一种[2]-网状索烃DNA单层阵列的制备方法及其应用与流程

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种[2]-网状索烃的dna单层阵列的制备方法及其应用。

背景技术：

核酸作为一种多用途的遗传物质，可以通过watson-crick碱基配对原理用于纳米级自组装结构的构建。由于高的杂交特异性、突出的可编程性和广泛的序列多样性，在过去的30年里，科学家们已经合成出各种人造dna纳米材料，包括一维纳米管、复杂的二维晶格或阵列、离散型的三维结构等。这些材料在生物应用中，如分子成像、治疗诊断和药物输送中具有巨大的潜力。然而，尽管一维和三维结构，如dna纳米线或纳米管、dna折纸、dna球形结构和dna多面体结构，已经在生物医学应用领域引起研究人员相当大的兴趣，并且最近在二维dna纳米结构方面也取得了重大进展，但在二维结构的分子成像和药物传递方面却很少受到关注。这可能是因为：与球形dna纳米结构或dna刚性多面体相比，使用现有的dna纳米技术组装而成的大型二维结构在复杂的生物环境中非常不稳定。由于静电排斥的原因大型二维结构很难进入细胞。因此，开发基于dna阵列的全身给药平台仍然是一个巨大的挑战。

为了确保在体内系统的适用性，人工dna纳米结构应满足以下几个要求：(1)高细胞摄取效率且不干扰细胞行为。因此，纳米结构需要能够在不使用转染试剂或不破坏细胞膜(如电穿孔和超声)的情况下有效地进入细胞，因为这些情况通常会导致细胞活性下降。(2)足够的核酸酶稳定性，高信号传导活性和药物有效负载能力。这样，纳米药物可以到达目标细胞并提供足够的药物浓度，还可以通过信号来评估药物的体内动态行为和治疗功效。(3)优秀的区分健康组织和病变组织的能力。以前的dna纳米粒子的靶向特性很大程度上依赖于细胞靶向配体。虽然不同类型的细胞，如健康细胞和病变细胞，理论上都会表达独特的表面受体，但可用的靶向配体数量有限，限制了dna纳米结构在医学诊断和治疗中的应用。

基于上述原因，我们构建了一种网状索烃的dna单层阵列，它适合用于癌变组织的筛选和靶向治疗。因为它只包含两种含有回文片段的环化的dna环，因此我们将这种dna阵列命名为[2]-网状索烃的dna单层阵列（即[2]gda）。它的组装过程仅包含序列的混合和退火两个步骤，在两小时内即可完成。这种dna阵列结构除了具有良好的生物相容性和核酸酶稳定性外，还能在没有共载体的情况下高效地进入哺乳动物细胞。给荷瘤小鼠全身给药后，[2]gda不需要靶向配体便可以优先在肿瘤组织中积累。简单高效的组装、独特的结构特点和生物系统中的优势表明[2]gda是一种可用于肿瘤监测和靶向给药的很有前途的dna纳米平台。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种[2]-网状索烃的dna单层阵列的制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种[2]-网状索烃的dna单层阵列的制备方法：

（1）首先在atp和pnk的帮助下，分别对参与组装的两条dna链的5ʹ端进行磷酸化，然后加热灭活pnk酶，获得dna链1和dna链2溶液，静置4小时后备用；所述dna链具有回文结构区域；

（2）用1×t4dna连接酶缓冲液分别将dna链1和dna链2溶液稀释至最终浓度1.6μm；在恒温金属浴内90℃退火5分钟后，让溶液慢慢冷却到室温，分别得到由dna链1纵向连接形成的纳米线lpsa和dna链2纵向连接形成的纳米线lpsb；然后，将lpsa和lpsb溶液以相同的摩尔比混合，在恒温振荡金属浴上室温下继续孵育30分钟，组装实验的总体积为25μl；此步骤可生成带有缺口的阵列结构；随后加入0.5μlt4dna连接酶，16℃条件下反应1h使两种单链开口闭合形成环，然后65℃加热20min，使连接酶失活，即得到所述[2]-网状索烃的dna单层阵列。

所述dna链1为psa：p−cttacctgatagcgcgcgcttagaacgagtcatatcacacgccccggggcactactaac；

dna链2为psb：p−actcgttctaagcgcgcgctatcaggtaaggttagtagtgccccggggcgtgtgatatg。

所述方法制备获得的[2]-网状索烃的dna单层阵列。

所述的[2]-网状索烃的dna单层阵列在制备肿瘤靶向药中的应用。

发明原理：

每个dna组件都由四个部分组成：中间片段（m片段）作为另一个组分环化的连接模板，两个不同的回文片段和互补的末端片段以头对尾的方式位于另一个dna组分的m片段的两侧。装配过程只包括退火和混合步骤。在dna组分单独高温退火过程中，dna组分之间发生纵向回文基的分子间杂交，形成由psa纵向连接而成的纳米线（lpsa）和psb纵向连接而成的纳米线（lpsb）。随后，通过标准的watson-crick碱基配对，lpsa与lpsb进行分子间杂交(即垂直方向交联)，lpsa与lpsb以等摩尔比混合，生成含缺口的dna单层阵列。最后通过t4dna连接酶将缺口封闭。组装原理示意图见图1。

本发明的优点在于：

所构建的网状索烃的dna单层阵列具有以下几个优点：(1)具有较强的核酸酶稳定性。dna环组分之间的交叉连接确保了该阵列结构在生物环境中不会分裂成单独的片段。(2)能在没有共载体的情况下高效地进入哺乳动物细胞。(3)良好生物相容性。通过mtt法和细胞凋亡实验证明该阵列结构对细胞无毒副作用。(4)可以在肿瘤部位优先聚集。

附图说明

图1材料组装原理示意图。

图2材料表征图，其中a为[2]gda及其中间体的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：泳道1，由dna链1（即psa）组装而成的线性中间体(lpsa)；泳道2，由dna链2（即psb）组装而成的线性中间体(lpsb)；泳道3，含缺口的[2]gda；泳道4，经连接酶封口的[2]gda。b为[2]gda的原子力表征图像。

图3材料的稳定性分析图，其中a为用dnasei（终浓度为3u/ml）对[2]gda（终浓度为710nm）处理不同时间后溶液中[2]gda的相对剩余量。0h时溶液中[2]gda的剩余量定义为1。b为用10%fbs对[2]gda（终浓度为710nm）处理不同时间后溶液中[2]gda的相对剩余量。0h时溶液中[2]gda的剩余量定义为1。c为用exoi（终浓度为0.4u/ml）对[2]gda（终浓度为710nm）处理不同时间后溶液中[2]gda的相对剩余量。0h时溶液中[2]gda的剩余量定义为1。

图4材料的细胞内在化、细胞毒性和活体内肿瘤部位聚集分析结果图。其中a为[2]gda细胞内在化能力的共聚焦显微成像结果，三张图片显示的是同一个群落的细胞。左图为细胞核染色结果，中间的图为进入细胞的[2]gda的荧光成像结果，右图为左图和中间的图合并的结果，可以看出材料（[2]gda）和细胞核紧挨在一起，证明材料已经进入细胞质内。b为[2]gda的细胞毒性实验结果。横坐标表示[2]gda的浓度，纵坐标表示细胞活性，从图中可以看出，随着[2]gda的浓度的提高，细胞的活性并未产生明显降低，说明[2]gda对几乎没有细胞毒性，证明其具有良好的生物相容性。c为活体荧光成像图。将cy5标记的[2]gda(100μl，1mm)通过尾静脉注射给肿瘤小鼠注射，从结果可以看出红色荧光区域和小鼠肿瘤重叠，说明[2]gda可以很好的在小鼠肿瘤处聚集。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1[2]-网状索烃的dna单层阵列的制备

首先在atp和pnk的帮助下，对所有参与组装的寡核苷酸的5ʹ端进行磷酸化，具体方法为将86μl的dna链1或dna链2（10mm）与10μl的10×t4pnkbuffer和2μl的atp（10mm）以及2μl的t4pnk酶(10000u/ml)均匀混合，然后放入37℃的恒温金属浴中1h。然后加热灭活pnk酶，获得对应的溶液，静置4小时后备用。

[2]-网状索烃的dna单层阵列([2]gda)是由两种类型的具有回文结构区域的链状dna组装而成。组装过程描述如下：首先，用1×t4dna连接酶缓冲液分别将psa和psb溶液稀释至最终浓度1.6μm。在恒温金属浴内90℃退火5分钟后，让溶液慢慢冷却到室温，分别得到由psa纵向连接形成的纳米线lpsa和psb纵向连接形成的纳米线lpsb。然后，将lpsa和lpsb溶液以相同的摩尔比混合，在恒温振荡金属浴上室温30分钟，组装实验的总体积为25μl。此步骤可生成带有缺口的阵列结构。随后加入0.5μlt4dna连接酶，16℃条件下反应1h使两种单链开口闭合形成环，然后65℃加热20min，使连接酶失活。即得到[2]-网状索烃的dna单层阵列（[2]gda）的溶液。

dna链1为psa：p−cttacctgatagcgcgcgcttagaacgagtcatatcacacgccccggggcactactaac；

dna链2为psb：p−actcgttctaagcgcgcgctatcaggtaaggttagtagtgccccggggcgtgtgatatg。

实施例2细胞内化分析检测

hela细胞在12孔培养板上培养24h，使细胞生长至占孔板底部70~80%。然后将培养基替换为含有cy5标记的[2]gda或者lpsb的dmem培养基（该培养基为400μl，其中cy5标记的psb及psa浓度为50nm)。孵育4h后，用pbs溶液清洗。然后用hoechst33342(10μg/ml)在37℃条件下孵育15min，用于细胞核染色。再次用pbs溶液冲洗后，用激光共聚焦荧光显微镜(leicatcssp8)对细胞进行共聚焦荧光显微成像。

图4a即为[2]gda细胞内在化能力的共聚焦显微成像结果，三张图片显示的是同一个群落的细胞。左图为细胞核染色结果，中间的图为进入细胞的[2]gda的荧光成像结果，右图为左图和中间的图合并的结果，可以看出材料（[2]gda）和细胞核紧挨在一起，证明材料已经进入细胞质内。

实施例3细胞毒性实验

将hela细胞接种于96孔培养板上培养24h，使细胞生长至孔底面积的70%~80%。然后，用100μl含有0、20、80、160、300、400nm[2]gda的dmem培养基(不含fbs)处理细胞4h。接下来用100μl含10%fbs的dmem培养基替换含[2]gda的dmem培养基，孵育20h。然后，先用pbs溶液洗涤细胞，再用150μlmtt试剂在37℃条件下孵育细胞4h。除去mtt试剂后，再次用pbs溶液清洗，每孔加入100μldmso，再以600rpm的转速摇匀10min。最后，酶标仪测量450nm处的吸光度。

图4b即为[2]gda的细胞毒性实验结果。横坐标表示[2]gda的浓度，纵坐标表示细胞活性，从图中可以看出，随着[2]gda的浓度的提高，细胞的活性并未产生明显降低，说明[2]gda对几乎没有细胞毒性，证明其具有良好的生物相容性。

实施例4活体荧光成像以及肿瘤组织成像

在活体内荧光成像中，在雄性裸鼠(20~25g)右侧腋下皮下注射1×107个hela细胞。正常喂养荷瘤小鼠25-30天，直到肿瘤长到约600mm3。用1.0~1.5%异氟烷麻醉后，通过尾静脉注射给肿瘤小鼠注射cy5标记的[2]gda(100μl，1mm)。然后，使用ivis-spectrum成像系统采集活体小鼠的荧光图像。在相同条件下用cy5标记的[2]gda给药的正常小鼠成像作为对照。活体内荧光成像后，将小鼠体内肿瘤取出，然后进行荧光成像分析。

图4c即为活体荧光成像图。将cy5标记的[2]gda(100μl，1mm)通过尾静脉注射给肿瘤小鼠注射，从结果可以看出红色荧光区域和小鼠肿瘤重叠，说明[2]gda可以很好的在小鼠肿瘤处聚集。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福州大学

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