考氨基酸序列共享至少70％或75％，优选至少80％或85％，或更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一
性。
[0098]
p17和/或p145肽变体的非限制性实例描述于美国专利公开us2009/0162369中，其通过引用并入本文。
[0099]
j8肽变体的非限制性实例包括：
[0100]
s r e a k k q s r e a k k q v e k a l k q v e k a l c(seq id no:7)
[0101]
s r e a k k q s r e a k k q v e k a l k q s r e a k c(seq id no:8)
[0102]
s r e a k k q v e k a l k q s r e a k k q v e k a l c(seq id no:9)
[0103]
s r e a k k q v e k a l d a s r e a k k q v e k a l c(seq id no:10)。
[0104]
其他变体可以基于cooper et al.,1997所述的七肽(heptad)，cooper et al.,1997通过引用并入本文。
[0105]
举例来说，如果已知表位位于α-螺旋蛋白质结构构象内，则可以合成模型肽以折叠成该构象。我们根据gcn4亮氨酸拉链的结构(o’shea et al.,1991)设计了α-螺旋卷曲螺旋肽。第一个七肽含有序列mkqledk(seq id no:11)，该序列包括在稳定的卷曲螺旋七肽体重复基序(a-b-c-d-e-f-g)n(cohen&parry,1990)中发现的几个特征。这些特征包括a和d位置的大非极性残基，e和g位置的酸/碱对(glu/lys)(通常有利于链间离子相互作用)和b、c、f位置的极性基团(与lupas etal.(1991)的预测一致)。gcn4肽在a位置还含有共有缬氨酸。还已经注意到，当位置a和d被v和l占据时，有利于卷曲螺旋二聚体(harbury et al.,1994)。模型七肽重复衍生自gcn4亮氨酸拉链肽(vkqledk；seq id no：12)的这些共有特征，具有形成β-螺旋卷曲螺旋的潜力。该肽成为框架肽。将研究中的构象表位的重叠片段嵌入模型卷曲螺旋肽内，得到嵌合肽。只要在螺旋模型肽和表位序列中发现相同的残基，则将经设计确保正确的螺旋卷曲螺旋构象的氨基酸取代(cohen&parry,1990)引入嵌合肽中。通常使用以下取代：位置a，v到i；b，k到r；c，q到n；d，l到a；e，e到q；f：d到e；g，k到r。所有这些取代残基通常都存在于卷曲螺旋蛋白中的其各自位置(lupas et al.,1991)。
[0106]
本文中通常用于描述各蛋白质与核酸之间的序列关系的术语包括“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质同一性”。因为各核酸/蛋白质可各自包含(1)核酸/蛋白质共有的完整核酸/蛋白质序列的仅一个或多个部分，和(2)一个或多个在核酸/蛋白质之间不同的部分，通常通过在“比较窗”上比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行序列比较。“比较窗”是指与参考序列比较的通常6、9或12个连续残基的概念区段。与参考序列相比，比较窗可包含约20％或更少的添加或缺失(即缺口)，以使各个序列最佳比对。可以通过计算机实施算法(intelligenetics的geneworks程序；wisconsin genetics software package release 7.0中的gap、bestfit、fasta以及tfasta，genetics computer group,575science drive madison,wi,usa，其通过引用并入本文)或通过检查进行序列的最佳比对，用于对齐比较窗，通过所选择的各种方法中的任一种产生最佳比对(即在比较窗中导致最高百分比的同源性)。还可以参考例如altschul et al.,1997,nucl.acids res.25 3389(其通过引用并入本文)所公开的blast程序家族。序列分析的详细讨论可见于current protocols in molecular biology eds.ausubel et al.(john wiley&sons inc ny,1995-1999)的第19.3单元(unit 19.3)。
[0107]
术语“序列同一性”在本文中以其最广泛的含义使用，以考虑到使用标准算法的适当比对并考虑到比较窗内序列相同的程度包括准确核苷酸或氨基酸匹配的数目。因此，“序
列同一性百分比”通过以下方式计算：在比较窗中比较两个最佳比对的序列，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，a、t、c、g、i)的位置的数量以得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100，即得到序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可以理解为是指由dnasis计算机程序(用于windows的2.5版；可从美国加利福尼亚州南旧金山的日立软件工程有限公司(hitachi software engineering co.,ltd.,south san francisco,california,usa)获得)计算的“匹配百分比”。
[0108]
如本文所用，“衍生物”是通过以下方式发生改变的分子，例如蛋白质、其片段或变体：例如与其他化学部分缀合或复合，通过翻译后修饰(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化修饰(例如，添加、去除或改变糖基化)、脂化和/或包含额外的氨基酸序列，正如本领域所理解的。在一具体实施方案中，额外的氨基酸序列可以在其n和/或c末端包含一个或多个赖氨酸残基。额外的赖氨酸残基(例如聚赖氨酸)可以是赖氨酸残基的线性序列，或者可以是赖氨酸残基的支链序列。这些额外的赖氨酸残基可促进肽溶解度增加。另一种具体衍生物是通过将肽与白喉毒素(dt)缀合。这可以通过添加c末端半胱氨酸残基来促进。
[0109]
额外的氨基酸序列可以包括产生融合蛋白的融合伴侣氨基酸序列。举例来说，融合伴侣氨基酸序列可以有助于检测和/或纯化分离的融合蛋白。非限制性实例包括金属结合(例如聚组氨酸)融合伴侣、麦芽糖结合蛋白(mbp)、蛋白a、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、荧光蛋白序列(例如gfp)、诸如myc、flag和血凝素标签等表位标签。
[0110]
其他额外的氨基酸序列可以是载体蛋白的，例如白喉类毒素(dt)或其片段，或者例如国际公开wo2017/070735所述的crm蛋白片段。
[0111]
本发明考虑的其他衍生物包括但不限于对侧链修饰、在肽或蛋白质合成过程中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交联剂和其他对本发明的免疫原性蛋白质、片段和变体施加构象限制的方法。
[0112]
在这方面，对于涉及蛋白质的化学修饰的更广泛方法，技术人员可参考current protocols in protein science(蛋白质科学最新方案),eds.coligan et al.(john wiley&sons ny 1995-2008)的第15章。
[0113]
分离的m蛋白、超抗原蛋白、片段和/或衍生物可以通过本领域已知的任何方式产生，包括但不限于化学合成、重组dna技术和蛋白水解切割，以产生肽片段。
[0114]
化学合成包括固相合成和溶液相合成。尽管参考了synthetic vaccines ed.nicholson(blackwell scientific publications)的第9章和current protocols in protein science eds.coligan et al.,(john wiley&sons,inc.ny usa 1995-2008)的第15章中提供的化学合成技术的实例，但是这类方法在本领域中是众所周知的。在这方面，还参考国际公开wo 99/02550和国际公开wo 97/45444。
[0115]
使用例如以下所述的标准方案，本领域技术人员可以方便地制备重组蛋白：sambrook et al.,molecular cloning.a laboratory manual(分子克隆实验室手册)(cold spring harbor press,1989)，特别是第16和17部分；current protocols in molecular biology(分子生物学最新方案)eds.ausubel et al.,(john wiley&sons,inc.ny usa 1995-2008)，特别是第10和16章；以及current protocols in protein science(蛋白质科学最新方案)eds.coligan et al.,(john wiley&sons,inc.ny usa 1995-2008)，特别是第1、5和6章。通常，重组蛋白制备包括在适当的宿主细胞中表达编码蛋
白的核酸。
[0116]
本发明的某些方面和实施方案涉及结合m蛋白、超抗原蛋白、片段和/或衍生物或针对m蛋白、超抗原蛋白、片段和/或衍生物而产生的重组抗体和抗体片段，以施用于哺乳动物，来针对诸如stss等a群链球菌相关疾病或疾病状况进行被动免疫。在具体实施方案中，如上文所述，重组抗体和抗体片段是“人源化的”。因此，本发明的一些方面提供了一种或多种分离的核酸，其编码结合m蛋白、超抗原蛋白、片段和/或衍生物或针对m蛋白、超抗原蛋白、片段和/或衍生物而产生的重组抗体和抗体片段。
[0117]
如本文所用，术语“核酸”表示单链或双链dna和rna。dna包括基因组dna和cdna。rna包括mrna、rna、rnai、sirna、crna和自催化rna。核酸也可以是dna-rna杂交体。核酸包含核苷酸序列，核苷酸序列通常包括核苷酸，核苷酸包含a、g、c、t或u碱基。但是，核苷酸序列可以包括诸如修饰的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和修饰的嘧啶(例如硫代尿苷(thiouridine)和甲基胞嘧啶)等其他碱基。
[0118]
在优选的形式中，一种或多种编码m蛋白片段、其变体或衍生物的分离的核酸和促进恢复或增强中性粒细胞活性的药剂为基因构建体形式。
[0119]
适当的是，基因构建体为本领域很好地理解的质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的形式，或包含它们。基因构建体也可以适合分离的核酸在细菌或其他宿主细胞中的维持和繁殖，以便通过重组dna技术进行操作。
[0120]
为了蛋白质表达的目的，基因构建体是表达构建体。适当的是，表达构建体包含与表达载体中的一个或多个额外的序列，例如异源序列可操作连接的一种或多种核酸。“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体，例如质粒，或者是整合到宿主基因组中的载体。
[0121]“可操作地连接”是指所述额外的核苷酸序列优选相对于本发明的核酸地定位，以启动、调节或以其他方式控制转录。
[0122]
调节核苷酸序列通常会适合需要表达的宿主细胞或组织。对于多种宿主细胞而言，多种类型的合适的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。
[0123]
通常，所述一个或多个调节核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。本发明考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。表达构建体还可包括编码融合伴侣(通常由表达载体提供)的额外核苷酸序列，从而本发明的重组蛋白被表达为融合蛋白，如上所述。
[0124]
在优选形式中，基因构建体通过编码本文所述的m蛋白和/或超抗原而适合诸如人等哺乳动物的dna接种。在这方面，应当理解，为了接种疫苗的目的，可以在相同或不同的基因构建体中编码m蛋白和超抗原蛋白。
[0125]
适当的是，基因构建体为本领域很好地理解的质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的形式，或包含它们。基因构建体也可以适合分离的核酸在细菌或其他宿主细胞中的维持和繁殖，以便通过重组dna技术进行操作。
[0126]
适当的是，dna接种疫苗是通过一种或多种质粒dna表达构建体进行的。质粒通常包含病毒启动子(例如sv40、rsv或cmv启动子)。可以包含内含子a以改善mrna稳定性，从而增加蛋白质表达。质粒还可以包括多个克隆位点、强聚腺苷酸化/转录终止信号，例如牛生长激素或兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列。质粒还可以包含带有或不带有hiv rev包膜表达增
加的mason-pfizer猴病毒顺式作用转录元件(mpv-cte)。其他可改善表达的修饰包括插入增强子序列、合成内含子、腺病毒三连前导分子(tripartite leader,tpl)序列和/或对聚腺苷酸化序列和/或转录终止序列的修饰。dna疫苗质粒的非限制性实例是可从invivogen商购的pvac。
[0127]
描述dna疫苗学的有用参考文献是dna vaccines,methods and protocols,second edition(dna疫苗、方法和方案，第二版)(volume 127of methods in molecular medicine series,humana press,2006).
[0128]
如上所述，本发明提供了预防或治疗哺乳动物的诸如链球菌中毒性休克综合征(stss)等a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况的组合物、疫苗和/或方法。
[0129]
在本发明的上下文中，“a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况”是指由a链球菌感染引起的任何临床病理，包括蜂窝组织炎、丹毒、脓疱病、猩红热、诸如急性咽炎等咽喉感染(“链球菌性咽喉炎”)、菌血症、链球菌中毒性休克综合征(stss)、坏死性筋膜炎、急性风湿热和急性肾小球肾炎，但不限于此。
[0130]
stss主要由超抗原毒素引起，该毒素与人mhc ii分子(在肽结合沟之外)和t细胞受体可变链非特异性结合，导致多克隆t细胞激活，通常>20％的cd20+t细胞被激活。这会导致th1细胞因子风暴，这是造成低血压和多器官衰竭(包括肝脏、肾脏、凝血系统和呼吸系统)的提议的因果关系。
[0131]
适当的是，所述组合物和/或方法“被动免疫”哺乳动物以抵御a群链球菌，或特别是抵御stss。因此，施用结合a群链球菌m蛋白片段或其变体的抗体或抗体片段和结合a群链球菌超抗原片段或其变体的抗体或抗体片段的组合，可以赋予、提供或促进抵御随后a群链球菌感染的至少部分被动免疫，或者可以赋予、提供或促进对现有a群链球菌感染的至少部分被动免疫。还应当理解，“被动免疫”不排除引发宿主哺乳动物免疫应答的至少一些元件，例如诱导补体级联的元件，诱导先天免疫系统的元件，例如巨噬细胞和其他吞噬细胞，和/或诱导细胞因子、生长因子、趋化因子和/或其他促炎分子。
[0132]
适当的是，被动免疫治疗或预防哺乳动物的a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况，例如包括链球菌中毒性休克综合征(stss)的igas疾病。
[0133]
如本文所用，“治疗(treating)”、“治疗(treats)”或“治疗(treatment)”是指在诸如stss等a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况已经开始发展后，至少部分地改善、消除或减轻其症状或病理体征的治疗干预。治疗不一定绝对有利于哺乳动物。可以使用普通技术人员已知的任何方法或标准来确定有益效果。
[0134]
如本文所用，“预防(preventing)”、“预防(prevents)”或“预防(prevention)”是指在感染或暴露于a群链球菌之前和/或在诸如stss等a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况的症状或病理体征发作之前开始的作用过程，以预防感染和/或减轻症状或病理体征。应当理解，这种预防不一定绝对有利于个体。“预防”治疗是施用于未表现出a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况的体征或仅表现出早期体征的个体的治疗，目的是降低发展a群链球菌相关疾病、病症或疾病状况的症状或病理体征的风险。
[0135]
在某些方面和实施方案中，可以将结合a群链球菌m蛋白片段或其变体的抗体或抗体片段和结合a群链球菌超抗原片段或变体的抗体或抗体片段单独或组合施用于哺乳动物。
[0136]“单独”是指分别作为离散单位施用，所述离散单位分别包含结合a群链球菌m蛋白片段或其变体的抗体或抗体片段和结合a群链球菌超抗原片段或变体的抗体或抗体片段，或所述离散单位以保持各自抗体或抗体片段的组合或协同功效的方式暂时在空间上分离。
[0137]
在一些实施方案中，可以以组合物的形式施用结合a群链球菌m蛋白片段或其变体的抗体或抗体片段和结合a群链球菌超抗原片段或变体的抗体或抗体片段。
[0138]
组合物在优选的形式中包含可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0139]“可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指可以安全地用于全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。根据特定的给药途径，可以使用本领域众所周知的多种载体、稀释剂和赋形剂。这些可以选自包括以下的组：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐(例如矿物酸盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐)、有机酸(例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)、水和无热原水。
[0140]
描述可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是remington’s pharmaceutical sciences(雷明顿药物科学)(mack publishing co.n.j.usa,1991)，其通过引用并入本文。
[0141]
适当的是，本文所述的m蛋白和/或超抗原蛋白，包括其片段、变体和衍生物，是免疫原性的。在本发明的上下文中，如本文所用，术语“免疫原性的”表示，在向哺乳动物施用免疫原性蛋白质或肽后，例如针对a群链球菌或其分子组分(例如m蛋白或超抗原)产生或引发免疫应答的能力或潜力。
[0142]“引发免疫应答”是指引起或刺激免疫系统的一种或多种元件的产生或活性，包括细胞免疫系统、抗体和/或天然免疫系统。适当是，免疫系统的一种或多种元件包括b淋巴细胞、抗体和中性粒细胞。
[0143]
优选地，出于引发免疫应答的目的，某些免疫剂可以与m蛋白、其片段、变体或衍生物(例如j8肽)和/或超抗原蛋白、片段、变体或衍生物(例如spea和spec)或与一种或多种编码这些蛋白、片段、变体或衍生物的基因构建体组合使用。
[0144]
术语“免疫剂”在其范围内包括本领域众所周知的载体、递送剂、免疫刺激剂和/或佐剂。如本领域会理解的，免疫刺激剂和佐剂是指或包括一种或多种增强组合物的免疫原性和/或功效的物质。合适的免疫刺激剂和佐剂的非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或其他植物或动物来源的油)；嵌段共聚物；去污剂，例如80；a，矿物油，例如drakeol或marcol，植物油，例如花生油；棒状杆菌(corynebaceterium)衍生的佐剂，例如短棒状杆菌(corynebacterium parvum)；丙酸杆菌(propionibacterium)衍生的佐剂，例如痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acne)；牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)(卡介苗(bacille calmette and guerin)或bcg)；百日咳博德氏杆菌(bordetella pertussis)抗原；破伤风类毒素；白喉类毒素；表面活性物质，例如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、双十八烷基二甲基溴化铵、n,n-二十八烷基-n
′
,n
′
双(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和复合多元醇(pluronic polyol)；多胺，例如吡喃、葡聚糖硫酸酯、聚肌苷酸-聚胞苷酸卡波普(poly ic carbopol)；肽，例如胞壁酰二肽及其衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽(tuftsin)；油乳剂；以及矿物凝胶，例如磷酸铝、氢氧化铝或明矾；白介素，例如白介素2和白介素12；单核因子，例如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素，例如γ干扰
素；免疫刺激性dna，例如cpg dna；组合物，例如皂苷氢氧化铝或quil a氢氧化铝；脂质体和佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成的糖肽，例如胞壁酰或其他衍生物；阿夫立定(avridine)；脂质a衍生物；葡聚糖硫酸酯；单独或与磷酸铝一起的deae葡聚糖(deae-dextran)；羧聚乙烯(carboxypolymethylene)，例如carbopol'ema；丙烯酸共聚物乳液，例如neocryl a640(例如，美国专利第5,047,238号)；油乳化剂包水，例如montanide isa 720；脊髓灰质炎病毒、牛痘或动物痘病毒蛋白；或其混合物。
[0145]
免疫剂可包括载体，如甲状腺球蛋白；白蛋白，例如人血清白蛋白；破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(pseudomonas)、e.coli、葡萄球菌(staphylococcus)和链球菌(streptococcus)的毒素、类毒素或任何突变交叉反应材料(crm)；聚氨基酸，例如聚(赖氨酸:谷氨酸)；流感；轮状病毒vp6、细小病毒vp1和vp2；乙肝病毒核心蛋白；乙肝病毒重组疫苗等。或者，可以使用载体蛋白或其他免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以使用细菌毒素、类毒素或crm的t细胞表位。在这方面，可以参考美国专利第5,785,973号，其通过引用并入本文。
[0146]
考虑了用于生产疫苗组合物的任何合适程序。示例性程序包括new generation vaccines(新型疫苗)(1997,levine et al.,marcel dekker,inc.new york,basel,hong kong)描述的那些程序，其通过引用并入本文。
[0147]
可以采用任何安全的给药途径，包括口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌肉内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、局部、粘膜和经皮给药，但不限于此。
[0148]
剂型包括片剂、分散剂、悬浮剂、注射剂、溶液剂、糖浆剂、锭剂、胶囊、鼻用喷雾剂、栓剂、气雾剂、经皮贴剂等。这些剂型还可以包括注入或植入专门为此目的设计的控释装置，或经修饰以这种方式另外起作用的其他形式的植入物。可以通过用疏水聚合物涂覆来实现控释，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物，例如羟丙基甲基纤维素。另外，可通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现控释。
[0149]
可以将组合物呈现为离散单位，例如胶囊、小药囊、功能性食品/饲料或片剂，每个离散单位均含有预定量的一种或多种本发明的治疗剂，呈现为粉剂或颗粒剂，或呈现为溶液或水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液中的悬浮液。这类组合物可以通过任何药学方法制备，但是所有方法都包括使一种或多种如上所述的药剂与构成一种或多种必要组分的载体结合的步骤。通常，通过将本发明的药剂与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后，如果需要，将产品成形为所需的外观，来制备组合物。
[0150]
可以以与剂型相容的方式和有效量施用上文的组合物。在本发明的上下文中，施用于患者的剂量应足以在适当的时间段内对患者产生有益反应。待施用的药剂的量可以取决于待治疗的个体，包括其年龄、性别、体重及总体健康状况、会取决于执业医生的判断的因素。
[0151]
如本文中通常使用的，术语“患者”、“个体(individual)”和“个体(subject)”在本文所公开的治疗或组合物的任何哺乳动物接受者的背景下使用。因此，本文公开的方法和组合物可具有医学和/或兽医学应用。在优选的形式中，哺乳动物是人。
[0152]
为了使本发明可以被完全理解并付诸实践，参考下述非限制性实施例。
实施例
[0153]
引言
[0154]
当考虑基于抗体的被动免疫疗法时，人们认识到，在发生侵袭性疾病的个体中，表面m蛋白(和超抗原)的抗体明显较低[9]，而且一般人群中抗体水平低可能导致了二十世纪八十年代开始的侵袭性疾病的流行[10,11]。然而，在侵袭性感染之前确定个体中的抗体是否低，或者在感染开始后确定是否由于抗体分解代谢而导致抗体变低，是不可能的。我们推论，解决这个问题的直接方法是使用stss模型，在该模型中，可以对动物进行接种、攻击或感染和治疗。我们已经开发了基于m蛋白的高度保守片段的gas疫苗(在[12]中进行了综述)。该抗原称为j8，其序列复制m蛋白c3重复序列的12个氨基酸。接种与白喉类毒素(j8-dt)偶联的j8疫苗诱导出不管m类型如何都体外调理gas且可保护小鼠免受腹膜内和皮肤攻击的抗体[13-16]。但是，由于正常小鼠对超抗原不敏感(由于小鼠mhc ii分子对超抗原的亲和力极低)，因此尚不清楚这种疫苗是否会预防stss。本文公开的工作提供了合适的鼠模型，该模型使用j8的抗体以及spea和spec的抗体作为感染后的治疗选项来测试j8 gas疫苗作为感染前的预防措施和被动免疫疗法。
[0155]
材料和方法
[0156]
sn1
→
sn4是从2015年大约同时在布里斯班发展了stss的四名成年人的血液(x3)或伤口拭子(x1)中采集的临床gas分离株。四名患者中的两名死于他们的疾病。这些生物培养在我们的实验室中，sn1用于建立初步数据集(如下)。重组spec(rspec)通过商业渠道购自toxin tech(usa)，并用于体外实验，以在小鼠中产生抗spec抗体。hla转基因b6小鼠(“hla-b6”)表达hla-dr3和hla-dq2[17]。
[0157]
这些生物都是emm 89类型。使用genelute细菌gdna提取试剂盒(sigma)从过夜稳定期培养物中提取基因组dna。使用nanodrop1000证明gdna合格，然后使用2g gdna扩增所有已知的超抗原基因。sds-page证明，sn1
→
4均含有spec基因。它们对speg和smez也是阳性的，但对spes、a、l、m、h、i、j、k和ssa是阴性的。
[0158]
结果
[0159]
我们发现，hla-b6小鼠在用非小鼠适应性gas菌株感染皮肤后可发展igas疾病(图1a-b)。相比之下，gas菌株需要通过连续传代来适应，才能在正常非人源化小鼠中引起igas疾病。这可能与超抗原赋予gas的生存优势[18]和超抗原的刺激作用需要人mhc ii分子有关。因此，hla-b6小鼠对于stts建模应该是理想的。然而，在感染分泌spec的gas后，balb/c(非hla转基因)小鼠在感染后第6天显示其血清中存在spec毒素(图1c)。对该含毒素的血清进行无菌过滤，并用作体外和体内测定的试剂。用sn1和不表达超抗原的c群链球菌(ns33)感染hla-b6和野生型对照c57/bl6(b6)小鼠。在感染后第6天收集来自感染小鼠的合并血清样品，并在4-15％的梯度sds-page凝胶上运行。从凝胶中转移蛋白质后，用一抗即兔抗spec igg(toxin-tech,usa)探测膜，然后用绵羊抗兔igg-ap(sigma-aldrich)进行检测，并使用bcip/nbt底物(sigma-aldrich)显影。还运行rspec蛋白，作为阳性对照。在sn1感染小鼠的血清中检测到spec，而来自ns33感染小鼠的血清未显示存在毒素(图1d)。
[0160]
将来自感染balb/c小鼠的含rspec的血清或spec添加到b6或hla-b6小鼠的脾细胞培养物中。我们观察到，在存在来自感染小鼠的血清或存在rspec，但不存在来自c群链球菌(ns33)感染小鼠的血清的情况下，hla-b6脾细胞(但不是来自b6小鼠的脾细胞)显著增殖
(图2a)。抗rspec抗体几乎完全阻断了增殖，表明sn1中存在的其他超抗原发挥了最小的活性(图2a)。当测量tnf和ifn-γ的分泌时，我们观察到类似的反应(图2b-c)。也将来自感染的balb/c小鼠的血清或rspec添加到三名健康成人志愿者的外周血单核细胞(pbmc)中。我们观察到所有供体中的淋巴细胞均针对来自sn1感染小鼠的血清但不是针对来自s33感染小鼠血清，以剂量应答的方式(低至每孔5μl)显著增殖。在每孔20μl的sn1血清时，淋巴细胞的增殖类似于促分裂原pha诱导的增殖。抗rspec抗体阻断了增殖。这些数据表明，sn1表达的spec能够非特异性激活hla人源化小鼠和人的淋巴细胞，这与已知的stss发病机理一致。数据还表明，hla-b6小鼠可用于stss建模。
[0161]
经由j8接种预防小鼠stss。为了确定接种j8-dt是否会预防stss，我们首先询问它是否会预防由sn1引起的皮肤和igas疾病。用j8-dt/alum对hla-b6小鼠进行肌内接种(x3)将皮肤、血液和脾脏中的细菌负荷减少了10,000至10,000,000倍(图3a)。对攻击后第6天采集的血清进行蛋白质印迹分析证明了对照(pbs)小鼠血清中的spec，而不是j8-dt接种的小鼠的血清中(图3b)。
[0162]
然后，我们测试了来自j8-dt接种的sn1感染小鼠的血清是否会激活从健康志愿者采集的pbmc。我们观察到，来自非接种小鼠的血清在3个个体中的3个中引起了稳健增殖(高达pha诱导水平的50％)，但是来自接种小鼠的血清导致的增殖明显较少。显示了来自2个个体的代表性数据(图3c-d)。同样，rspec的抗血清显著降低了来自sn1感染小鼠的血清引起的增殖反应。然而，此外我们还观察到，添加到来自j8-dt接种的hla-b6小鼠的血清中的抗rspec抗血清(10-20μl)导致的增殖并不大于背景水平(si～1；p<0.05-0.01)。
[0163]
被动免疫疗法的开发。目标是开发由spea/c的抗体和j8的抗体组成的组合被动免疫疗法。我们的初步数据表明，当以0.05μg/ml、0.5μg/ml和5μg/ml添加毒素时，来自用rspec免疫的balb/c的小鼠的血清可以完全阻断rspec对人pbmc的促有丝分裂作用(图4)。该抗血清低至每孔5μl的水平时是有效的。
[0164]
在本实施例中，我们还证明了j8-抗血清限制stss发展的能力，但我们已证明来自正常小鼠的j8-抗血清(主要是igg1)可以迅速减少受体动物中的细菌生物负荷(图5a)。但是，我们的数据表明，抗spec抗体和抗j8抗体的组合是优越的，因为它们中和spec和m蛋白，并且通过包括抗j8抗体，它们还从循环中去除细菌。我们还看到，感染后5天施用于balb/c小鼠的抗spec抗血清可以在给药的6小时内中和spec(图5b)。但是，这种治疗并不能导致皮肤细菌负荷减少(图5c)。
[0165]
进一步建议的研究
[0166]
我们已经证明，在感染非小鼠适应性gas菌株后igas疾病可以在hla-b6小鼠中发展，并且来自hla-b6小鼠的淋巴细胞以与stss发病机理一致的方式对sn1 gas的spec作出反应。为了扩展研究，我们首先要问的是，我们的收集物中具有且根据基因组筛选获知是spec pos(表1)的其他gas菌株是否也会激活来自hla-b6小鼠的淋巴细胞。我们会通过蛋白质印迹法确定感染了4种其他spec pos gas菌株的hla-b6小鼠的血清中存在spec。然后，将来自非感染的hla-b6小鼠(n＝5/gas分离株)的脾细胞与rspec或来自感染了不同spec-pos菌株的小鼠的血清一起培养。会如上所述测量淋巴细胞增殖和分泌的tnf和ifn-γ。简而言之，会用来自spec pos gas感染小鼠的浓度预先优化的血清刺激原初脾细胞。72小时后，会通过[3h]胸苷摄取来测量增殖。会使用cba试剂盒(bd biosciences)测试无细胞培养物上
清液的各种细胞因子。正常小鼠血清(nms)和来自超抗原neg ns33 c群链球菌感染小鼠的血清会用作阴性对照。实验会重复至少两次，我们还会收集gas临床样品，并在这些样品可用时对其进行测试。
[0167]
spec是gas的两种主要超抗原之一，另一种是spea。我们同样会测试5种不同spea pos gas菌株(表1)和新样品(gas分离株和来自stss患者的血清)激活来自hla-b6小鼠的脾细胞的能力。
[0168]
已知spea与hla dr4和dq8结合[18]。但是，它也与dr3和dq2结合，这表明我们目前拥有的hla-b6小鼠适合用带有spea的gas进行stss研究。我们会使用rspea作为阳性对照。它会从美国toxintech购买。
[0169]
我们之前已经开发了皮肤攻击模型[14]。通过将链球菌局部接种到轻微擦伤的皮肤上，该模型可以紧密复制人化脓性皮病。鉴于大多数stts病例都从皮肤开始，因此，这是理想的攻击模型。可以通过对小鼠实施安乐死并估算均质切下的皮肤中的菌落数来准确量化细菌负荷。通过对血液和均质的脾脏样品铺平板来测定侵袭性细菌负荷。使用这种模型，我们已经证明，对不同品系的正常小鼠用j8-dt/alum进行肌内接种(x3)可以以血清型非依赖性方式预防gas化脓性皮病和igas疾病。
[0170]
在第0、21和42天会用j8-dt/alum(或pbs/明矾作为对照)对hla-b6小鼠进行接种(肌肉内x3)。接种后2周，会用5种不同的spea pos和5种不同的spec pos gas菌株经皮肤攻击小鼠。使用15只动物的组规模。会在9天的过程中观察小鼠的临床疾病体征。在攻击后第3、6和9天，会通过对指定数量的小鼠(每组n＝5小鼠)实施安乐死，来估计皮肤、血液和脾脏中的细菌负荷。会用在各个时间点采集的血液的血清样品通过蛋白质印迹确定spea和spec的存在。如先前所述[19]，会研究肝酶水平升高(作为肝损伤的指标)的存在。会对来自接种的小鼠和对照小鼠的血清进行无菌过滤，并测试其刺激淋巴细胞增殖和来自hla-b6小鼠和人pbmc的脾细胞分泌细胞因子的能力。[3h]胸苷摄取测定和cba试剂盒会分别用于测量增殖和细胞因子分泌。
[0171]
因此，我们会获得三种防御stss的读数：(i)接种的感染小鼠的临床分析和血清学分析；(ii)在与来自接种的小鼠与对照小鼠的过滤血清一起孵育后，防止体外刺激来自hla-b6小鼠的脾细胞；以及(iii)在与来自接种的小鼠与对照小鼠的过滤血清一起孵育后，防止刺激来自正常人志愿者的pbmc。
[0172]
已经证明，ivig显著提高stss的存活率，这归因于链球菌超抗原抗体的存在。另外，已经提出超抗原和m蛋白的天然获得的抗体负责防御stss。
[0173]
我们会在用spea pos gas和spec pos gas感染hla-b6小鼠后，测试抗spea/c和抗j8抗体的组合，以防御链球菌生物负荷和spea/c介导的淋巴细胞刺激。首先，实验会在没有抗生素辅助疗法(co-therapy)的情况下进行。会产生针对spea、spec和j8的单克隆抗体。对于单克隆抗体的产生，超抗原蛋白spea和spec会从美国佛罗里达的toxin technology inc.以商业方式获得。我们的初步数据表明，抗j8抗血清(igg1同种型)可以在48小时内将受体小鼠的细菌生物负荷降低近1000倍(图5a)，并且感染后6天向balb/c小鼠施用的抗spec抗血清可以在给药6h内中和spec(图5b)。但是，抗spec抗血清治疗并不能减少皮肤细菌负荷，这表明需要j8抗体的调理活性(图5c)。会测试igg1单克隆抗体与重组超抗原和j8的抗血清。将活性定义为在治疗24小时后感染小鼠血清wb上不存在26kda的超抗原条带(对
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[0201]
实施例2
[0202]
引言:
[0203]
轻度链球菌感染似乎可以迅速升级为严重的侵袭性感染，死亡率很高。据报道，在发达国家，侵袭性a群链球菌疾病(isd)的总发病率为每100,000人中2-4例。但是，这些数据大多数来自1996年至2007年间进行的多次调查[1,2]。美国的一项涵盖2005-2012年的研究表明了稳定比率为每100,000人3.8例[3]。以前曾在多个国家描述过周期性的发病率激增，但最近的报告显示整个加拿大的发病率令人担忧且持续增加，尤其是从2013年起(加拿大公共卫生局(public health agency of canada))。在亚伯达(alberta)，该比例已经从2003年的每100,000人4.2例急剧上升到2017年的每100,000人10.2例[4]。据报告，年轻人和老年人，特别是来自发展中国家的年轻人和老年人中比例很高。例如，据报告，2007年土著斐济人的发病率约为幼儿中的每100,000人中有60例，老人中每100,000人75例[2]。当前全球的真实发病率尚不清楚，但可用数据表明发病率明显高于所报告的这些发病率。
[0204]
在大约20％的病例中，即使设施最齐全，isd仍伴有链球菌毒性休克综合征(stss)，并伴有多器官衰竭，病死率超过40％。它可以在任何链球菌感染后发生，但最常见于皮肤感染后发生，并且通常与坏死性筋膜炎、肌炎或深瘀伤有关。怀孕和产褥期是过度风险期，尤其是在发展中国家[6]。
[0205]
链球菌的“超抗原”(sag)被认为在stss的发病机理中起着关键作用。这些外毒素由所有致病性酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌菌株分泌[7]。11个链球菌sag基因中有9个位于噬菌体中。噬菌体编码的链球菌致热外毒素(spe)a和spec是大多数stss病例的原因。sag具有来源于其与人mhc(hla)ii类分子(在肽结合沟之外)和t细胞受体链的保守区非特异性结合的强大免疫效力，从而导致多克隆t细胞激活，经常>25％的cd4+t细胞被激活。由此导致的th1细胞因子风暴是造成低血压和定义stss的多器官衰竭的因果关系。这导致sag的类毒素被提议作为候选疫苗[8,9]。但是，尚不完全了解stss的发病机理。其他链球菌毒力因子，包括slo[10]、肽聚糖、脂蛋白酸[11,12]和m蛋白[13]已被证明是体外炎性细胞因子的有效诱导剂，这些因子或其他因子可能在stss起重要作用，并且是成功开发疫苗和免疫疗法的关键。
[0206]“j8”是基于m蛋白高度保守的c-3重复区域的候选疫苗。它可以通过抗体介导的中性白细胞调理性吞噬作用保护小鼠免受皮肤、粘膜和腹膜内链球菌败血症的侵害[14-16]。当与白喉类毒素(dt)缀合时，它在非人灵长类动物[17]和人[18]中具有免疫原性，目前正
进行进一步的临床试验以研究免疫原性和功效。
[0207]
在本实施例中，将hla dr3 dq2转基因小鼠用于stss建模，并询问接种j8是否可以预防stss样疾病，以及用j8和spec特异性抗体进行的被动免疫疗法是否可以治疗已建立的stss。数据表明了sag和m蛋白在发病机理中的关键作用，并表明二者的抗体协同作用，完全抵消了疾病的临床体征以及从死于stss的患者中分离的a群链球菌生物的相关有效促有丝分裂活性。
[0208]
结果
[0209]
建立stss的人性化小鼠标模型
[0210]
sn1是2015年从布里斯班一名患有stss并死于该病的患者的血液中分离的酿脓链球菌的emm 89菌株。基因组分析表明，来自所有检查过的已知11种链球菌sag基因的sn1都表达噬菌体编码的spec基因，以及染色体编码的smez和speg基因(图15)。该生物是spea阴性的。另一a群链球菌(ns33)(从皇家达尔文医院的患有足溃疡患者的分离)不表达任何sag基因。
[0211]
使balb/c小鼠经皮肤划痕感染sn1或ns33。这些小鼠发展了皮肤感染，但没有发展全身感染，并且也没有生病。但是，通过蛋白质印记(wb)分析确定，从sn1感染的小鼠收集的血液样品是spec毒素阳性的。在感染ns33的小鼠血液中未检测到spec(图6a-c)。
[0212]
将来自经皮肤感染sn1的balb/c小鼠的血清或来自e.coli的重组spec(recspec)蛋白添加到b6或hla转基因b6脾细胞培养物中。我们观察到，对于血清和recspec，来自hla-b6小鼠(而非b6小鼠)的脾细胞显著增殖(图7a)。抗recspec抗体并未完全阻断了增殖，这表明sn1中存在的其他分子发挥了某些促有丝分裂活性(图7a)。tnf和ifn的产生反映了增殖反应，这两个关键细胞因子与stss发病机理有关(图7b-c)。来自ns33感染小鼠的血清在来自hla-b6或b6小鼠的脾细胞中均未诱导任何增殖。
[0213]
当将来自感染的balb/c小鼠的血清或recspec添加到来自三名健康成人志愿者的外周血单核细胞(pbmc)中时，证实了这些反应与人的相关性。我们观察到所有供体中的淋巴细胞均针对来自sn1感染的小鼠的血清，但不是来自ns33感染的小鼠的血清，以剂量应答的方式(低至每孔5μl)显著增殖(图17)。我们还观察到，sn1感染的小鼠的第6天血清引起的人淋巴细胞的增殖最大(图7d-f)，这与当时血清中存在spec毒素有关(图6c)。这些数据表明，sn1表达的spec能够非特异性激活来自hla-b6小鼠和人的淋巴细胞，这与已知的stss发病机理一致。
[0214]
接下来，我们评估了hla-b6中sn1的临床毒力。用不同剂量的sn1(106、107或108cfu)腹膜内感染小鼠。感染后24小时，在感染1x10
6 cfu的小鼠的血清中检测到spec(图8a)。这时，它们表现出临床症状(图8b)，并被安乐死(根据批准的伦理委员会协议)。评估血液和脾脏中的细菌负荷(图8c)。我们观察到剂量依赖性感染结果，其临床评分与细菌负荷直接相关(图8b-c)。在感染小鼠的血清中检测到高水平的tnf、ifn-和il-2(图9d-f)。
[0215]
我们询问hla-b6小鼠的皮肤感染是否还会引起stss样病理。在用1x10
6 cfu感染后第6天，与b6小鼠相比，hla-b6小鼠的皮肤病灶细菌负荷明显更高(图9a)。这些细菌还发展了败血症，尽管细菌负荷远低于经腹膜内途径感染的小鼠(图9b)。在hla-b6和b6小鼠中感染ns33导致适度局部感染(10
3-104cfu/皮肤病灶)，但没有败血症(图9a-b)。在它们的血液中检测到spec(图9c)，该血液还含有高水平的tnf、ifn-和il-2。hla-b6小鼠皮肤感染
ns33和b6小鼠皮肤感染sn1或ns33均未导致细胞因子诱导(图9d-f)。
[0216]
stss的疫苗预防
[0217]
已经证明hla-b6小鼠在浅表或全身感染sn1后发展了stss样病理，我们询问这是否可以通过接种与白喉类毒素偶联且与alum一起施用的j8(j8-dt/alum)来预防。接种的小鼠在用sn1进行皮肤攻击感染后表现出皮肤、血液和脾脏细菌负荷减少了1000-1,000,000倍(p值分别为<0.05，<0.001和<0.01)(图10a)。在接种了pbs的对照小鼠的血清中检测到spec，但是在接种了j8-dt的小鼠的血清中未检测到spec(图10b)。在对照小鼠的血清中还检测到th1细胞因子ifn-和tnf，而在受保护的小鼠的血清中发现th2细胞因子il-4和il-10(图10c、d)。
[0218]
将来自j8-dt接种并感染的小鼠和对照(pbs接种/感染)小鼠的过滤血清或recspec添加到来自3名健康个体的人pbmc的培养物中。来自pbs接种/感染的小鼠的血清引起了来自所有个体的pbmc的稳健增殖(高达pha诱导水平的50％)。这主要是由于血清中存在细菌spec，因为添加recspec抗血清以剂量依赖性方式将t细胞激活水平降低了80-90％(图10e-g)。与来自pbs接种/感染的小鼠的血清相比，来自j8-dt接种/感染的小鼠的血清引起的细胞增殖明显更少(减少90-95％)，并且通过添加recspec抗血清将其进一步降低至背景水平(刺激指数为约1)；p＜0.05-0.01)(图10eg)。这表明，在j8-dt接种/感染的小鼠的血清中仍然存在残留的spec，即使根据wb的检查这不明显(图10b)。与增殖数据一致，与来自pbs接种/感染的小鼠的血清产生细胞因子相比，来自j8-dt接种/感染的小鼠的血清对炎性细胞因子(ifn-γ、tnf、il-2、il-6、il-17)的pbmc诱导被显著降低(图11)。pbs接种/感染的血清诱导的反应与recspec诱导的反应相当。因此，这些数据表明，链球菌spec导致sn1感染后体外观察到的所有t细胞激活和细胞因子反应的90％以上，并且先前的j8-dt接种可以预防90％以上的由于血清促有丝分裂因子而发生的体外反应。尽管我们先前已经证明，接种j8-dt可以显著减少攻击后的细菌负荷，但图10和图11中的数据并未排除抗j8抗体的单独作用，抗j8抗体可能对sn1的m蛋白具有直接影响并阻断m蛋白可能具有的任何促有丝分裂作用。
[0219]
stss的免疫疗法
[0220]
为了评估recspec抗血清的治疗功效，使hla-b6小鼠经皮肤感染sn1，并在感染后第5天用抗血清(或原初血清)进行治疗。在治疗之前，spec存在于感染小鼠的血清中，但在6小时测量时spec显著降低，且在24小时消失。当在第6h和24h测量时，它存在于对照小鼠中(图12a)。相对于接受原初血清的小鼠，用抗spec抗血清进行治疗不能减少皮肤或血液中的细菌负荷担(图12c)。
[0221]
用1x10
6 sn1细菌腹膜内感染另一组hla-b6小鼠。这些小鼠更迅速生病，并且在感染后18h，当其平均临床评分为10[19]时，向它们静脉内给予200μl spec抗血清、200μl抗j8抗血清、两者的组合或200μl原初血清(图13a)。所有接受j8-dt和/或rspec抗血清的小鼠均在24h内恢复，临床得分显著降低(p<0.01
–
p<0.001；图13b)；但是，我们只在那些接受抗j8抗体(单独或与抗spec抗体组合)的小鼠中观察到血液和脾脏的细菌清除(p<0.01；图13c)，并且仅在那些接受抗rspec抗体(单独或与抗j8抗体组合)的小鼠中察到血液中spec的清除(使用wb检测)(图13d-g)。
[0222]
来自sn1的m蛋白发挥促有丝分裂作用并有助于促炎症反应
[0223]
体外研究进一步阐明了j8-dt和spec特异性抗血清在体内治疗stss样病理的能力。来自sn1感染小鼠的血清对hla-b6脾细胞的促有丝分裂作用被抗spec和抗j8-dt抗血清部分阻断，但被两种抗血清的组合完全阻断(图14b)，这表明在该模型中j8-特异性抗体对stss的治疗具有双重作用：它们清除细菌，但也阻断emm89 m蛋白的促有丝分裂作用。这与抗spec血清具有协同作用。尽管不太可能，但sn1血清可能含有其他含j8交叉反应表位的促有丝分裂因子。因此，我们询问抗j8抗体是否会阻断recm1的促有丝分裂作用。图14c显示recm1和spec均具有促有丝分裂活性(如前所示)，并且两者的作用是累加的。此外，抗j8-dt抗血清完全阻断recm1的促有丝分裂作用。抗j8-dt和抗spec的组合完全阻断m1+spec的组合促有丝分裂活性。这些数据共同表明，抗j8抗体可以阻断两个不同的m蛋白的促有丝分裂活性。数据表明j8表位不具有促有丝分裂活性，仅表明，j8的抗体可以中和m蛋白。其他人认为，m蛋白上的促有丝分裂决定簇位于该蛋白的一半氨基末端中。
[0224]
讨论
[0225]
此处提供的数据表明，在hla人源化小鼠模型中，可以通过接种预防stss样疾病，并通过含有针对j8和spec的抗体的特异性免疫疗法快速治疗已建立的疾病。j8的抗体具有双重作用：它们消除细菌，但也直接阻断m蛋白的促有丝分裂作用，而spec的抗体则阻断该蛋白的活性。，效果在一起是协同的，并且可以完全解决stss样疾病。
[0226]
开发预防stss的疫苗的努力是有限的。一团队已经开发出针对spea和spec的类毒素，并表明对兔子进行接种可以产生中和毒素并保护兔子免受经微型渗透泵施用的天然毒素侵害的抗体。兔子未暴露于链球菌感染[8,9]。尽管这种疫苗方法是有希望的，但为了预防链球菌疾病的仅仅一个方面，它就需要接种多种类毒素来。我们的数据表明，这种方法不会减少细菌性败血症。已使用hla转基因小鼠来证明某些hla类型更倾向于stts[20]，但并未用于链球菌stss的疫苗建模或疗法开发；然而，它们已用于使用金黄色葡萄球菌超抗原的确定的非毒性片段开发候选疫苗[21]。这些小鼠没有受到生物的攻击，而是受到重组sag的攻击。
[0227]
我们基于m蛋白的高度保守片段开发了候选strepa疫苗(在[22]中进行了综述)。该抗原称为j8，其序列复制m蛋白c3重复的12个氨基酸。接种与白喉类毒素(j8-dt)偶联的j8诱导体外调理strepa的抗体，无论m型如何，攻击后均可减少细菌负荷，从而保护小鼠免受腹膜内、皮肤和粘膜攻击[14,16,23-25]。尽管尚未在hla人源化小鼠中测试这种疫苗介导的保护作用，但是假定这种疫苗介导的保护作用会扩展至防御stss。但是，没有假定用抗j8抗体进行的被动免疫疗法可以解决建立的疾病，即使细菌负荷有所减少，因为据信sag在疾病中起着核心作用，并且没有表明j8的抗体会影响血清sag的水平。我们感到惊讶的是，200μl j8免疫血清(有或没有抗spec抗血清)几乎可以消除血液和脾脏中的所有细菌负荷，并可以解决临床评分。我们的数据没有反对spec或sag在stss发病机理中的重要作用，特别是因为抗spec抗体也可以迅速解决临床体征。但是，它们确实证明，疾病表现不只是需要单独的sag。
[0228]
据报道，除sag外，链球菌m蛋白还与促炎症反应有关，导致严重的链球菌感染[26-29]。通过经tlr2刺激单核细胞，m蛋白能够产生大量促炎性细胞因子。通过与中性粒细胞衍生的肝素结合蛋白(hbp)协同作用，m蛋白诱导血管渗漏，并有助于在严重链球菌感染中观察到的病理生理学后果[30]。一些m蛋白，例如m1、m3和m5，一贯与isd和stss的暴发相关
[31-33]。某些血清型中m蛋白(例如m1和m5)的b重复区也可能充当超抗原并促进炎症反应[34]。尽管已报道某些链球菌血清型(区分具有不同表面m蛋白的菌株)与isd相关，但据认为这种关联仅反映了当时普通人群中最常见的血清型[2]。然而，m蛋白可以下调固有免疫和获得性免疫，并可能有助于isd的发病机理。
[0229]
emm89 strepa和spec与isd的关联在最近的许多报道和日本中都已注意到，在日本，emm89是stss病例中发现的第二大主要基因型[35]。
[0230]
已知在发展了侵袭性疾病的个体中，表面m蛋白(和sags)的抗体明显较低[36]，且证明一般人群中的低水平抗体促进了在二十世纪八十年代开始的isd流行[37,38]。但是，无法确定感染前个体中的抗体是否低，或者抗体在感染开始后由于抗体分解代谢而变低。解决这个问题的直接方法是使用stss模型，其中可以对动物进行接种、攻击或感染和治疗。
[0231]
我们发现，毒素的存在与全身感染无关。浅表皮肤感染后在小鼠血液中检测到spec，但是没有可检测的菌血症。这些小鼠确实显示出疾病的病理体征。在临床疾病的某些病例中可以观察到这一体征[39]。我们注意到，浅表皮肤感染后，感染后第6天，在感染的血清中检测到毒素。这表明在感染的初始阶段毒素缓慢释放。这一观察结果与特富龙组织室模型一致，其中，在感染后第7天注意到高水平的spea表达[40]。stss流式ip感染的急性发作非常明显，在感染后24小时内在感染小鼠的血液中检测到毒素，从而导致较高的临床评分。相反，浅表皮肤感染代表了感染的进行性发作。
[0232]
我们在小鼠和人中均证实了与sag的促有丝分裂活性相关的典型病理。来自感染小鼠的血清中spec的量有可能将hla-b6小鼠的脾细胞刺激至与cona或rspec引起的脾细胞相当(如果不是更高的话)的水平。由sn1感染的血清引起的增殖高于由单独的rspec引起的增殖，因此表明涉及sn1感染的血清中存在的其他一些促有丝分裂因子。
[0233]
向感染小鼠的血清中添加抗spec抗血清能够显著抑制增殖反应，从而证实增殖很大程度上是由于spec所致。然而，在治疗组中观察到的残余增殖表明涉及strepa的其他毒力因子，包括其他sag或m蛋白。
[0234]
我们注意到，对hla-b6小鼠进行接种对预防stss有效。值得注意的是，保护机制涉及清除strep a，而不是特异性中和分泌的spec。接种j8-dt显著减少(>90％)局部和全身细菌负荷，从而保护小鼠免受stss相关病理侵害。此外，还显示了来自接种感染小鼠的血清导致来自健康个体的pbmc增殖最小。我们认为，这种影响可能归因于缺乏spec，而且还归因于缺乏血清中通常由于strepa感染而存在的其他因子，并有助于整体疾病结果。
[0235]
被动免疫疗法有望成为治疗stss的手段。已证明静脉内免疫球蛋白(ivig)显著降低stss的病例死亡率[41]。该研究使用了历史对照，但最近一项对67名患者和前瞻性对照进行的瑞典研究中，死亡率为仅接受抗生素治疗的44例患者中的22例(50％)，而接受ivig加抗生素治疗的组中，23例患者中有3例(13％)(p<0.01)[42]。但是，据估计，ivig中超抗原抗体滴度必须大于40，才能获得临床益处。这大约是在ivig中发现的特异性抗体的量，因此推荐这种多剂量ivig。ivig的高昂成本、批次之间的差异[43]和供应困难凸显了对替代辅助疗法的需要。预防所有strepa菌株干扰的疫苗或者在诊断时在使用或不使用生素的情况下给予的特异性抗体会具有更大的实用性。我们发现，rspec抗血清的给药能够中和毒素，但是它不能减少sn1感染的hla-b6小鼠的细菌负荷。该观察结果强调了这样一个事实，即为了治疗个体，会需要多剂量的抗rspec血清，直到确保从系统中完全清除毒素为止。但是，只
要个体携带strepa，就不会消除有关毒素和相关病理的担忧。
[0236]
我们假设，会导致毒素中和以及从系统中清除strepa的组合免疫疗法可能是更好的替代选项。strepa的清除不仅会减少用于毒素中和的持续治疗的需要，而且还会消除其他毒力因子促进stss病理的可能性。与以前的报告一致，我们证明在hla-b6模型中，strepa sag可能不是stss病理生理的唯一决定因素，而strepa的其他毒力因子，包括m蛋白，可能起关键作用。通过使用emm89 strep a分离株，我们能够证明sag spec和strepa m蛋白协同作用，并有助于感染后观察到的临床疾病。j8-dt抗血清在体内中和m蛋白会阻止其与纤维蛋白原相互作用，并阻止其随后经由中性粒细胞上的b2整联蛋白进行识别。结果，没有激活和释放血管渗漏的介质，而这是stss中的关键事件。可能的是，m蛋白的体外中和可能遵循了不同的机制，包括缺乏细胞因子诱导以及此后的炎症反应。
[0237]
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限于任一实施方案或特征的具体集合。在不脱离本发明的广泛精神和范围的情况下，可以对这里描述和示出的实施方案进行各种改变和修改。
[0238]
本文引用的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均通过引用整体并入本文。
[0239]
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