lncRNAAK124826及其相关分子在诊断多发性肌炎/皮肌炎中的应用的制作方法

本发明属于生物技术和治疗领域，具体涉及lncrnaak124826及其相关分子在诊断多发性肌炎/皮肌炎中的应用。

背景技术：

多发性肌炎/皮肌炎(pm/dm)是较常见的自身免疫性疾病，发病过程中cd4+t细胞发挥重要作用，th17/treg细胞数量和功能失衡，但具体发病机制尚不完全清楚。

多发性肌炎和皮肌炎(polymyositisanddermatomyositis，pm/dm)是一种典型的自身免疫性疾病，其主要表现为肌肉组织淋巴细胞浸润、累及横纹肌，血清特征性抗jo-1抗体阳性，近年来pm/dm发病率逐年升高，目前尚无有效根治疗法。pm/dm的发病机理复杂，涉及遗传、感染、免疫功能及microrna异常表达等众多因素，近年来，不断深入研究该病的发病机制，目前认为在+t细胞异常活化，th17细胞因子反应异常，但具体机理尚未完全阐明。pm/dm患者中存在th17表达异常。th17细胞是新发现的cd4+t细胞的亚型。tournadrea等研究发现，pm/dm患者肌肉组织中cd4⁺t细胞阳。tournadrea等研究发现，pm/dm患者肌肉组织中cd4⁺t细胞阳性，il-17表达阳性，th17细胞数量显著增加。

白细胞介素-27(il-27)在调控th17细胞反应中起重要作用。il-27是一种新的il-6/il-12家族细胞因子，主要作用于各种免疫细胞而发挥广泛调节作用，在自身免疫性疾病中扮演重要角色。il-27可以通过下调il-6和tgf-β的表达抑制th17细胞的分化，同时，il-27还可以通过抑制stat1、stat3的磷酸化，调控th17细胞反应。研究发现，多发性硬化急性期患者外周血il-27水平显著降低，il-17水平和th17细胞数量显著增加，il-27和il-17的表达呈显著负相关，初步提示il-27可能通过抑制il-17的分泌，参与多发性硬化的发病。自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型研究中发现，il-27受体ebi3基因敲除，小鼠炎症反应加重，炎症组织中th17细胞数量增多。

技术实现要素：

发明目的：本发明研究发现，pm/dm患者外周血cd4⁺t细胞中th17细胞百分率显著增多，初步结果提示pm/dm患者存在th17细胞表达失调，其机制尚不清楚。本发明研究发现，pm/dm患者外周血il-27表达水平较健康对照者显著降低，但pm/dm患者中il-27的表达如何被调节，及其与th17/treg细胞平衡关系，尚不清楚。

本发明研究发现，lncrnaak124826在pm/dm患者cd4+t细胞中高表达，il-27在pm/dm患者中低表达，芯片网络调控图预测il-27是lncrnaak124826的作用靶点。

因此，我们提出lncrnaak124826通过靶基因il-27影响th17/treg平衡，参与pm/dm的发病。首先观察lncrnaak124826在pm/dm患者中的表达特点；其次，采用慢病毒过表达和干扰技术研究lncrnaak124826对pm/dm患者th17/treg细胞分化的作用机制；第三，验证il-27是lncrnaak124826的功能靶点。本发明为诊断和治疗pm/dm提供新的思路。

本发明以pm/dm患者为疾病组；运动神经元病，重症肌无力，进行性肌肉营养不良，风湿性多肌痛等患者为疾病对照组；肝肾功能指标正常的健康体检者为正常对照组。分离上述研究对象的外周血cd4+t细胞及血清标本。

本发明发现pm/dm患者外周血il-27表达水平较健康对照者显著降低，在明确pm/dm的自身免疫调节机制，找出新的诊断和免疫治疗靶点，以及为研发新的治疗手段提供理论依据。

本发明内容还包括荧光原位杂交(fish)检测各研究组cd4+t细胞lncrnaak124826和il-17共表达。

本发明内容还包括分析各研究组cd4+t细胞内th17/treg细胞的表达、lncrnaak124826、il-27基因和蛋白的表达差异。

本发明内容还包括检测各研究组血清中il-17、tgf-β和肌酸激酶(creatinekinase，ck)的表达情况。

本发明内容还包括综合上述指标及临床资料，分析lncrnaak124826与疾病的关系，以验证lncrnaak124826是否参与pm/dm发病。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了lncrnaak124826在制备预防或治疗多发性肌炎/皮肌炎药物或诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了lncrnaak124826慢病毒过表达载体在制备预防或治疗多发性肌炎/皮肌炎药物或诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了lncrnaak124826的rnai干扰载体在制备预防或治疗多发性肌炎/皮肌炎药物或诊断试剂或试剂盒中的应用。

其中，所述lncrnaak124826的靶点为il-27基因。

其中，所述lncrnaak124826调控il-27、tgf-β和/或肌酸激酶的表达水平。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1、本发明研究发现pm/dm患者外周血中tgf-β和ck表达显著高于健康对照组升高，pm/dm患者外周血cd4+t细胞中th17细胞百分比是(3.24土1.47)％，显著高于健康对照组的(0.82±0.24)％，pm/dm患者外周血cd4+t细胞treg细胞百分比是(3.27土0.45)％，显著低于对照组的(6.78±0.92)％；

2、lncrnaak124826慢病毒过表达载体、rnai干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，免疫荧光表明转染效率达到80％，荧光定量pcr检测过表达和干扰效果，结果表明表达分别上升和下调了5.6、2.2倍。在cd4+cd45ra+t细胞中过表达lncrnaak124826能够显著活化jak-stat和mapk/p38信号通路，降低lncrnaak124826的表达能够显著抑制上述信号通路，lncrnaak124826过表达组th17细胞比例显著增加，同时treg细胞显著减少；

3、lncrnaak124826可显著降低野生型il-273’utr的报告基因活性，表达下调30％左右，rna免疫共沉淀实验验证il-27为lncrnaak124826的功能靶点。干扰lncrnaak124826后，th17细胞明显减少(1.00±0.03)％，treg细胞显著增加(6.13±0.64)％(p＜0.01)；然而，将lncrnaak124826和il27同时干扰掉后，发现th17细胞明显增加(3.12±0.19)％，treg细胞显著减少(3.92±0.25)％(p＜0.01)。

附图说明

图1健康组和pm/dm患者血清中il-27、tgf-β和肌酸激酶的表达水平；

图2lncrna芯片差异聚类图；

图3为健康组和pm/dm患者血清中lncrnaak124826、il-17和foxp3基因的表达情况；

图4为健康组和pm/dm患者中cd4+t细胞中th17和treg细胞百分比综合；

图5a、图5b为慢病毒过表达载体、rnai干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，荧光定量pcr检测lncrnaak124826的表达情况；图5c、慢病毒过表达载体、rnai干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，th17/treg细胞分化信号通路变化；图5d慢病毒过表达载体、rnai干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，流式细胞术检测各组th17和treg细胞百分比；con表示空白对照，vector表示空载体对照，shnc表示阴性对照；

图6a、pm/dm患者lncrnaak124826调控靶基因网络图；图6b、健康组和pm/dm患者外周血il-27的表达水平；图6c、慢病毒过表达il-27显著抑制jak2/stat3和mapk/p38信号通路；con表示空白对照，vector表示空载体对照；

图7a、lncrnaak124826慢病毒过表达载体、rnai干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，比较其对含野生型il-273’utr全长的荧光素酶报告基因载体荧光素酶活性的影响图；图7b、rna免疫共沉淀实验验证il-27为lncrnaak124826的功能靶点；图7c、lncrnaak124826慢病毒干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，采用sirna技术下调il-27的表达；图7d、lncrnaak124826慢病毒干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，采用sirna技术下调il-27的表达，流式细胞术检测各组th17和treg细胞百分比；igg表示蛋白阴性对照，input表示阳性对照，shnc表示阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1分析lncrnaak124826在pm/dm患者中的表达

本实施例中以pm/dm患者为疾病组，肝肾功能指标正常的健康体检者为正常对照组，分别收集来自无锡市第二人民医院50例pm/dm患者和50例健康对照组样本，分离上述研究对象的外周血cd4+t细胞并留存血清标本。

1、分析疾病组和对照组血清中il-27、tgf-β和肌酸激酶(creatinekinase，ck)的表达情况。

应用elisa技术分别检测健康对照组和pm/dm患者血清中il-27、tgf-β和肌酸激酶(creatinekinase，ck)的表达水平。操作步骤分别依据il-27、tgf-β和ck的elisa试剂盒说明书进行，酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度，以标准品浓度为横坐标，标准品od值为纵坐标，绘制标准曲线，通过标准曲线公式计算各样本浓度。结果表明，与健康对照组相比，pm/dm患者tgf-β和ck表达显著升高(p＜0.01)(图1)。

2、分析对照组和研究组cd4+t细胞内lncrnaak124826、il-27、foxp3基因和蛋白的表达差异以及th17/treg细胞的比例。

我们对pm/dm患者外周血cd4+t细胞进行lncrna表达谱芯片筛选得到原始数据，首先对原始数据进行预处理，信号值去除背景后，进行中值归一化。通过归一化，有效的消除了实验随机误差对数据分析带来的影响。

lncrna标准为：p值小于0.05，且三组ratio中至少两组大于2倍；筛选下调lncrna标准为：p值小于0.05，且三组ratio中至少两小于0.5倍，lncrna芯片差异聚类图见图2。结果表明，lncrnaak124826表达显著升高(图2)。

我们采用荧光定量pcr检测pm/dm患者外周血cd4+t细胞lncrnaak124826、il-17和foxp3基因的表达。用trizol从培养细胞中提取总rna，用taqman-mirna反转录试剂盒进行反转录。用逆转录试剂盒反应体系将所得rna转录成cdna，然后进行pcr引物合成，引物序列如下：

按照实时定量pcr(rt-pcr)试剂盒的厂家规范进行操作后，构建real-timepcr反应体系。反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，然后60℃退火30s，共40个周期。以β-actin作为内参基因，根据待测基因和内参的ct值，采用2-^δδct计算待测基因的相对表达量。

流式细胞术检测外周血cd4+t细胞中th17和treg细胞百分比。

(1)流式细胞术检测th17细胞

自培养箱内取出培养后的外周血单个核细胞(pbmc)，吸取细胞悬液置于两个流式管中并重悬，标记试验管和对照管。加入1mlpbs洗涤，2000rpm离心5min后弃去上清液。加入5μlpe-cy5.5标记的鼠抗人cd4抗体(购自美国ebioscience公司)，对细胞膜表面的cd4分子进行特异性染色，室温下避光孵育30min。再加入1mlpbs洗涤，2000rpm离心5min后弃去上清液。加入100μlil-17a破膜剂(fix&perm)a液(购自美国ebioscience公司)后轻轻混匀，室温避光孵育15min。再用1mlpbs洗涤一次，然后加入100μlil-17a破膜剂(fix&perm)b液(购自美国ebioscience公司)轻轻混匀，在实验管加入5μlpe标记的鼠抗人il-17抗体(购自美国ebioscience公司)，在对照管中加入5μl抗鼠pe标记的抗鼠igg1抗体(购自美国ebioscience公司)，于室温下避光孵育30min。然后加入1mlpbs洗涤，2000rpm×5min离心，弃上清。并重复洗涤一次。最后加入400μlpbs重悬细胞，混匀后采用流式细胞仪检测cd4+t细胞中il-17a+所占的百分比，表示th17细胞所占百分比，foxp3所占百分比，表示treg细胞所占比例。

(2)流式细胞术检测treg细胞

自培养箱内取出培养后的外周血单个核细胞(pbmc)，加入1mlpbs洗涤，2000rpm离心5min后弃去上清液。加入5μlpe-cy5.5标记的鼠抗人cd4抗体(购自美国ebioscience公司)，同时加入5μlpe标记的抗人cd25抗体(购自美国ebioscience公司)对细胞膜表面的cd4分子进行特异性染色，室温避光孵育30min。再加入1mlpbs洗涤，2000rpm离心5min后弃去上清液。加入500μlfoxp3专用破膜液后混匀于室温避光孵育30min。加入1mlpbs洗涤，离心(1500rpm×5min)，弃上清，重复洗涤一次。然后在实验管加入5μlfitc标记的鼠抗人foxp3抗体(购自美国ebioscience公司)后轻轻混匀，在对照管中加入5μl抗鼠pe-cy5抗鼠igg1抗体(购自美国ebioscience公司)，于4℃避光孵育30min。然后加入1mlpbs洗涤，2000rpm×5min离心，弃上清，重复洗涤一次。最后加入400μlpbs重悬细胞，混匀后采用流式细胞仪检测cd4+t细胞中treg细胞百分比。

结果表明，与健康对照组相比，pm/dm患者lncrnaak124826表达显著升高(p＜0.01)，同时，il-17的基因表达显著升高(p＜0.01)，而foxp3的基因表达显著下降(p＜0.01)(图3)；应用流式细胞术分析健康对照组和研究组中th17/treg细胞的分化比例，结果表明pm/dm患者外周血cd4+t细胞中th17细胞百分比是(3.24±1.47)％，显著高于健康对照组的(0.82±0.24)％(p＜0.01)，pm/dm患者外周血cd4+t细胞treg细胞百分比是(3.27±0.45)％，显著低于对照组的(6.78±0.92)％(p＜0.01)(图4)。

实施例2lncrnaak124826对pm/dm患者th17/treg细胞分化的调控作用机制研究

(1)lncrnaak124826过表达载体的构建

首先克隆lncrnaak124826基因全长，以健康人外周血细胞基因组为模板扩增得到ncrnaak124826的cdna链，反应体系：上游引物1μl，下游引物1μl，模版dna1μl，5×pbs缓冲液10μl，dntpmix4μl，hsdna聚合酶(2.5u/μl)0.5μl(购自大连宝生物公司)，ddh2o32.5μl。反应条件：98℃，10s，55℃(10s)，72℃(90s)，共30个循环。上游引物序列为：5′-gcaagctttatgaactttctgctgtcttg-3′，下游引物序列为：5′-gctctagattaccgcctcggcctgtcacatc-3′。将扩增得到的lncrnaak124826的cdna连接至用相同ecori与xbai酶切的表达载体pcdna3.1(+)的酶切位点之间得到过表达载体pcdna3.1(+)-lncrnaak124826。

(2)lncrnaak124826rnai干扰载体的构建

遵从rna干扰序列设计原则，设计2个干扰靶点，干扰序列如下：5’-gccgcaggcgtataccataga-3’。同时，设计阴性对照插入序列为5’-gcaagctgaccctgaagttcat-3’。根据干扰靶点序列设计合成寡核苷酸序列，在寡核苷酸序列的5’和3’端分别插入ecori与xbai酶切的真核表达载体pcdna3.1(+)的酶切位点之间得到干扰载体，每对寡核苷酸序列退火后可形成短发夹结构，其中，发夹环为9个碱基组成的小片段dna双链。

(3)lncrnaak124826对pm/dm患者th17/treg细胞分化的研究

将过表达载体pcdna3.1(+)-lncrnaak124826导入cd4+cd45ra+t细胞中分析对th17/treg细胞分化起到重要调控作用的信号通路，同时应用rnai干扰技术敲减cd4+cd45ra+t细胞中lncrnaak124826，下调lncrnaak124826表达水平来进一步验证lncrnaak124826对th17/treg细胞分化的调控作用。其中，基因敲减操作如下：根据lncrnaak124826基因序列，选取干扰lncrnaak124826的靶点序列(5’-gccgcaggcgtataccataga-3’)和阴性对照序列(5’-gcaagctgaccctgaagttcat-3’)，按照lipofectamine2000试剂盒在pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞对数生长期瞬时转染入细胞，制备为稳定感染lncrnaak124826短发夹rna的cd4+cd45ra+t细胞。

在pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞中分别过表达和敲减lncrnaak124826，24h后利用il-6、tgf-β、pm/dm自身抗原jo-1共刺激，进行分化培养，应用流式细胞术分析各研究组cd4+t细胞分化后th17/treg细胞的比例。

lncrnaak124826慢病毒过表达载体、rnai干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，免疫荧光表明转染效率达到80％(图5a)；分别应用荧光定量pcr检测过表达和干扰效果，结果表明表达分别上升和下调了5.6、2.2倍(图5b)。

在cd4+cd45ra+t细胞中过表达lncrnaak124826能够显著活化jak-stat和mapk/p38信号通路，该信号通路可以促进cd4+t细胞向th17的分化，降低treg细胞的比例，诱导pm/dm的发生发展；同样，降低lncrnaak124826的表达能够显著抑制上述信号通路(图5c)。在过表达和敲减lncrnaak124826的cd4+cd45ra+t中分别加入il-6、tgf-β、pm/dm自身抗原jo-1共刺激后进行分化培养，流式细胞术检测th17和treg细胞百分比。结果表明，lncrnaak124826过表达组th17细胞比例显著增加，同时treg细胞显著减少；而降低lncrnaak124826的表达后，th17细胞的比例显著降低，treg细胞显著增加(图5d)。

以上实验结果表明，lncrnaak124826对pm/dm患者th17/treg细胞的分化起调控作用，促进cd4+cd45ra+t细胞向th17细胞分化，抑制其向treg细胞分化。

实施例3lncrnaak124826与il27基因和蛋白表达的相关关系

lncrna的作用方式之一是调控其临近染色体位置的编码基因表达，我们通过生物信息学对lncrnaak124826进行cis作用和trans作用靶基因的预测分析，形成了以lncrnaak124826为中心的网络调控图(图6a)，结果发现il-27位于其临近染色体位置，可能受到其调控作用作为靶基因。我们应用elisa法检测pm/dm和健康对照组外周血il-27的水平，操作步骤依据il-27的elisa试剂盒说明书进行，酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度，以标准品浓度为横坐标，标准品od值为纵坐标，绘制标准曲线，通过标准曲线公式计算各样本浓度。结果表明pm/dm患者外周血il-27的表达达水平为13.42±3.73pg/ml，显著低于健康对照者的36.3±8.09pg/ml(p＜0.01)(图6b)。为了进一步研究il-27在pm/dm患者中的作用机制，应用慢病毒过表达技术进一步上调il-27在pm/dm患者初始cd4+cd45ra+t细胞内的表达，结果如图6c所示，上调il-27的表达水平能够显著抑制jak-stat和mapk/p38信号通路的活化(图6c)。

实施例4验证il-27是lncrnaak124826的功能靶点

在确认lncrnaak124826参与pm/dm的发生发展，并与il-27蛋白表达呈负相关的基础上，进一步验证il-27是否为lncrnaak124826的功能靶点，从以下三个方面开展研究：

通过双荧光素酶报告基因实验，观察lncrnaak124826对含野生型il-273’utr全长的荧光素酶报告基因载体荧光素酶活性的直接抑制作用。用rt-pcr方法扩增il-27上lncrnaak124826结合位点的3’utr区基因片段。方法如下：以健康人外周血细胞基因组为模板，根据引物序列：forword：5’-atggactatcatatgcttaccgta-3’；reverse：5’-ctgcactgtaccccccaatc-3’，反应体系：premixtaq25μl(购自大连宝生物公司)，h2o22μl，上游引物1ul，下游引物1μl，模版dna1μl。反应条件：95℃，5min预解螺旋，95℃(30s)，60℃(30s)，72℃(3min)，共32个循环，72℃(10min)，然后用1.0％琼脂糖凝胶电泳30min，应用dna胶回收试剂盒回收目的片段。将该片段插入pgl3启动子荧光素酶报告载体中，构建il-273′utr野生型(il-273′utr-wt)质粒。然后，利用基因突变技术对上述结合位点的部分核苷酸进行突变，具体突变位点序列如下：forword：5’-ggtgcaaagtgggaactgtg-3’；reverse：5’-cgtgcgacggatgagttaacg-3’。从而构建il-273′utr突变(il-273′utr-mut)质粒。所有质粒均由上海生物工程公司合成，并经过dna测序验证。将il-273′utr-wt质粒或il-273′utr-mut质粒与lncrnaak12482模拟物(购于上海吉凯制药技术有限公司合成，序列5‘-ggagagacttagtt-3’)共转染入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，转染过程按照lipofectamine2000试剂盒说明书进行。培养48h后根据双荧光素酶报告基因试剂盒的说明，在无光条件下测定荧光素酶活性。

lncrnaak124826可显著降低野生型il-273’utr的报告基因活性(p＜0.01)，表达下调30％左右(图7a)。结果表明，lncrnaak124826对il-27有靶向调控作用，能够抑制il-27的表达。rna免疫共沉淀实验验证il-27为lncrnaak124826的功能靶点(图7b)。

lncrnaak124826慢病毒干扰载体转入pm/dm患者外周血初始cd4+cd45ra+t细胞，采用sirna技术下调il-27的表达，elisa检测各组il27的表达(图7c)。用il-6、tgf-β、pm/dm自身抗原jo-1共刺激培养，流式细胞术检测各组cd4+t细胞内th17和treg细胞的表达。结果表明，干扰掉lncrnaak124826后，th17细胞明显减少(1.00±0.03)％，treg细胞显著增加(6.13±0.64)％(p＜0.01)；然而，将lncrnaak124826和il27同时干扰掉后，发现th17细胞明显增加(3.12±0.19)％，treg细胞显著减少(3.92±0.25)％(p＜0.01)(图7d)。

以上实验结果表明，lncrnaak124826通过负向调控il27，参与th17/treg细胞分化的调控，从而参与pm/dm的发生。

序列表

<110>常熟市第二人民医院

<120>ncrnaak124826及其相关分子在诊断多发性肌炎/皮肌炎中的应用

<160>15

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<213>干扰lncrnaak124826的靶点序列(artificialsequence)

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<213>il-27突变下游引物(artificialsequence)

<400>14

cgtgcgacggatgagttaacg21

<210>15

<211>13

<212>dna

<213>lncrnaak12482模拟物(artificialsequence)

<400>15

ggagagacttagt13