一种无抗高细胞亲和性结肠炎修复剂与应用方法与流程

本发明属于肠炎治疗与健康维护制剂技术领域，具体涉及一种无抗高细胞亲和性结肠炎修复剂。

背景技术：

溃疡性结肠炎是一种非特异性结肠炎，其临床表现包括腹痛、血便等，病变主要局限于黏膜及黏膜下层，其病理改变为溃疡形成、隐窝脓肿、小血管炎症、杯状细胞减少以及各种炎性细胞的浸润。治疗结肠炎的难点在于病变部位位于肠道后部，由于胃高酸和肠道各种酶的干扰，服用抗生素治疗容易降解，有效浓度降低较大，往往很难治愈，并造成一定程度的耐药性。目前，对于临床治疗人结肠炎一般以杀菌抗炎为主，多使用柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、甲硝锉、阿莫西林、肠炎宁等药物；上述药物对人均有不同程度的副作用和耐药性；药物在杀死有害菌的同时也会破坏体内有益菌平衡，严重造成肠道微生物菌群失衡；近年来，人类的发病率呈上升趋势，并伴有向结肠癌转化的风险。

此外，在畜禽饲养过程中，由于饲料发霉、油脂酸败、大肠杆菌感染和应激等原因也会造成结肠炎，给畜禽养殖造成巨大损失，因此，畜禽肠道后段炎症修复治疗是畜牧养殖中普遍关注的技术问题。养殖环节，投服抗生素很容易产生商品畜禽产品药物残留，造成食品安全问题，对人的健康造成危害。因此，研发协同结肠炎修复治疗高效制剂与方法具有重要经济和社会意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种天然溃疡性结肠炎修复制剂，即一种含壳聚糖的溃疡性结肠炎修复制剂，使用鸭油甘油二酯(ddg)和壳聚糖(cts)组合物，并结合非服用干酪乳杆菌，用于恢复体重、结肠长度等，调节炎症细胞因子的表达，促进结肠肠道发育；从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供溃疡性结肠炎修复制剂，包含有鸭油甘油二酯和壳聚糖溶液。

所述的鸭油甘油二酯和壳聚糖溶液的体积比为1～2:1；优选比例为1.5:1。

所述的壳聚糖溶液的浓度为3％；

本发明的修复制剂制备方法，是将液体鸭油甘油二酯温度调整为25～40℃，将鸭油甘油二酯和壳聚糖溶液进行混合，搅拌15～20min完成制备。

本发明还提供一种溃疡性结肠炎的修复制品，是使用上述的制剂制备的。

所述的修复制品，其中还包含有干酪乳杆菌。

所述的干酪乳杆菌的活力单位为10⁸cfu/ml。

本发明的组合物可降低肠道炎症因子水平，改善溃疡性结肠炎小鼠生理指标，促进溃疡性结肠炎小鼠结肠组织发育。制品中添加干酪乳杆菌可有效的调节肠道菌群。

附图说明

图1：鸭油甘油二酯和壳聚糖干预溃疡性结肠炎结肠组织切片h&e染色图；

图2：鸭油甘油二酯、壳聚糖和干酪乳杆菌干预溃疡性结肠炎结肠组织切片h&e染色图。

具体实施方式

甘油二酯是油脂酶解的中间产物，在食品、医药等行业有广泛的应用，具有抑制革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的作用、刺激肠道脂质代谢等功能。壳聚糖是天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有减少脂肪形成、抑制细菌活性等功能。壳聚糖分子结构中的氨基基团-nh²在酸性环境中会被质子化形成nh³⁺离子，从而在酸性条件下会溶解，具有很强的细胞亲和性、生物降解性和生物效应等许多独特的性质。

干酪乳杆菌在肠道中能够与有害菌竞争肠上皮细胞上的黏附位点，从而抑制有害菌在细胞上的黏附性生存；可以黏附、定植于肠道粘膜表面，对肠道免疫系统具有调控作用，可以改善肠道健康，治疗肠道菌群紊乱，增强肠道通透性。

本发明将不同水平的鸭油甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌联合使用；采用的干酪乳杆菌能够顺利通过胃酸、胆盐直接进入肠道，快速达到肠道后段炎症表面，快速建立肠道优势益生菌群落，结合甘油二酯和壳聚糖促进溃疡性结肠炎小鼠结肠组织发育与创伤愈合。另外，添加使用干酪乳杆菌能够促进结肠炎肠道中有益微生物的生长，维持肠道菌群结构平衡。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：组合物的配合

本发明中鸭油甘油二酯的溶解温度范围为25～40℃；按照3％(w/w)的比例将壳聚糖(mw：850000da；脱乙酰度：96.1％)溶解于1％(v/v)醋酸盐水(醋酸溶液溶解于0.9％(w/v)生理盐水中)中，即壳聚糖溶液；将鸭油甘油二酯和壳聚糖溶液按照体积比1～2:1(ml/ml)；二者混合搅拌时间为15～20min。

实施例2：鸭油甘油二酯与壳聚糖对结肠炎小鼠体重、结肠长度及mpo活性的影响

试验小鼠饲养于spf级动物房，保持室温24～25℃，人工光照12h/d，相对湿度40％～60％，试验开始前适应性喂养1周，自由饮食。

(1)试验动物及分组：试验分为两个阶段进行。

第一阶段：结肠炎模型建立。设计对照组与模型组，对照组5个重复，模型组20个重复，每个重复10只。所有小鼠自由饮食，对照组小鼠自由饮用蒸馏水，模型组将葡聚糖硫酸钠(dss)溶于蒸馏水中配制5％(w/v)的dss溶液，替代饮用水，每天进行更换，小鼠连续自由饮用7天诱发结肠炎，建立溃疡性结肠炎模型。对照组与模型组各抽取25只小鼠，禁食24h，实施安乐死，收集血样，检测致炎因子，测量结肠长度，验证模型建立是否成功。

第二阶段：结肠炎修复。试验设计正常对照组(ⅰ组)、炎症模型组(ⅱ组)和炎症修复组(ⅲ～ⅲ组)，共8个组。每组5个重复，每个重复5只，共200只小鼠。炎症修复组采用2×3两因素交叉等重复的析因设计。正常对照组与炎症模型组灌服生理盐水，炎症修复组分别灌服甘油二酯2、3、4ml/kg(每天所摄入的毫升数/每公斤小鼠体重)，壳聚糖溶液分别灌服2、4ml/kg，所有小鼠均饲喂基础饲粮。试验周期为3周。具体饲喂情况如表1所示。连续灌胃7天进行修复治疗后，对所有小鼠实施安乐死。

表1试验期小鼠分组处理情况表

(2)取材及处理：在试验结束时，眼球取血收集血样，并在3000r/min下离心20min获得血清，并将其储存在-40℃下；收集每只小鼠的结肠，测量结肠的长度和重量，然后切下结肠下段相同位置的0.5cm长的结肠样品，固定在10％中性福尔马林中用于肠道组织切片观察。

(3)指标检测：

a.称量每只小鼠的体重、结肠长度。

b.采用试剂盒测定髓过氧化物酶(mpo)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素17(il-17)、白细胞介素1β(il-1β)、干扰素γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)含量。

c.采用苏木精-伊红(hematoxylinandeosinhe)方法对肠道组织切片进行颜色，观察肠道组织结构变化，测定绒毛长度和隐窝深度，计算绒毛长度/隐窝深度。

(4)试验结果

如表2所示，修复治疗7天，ddg对于小鼠体重变化有影响(p＜0.05)；cts对于小鼠体重变化影响显著(p＜0.05)；ddg与cts交互对于体重变化作用极显著(p＜0.01)，ⅲ组体重变化高于其他试验组(p＜0.05)，分别较ⅰ、ⅱ、ⅳ、ⅴ、ⅵ组高1.13％，1.78％，6.48％，5.33％，2.74％。

ddg、cts对于小鼠结肠长度变化无影响(p＞0.05)；ddg与cts交互对于结肠长度作用不显著(p＞0.05)。

ddg对于mpo活性变化极显著(p＜0.01)；cts对于mpo活性变化有影响(p＜0.05)；ddg与cts交互对于mpo活性变化作用极显著(p＜0.01)，ⅱ、ⅲ、ⅳ组的mpo值无显著差异，但低于其他试验组(p＜0.05)。

表2鸭油甘油二酯与壳聚糖联合对溃疡性结肠炎小鼠体重变量、结肠长度和mpo活性的影响表

实施例3：鸭油甘油二酯与壳聚糖协同对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子的影响

如表3所示，修复治疗后，ddg对于il-4、il-17、il-1β、ifn-γ浓度变化影响极显著(p＜0.01)，对于il-6、tnf-α浓度变化有影响(p＜0.05)；cts对于il-4、il-6、il-17、il-1β、ifn-γ、tnf-α浓度变化作用极显著(p＜0.01)；ⅲ组与ⅴ组的tnf-α浓度无显著差异(p＞0.05)，但低于其他试验组(p＜0.05)；ⅲ组的il-6、il-17、il-1β浓度均低于其他各试验组。ddg与cts交互对于il-4、il-6、tnf-α浓度的变化有显著影响(p＜0.05)，不同添加量的ddg与cts交互对于il-17、il-1β、ifn-γ浓度的变化作用极显著(p＜0.01)。

综上所述，经过鸭油甘油二酯与壳聚糖联合修复治疗可降低结肠炎小鼠的炎症反应，减少炎性细胞因子的释放。

表3鸭油甘油二酯与壳聚糖对溃疡性结肠炎小鼠细胞因子的影响表

实施例4：鸭油甘油二酯与壳聚糖协同对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织发育的影响

如图1可知，正常对照组小鼠结肠黏膜完整，隐窝腺体完整，无炎性细胞浸润；与正常对照组相比，炎症模型组小鼠结肠黏膜上皮出现较大溃疡，隐窝结构大部分消失，大量炎性细胞浸润；与炎症模型组相比，ⅰ～ⅵ组小鼠结肠黏膜较少缺损，隐窝腺体破坏较轻，炎性细胞较少。

如表4所知，ddg对于绒毛高度、线隐比变化作用极显著(p＜0.01)，对于隐窝深度无显著影响(p＞0.05)；cts可增绒毛高度(p＜0.05)，对隐窝深度与绒隐比无显著影响(p＞0.05)；ⅲ、ⅳ组绒毛高度高于其他试验组(p＜0.05)，ⅲ组的隐窝深度低于其他试验组，较其他试验组分别低0.24％、0.02％、0.30％、0.28％、0.43％。ⅲ组的绒隐比高于其他试验组；ddg与cts交互对于绒毛高度、隐窝深度的变化作用显著(p＜0.05)，对于绒隐比的变化作用不显著(p＞0.05)。

综上所述，对于结肠炎小鼠给予不同水平的鸭油甘油二酯与壳聚糖进行治疗，可使结肠绒毛高度增大，隐窝深度变浅，绒隐比增大，促使小鼠肠道炎症恢复，其中ⅲ组修复治疗效果最好。

表4鸭油甘油二酯与壳聚糖联合对溃疡性结肠炎小鼠结肠发育的影响

实施例5：鸭油甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌协同对溃疡性结肠炎小鼠体重、结肠长度及mpo活性的影响

(1)试验动物及分组：试验分为如下两个阶段进行。

第一阶段：结肠炎模型建立。设计对照组与模型组，对照组10个重复，模型组20个重复，每个重复5只。小鼠自由饮食，对照组小鼠自由饮用蒸馏水，模型组将葡聚糖硫酸钠(dss)溶于蒸馏水中配制5％(w/v)的dss溶液，替代饮用水，每天进行更换，小鼠连续自由饮用7天诱发结肠炎，建立溃疡性结肠炎模型。对照组与模型组各抽取25只小鼠，禁食24h，实施安乐死。

第二阶段：结肠炎修复。试验设计正常对照组(ⅰ组)、炎症模型组(ⅱ组)和炎症修复组(ⅲ～ⅳ组)，共4个组。每组5个重复，每个重复5只，共100只小鼠。所有小鼠均饲喂基础饲粮。具体饲喂情况如表5所示。连续灌胃7天进行修复治疗后，对所有小鼠实施安乐死。

表5修复期小鼠分组处理情况

(2)试验结果：

如表6可知，与ⅰ组相比，ⅱ组的体重变化显著降低(p＜0.05)，ⅲ、ⅳ组的体重变化无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组对比，ⅲ、ⅳ组的体重变化显著增加(p＜0.05)，与ⅲ相比，ⅳ组的体重变化无显著差异(p＞0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ组的结肠长度显著降低(p＜0.05)，ⅳ组的结肠长度显著增加(p＜0.05)，ⅲ组的结肠长度无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的结肠长组显著增加(p＜0.05)；与ⅲ相比，ⅳ组的结肠长度无显著差异(p＞0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ组的mpo值显著增加(p＜0.05)，ⅳ组的mpo值无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的mpo值显著减少(p＜0.05)；与ⅲ相比，ⅳ组的mpo值降低(p＜0.05)。

表6甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌协同对肠炎小鼠生理指标的影响

实施例6：鸭油甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌协同对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子的影响

试验动物及分组同案例5。试验结果如下：

如表7可知，与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ组的il-4浓度增加(p＜0.05)，ⅳ组的il-4浓度无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的il-4浓度减少(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的mpo值降低(p＜0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ组的il-6浓度增加(p＜0.05)，ⅳ组的il-6浓度无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的il-6浓度减少(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的mpo值降低(p＜0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ组的il-17浓度增加(p＜0.05)，ⅳ组的il-17浓度无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的il-17浓度减少(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的il-17浓度降低(p＜0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ组的il-1β浓度增加(p＜0.05)，ⅲ、ⅳ组的il-1β浓度无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的il-1β浓度减少(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的il-1β浓度较低。

与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ、ⅳ组的ifn-γ浓度增加(p＜0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的ifn-γ浓度减少(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的ifn-γ浓度低于ⅲ组。

与ⅰ组相比，ⅱ组的tnf-α浓度增加(p＜0.05)，ⅲ、ⅳ组的tnf-α浓度无显著差异(p＞0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的tnf-α浓度减少(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的tnf-α浓度较低。

表7甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌联合对溃疡性结肠炎小鼠细胞因子的影响

实施例7：鸭油甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌协同对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织发育的影响

试验动物及分组同实施例5，试验结果如下：

如图2可知，ⅰ组小鼠结肠结构完整，无炎性细胞浸润；与ⅰ组相比，ⅱ组小鼠结肠黏膜上皮出现较大溃疡，隐窝结构破坏严重，大量炎性细胞浸润；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组小鼠结肠黏膜较少缺损，隐窝腺体破坏较轻，炎性细胞较少。

如表8可知，与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ、ⅳ组的绒毛高度降低(p＜0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的绒毛高度增长(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的绒毛高度无显著差异(p>0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ、ⅳ组的隐窝深度增加(p＜0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的隐窝深度降低(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的隐窝深度无显著差异(p>0.05)。

与ⅰ组相比，ⅱ、ⅲ、ⅳ组的绒隐比减少(p＜0.05)；与ⅱ组相比，ⅲ、ⅳ组的绒隐比增加(p＜0.05)；与ⅲ组相比，ⅳ组的绒隐比较高。

表8甘油二酯、壳聚糖与干酪乳杆菌联合对溃疡性结肠炎小鼠结肠发育的影响

由实施例2、3、4综合来看，鸭油甘油二酯与壳聚糖联合可降低dss诱导小鼠结肠炎炎症反应，降低肠道炎症因子水平，可改善溃疡性结肠炎小鼠生理指标，促进溃疡性结肠炎小鼠结肠组织发育，具有交互协同修复治疗作用，是一种很有开发价值的肠道炎症健康修复剂。另外，由实施例5、6、7综合来看，在上述修复剂投服前2h，饲喂4ml/kg干酪乳杆菌(活力单位为10⁸cfu/ml)对结肠炎治疗效果最佳。本发明的新型肠道炎症修复剂可在临床中应用，市场前景广阔。