一种包载全氟化碳的纳米级超声造影剂的制作方法

本发明涉及一种用于超声成像诊断的超声造影剂及其制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术：

超声成像是一种利用超声的物理特性和人体器官组织声学性质上的差异来进行疾病诊断的影像技术，由于其非侵袭性、花费低、操作简单及广泛的诊断应用而受到特别的关注。超声造影剂常被应用于超声诊断，有效改善超声图像的对比质量，明显提高超声波对于病变区形态和类型的分辨能力，增强超声诊断的敏感性和特异性。

随着超声成像技术与生物纳米技术的迅猛发展，纳米级超声造影剂发展迅速。与传统微米级超声造影剂相比，纳米级超声造影剂粒径小，组织穿透能力更强，更容易穿透血管到达组织病灶部位。此外，纳米级粒子表面积大，吸附能力强，可以聚集显像，在靶区可显著增强信号，降低背景噪声。

超声造影剂的壳膜材料主要包括脂质、高分子聚合物、表面活性剂、无机非金属等。其中高分子聚合物制备的壳层较硬，弹性差，在超声爆破或自然溶蚀下易形成碎片，产生非治疗性损伤；表面活性剂制备的造影剂稳定性较差，不易被修饰；无机纳米颗粒材料刚性强，需要较高的超声输出。而脂质材料有较高的韧性，壳膜在水介质中可形成液晶，稳定性好，显像效果佳，是一种较为理想的超声造影剂壳膜材料。采用混合脂质材料制备的双分子层壳膜，生物相容性更好，稳定性更佳，包载能力更强，可以很好的包载成像剂并进行体内输送，具有很高的研究价值。

全氟化碳是一种氟化的脂肪族类复合物，其沸点低，进入体内后在体温及超声效应的作用下进行液-气相转变，形成微泡，增强显像效果。与直接包载气态氟碳化合物相比，包载全氟化碳的造影剂具有更好的储存稳定性、更长的组织内循环时间、更高的生物安全性、更持久地抵抗外界压力及机械应力变化的能力，能够实现体内长效超声成像效果，更有利于检测观察病灶部位。

采用纳米级脂质体包载全氟化碳，可利用纳米粒子的强穿透力穿过血管内皮细胞，使之到达血管外病变组织器官，经过超声作用后全氟化碳进行相转变形成微泡，产生较强的超声显像效果；另外，形成的多层磷脂稳定层可以有效地提高超声造影剂的储存稳定性，但不影响体内的超声响应性，方便临床使用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种包载全氟化碳的纳米级超声造影剂。该纳米级超声造影剂由脂质包膜包裹全氟化碳及其它有效成分组成。制备得到的纳米级超声造影剂生物相容性更好、穿透能力更强，体内循环时间更长。包载的全氟化碳在体温与超声效应的作用下通过液-气相转变产生微泡，可以达到增强的超声显影的效果。

所述脂质包膜由一种或多种脂质材料组成，例如氢化大豆磷脂，peg化磷脂及胆固醇等，但不限于举例范围。

所述全氟化碳为全氟戊烷、全氟己烷中任意一种，但不限于举例范围。

本发明采用如下技术方案：

一种包载全氟化碳的纳米级超声造影剂，所述纳米级超声造影剂以氢化大豆磷脂，peg化磷脂及胆固醇为脂质材料，制备壳膜，内部包有全氟化碳。制得的脂质体粒径分布范围为80～400nm，透射电镜可观察到明显磷脂层，表面荷负电，电位绝对值约为30mv。

本发明优选的内部包载的全氟化碳为全氟戊烷、全氟己烷中任意一种。

本发明优选的形成壳膜的脂质材料为氢化大豆磷脂、peg化磷脂与胆固醇的混合物，氢化大豆磷脂、peg化磷脂与胆固醇三者的质量比为10∶3∶1。

本发明优选的全氟化碳加入量在1％-10％(v∶v)。

本发明制得的脂质体，其内部包载的全氟化碳在体温与超声效应的作用下气化产生微泡，接收超声能量后发生共振并散射超声信号，具有增强显像的能力。

上述载全氟化碳的纳米级超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将脂质材料氢化大豆磷脂、peg化磷脂及胆固醇在有机溶剂中进行分散，旋蒸除去有机溶剂后得薄膜，37℃下进行薄膜生理盐水水化，30min后得脂质囊泡；

(2)取步骤(1)制得的脂质囊泡，加入全氟化碳，采用探头超声进行粉碎，得粗混悬液；

(3)将步骤(2)制得的粗混悬液与步骤(1)制得的脂质囊泡混合后，按顺序挤出通过400nm，200nm，100nm的纤维素膜，每层挤出次数不少于13次，取续滤液，稀释后即得所述超声造影剂。

本发明优选的步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇，乙醇，丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或多种，但不限于举例范围。

本发明优选的步骤(2)中所述探头超声强度为50％，超声时间为10min，但不限于举例范围。本发明优选的步骤(3)中所述稀释倍数为3～6倍。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)采用氢化大豆磷脂、peg化磷脂及胆固醇的混合物制备壳膜，制备方法成熟，工艺简单，具有体内生物相容性好，体外稳定性佳的特点，有利于该制剂的临床应用。

(2)纳米级超声造影剂通过静脉注射后，具有强穿透能力，可穿过血管内皮细胞到达血管外病变组织器官。

(3)包载全氟化碳化合物，相较于气态氟碳具有更高的安全性，更长的组织内循环时间、更持久地抵抗外界压力及机械应力变化的能力。在体内进行相转变后形成微泡，增强纳米氟碳造影剂的显像效果，气态氟碳化合物最终可通过呼吸快速排出体外，使干扰信号达到最小。

(4)可以形成多层磷脂层包覆的纳米制剂，提高了储存稳定性和超声响应稳定性。

附图说明

图1为包载全氟化碳的纳米级超声造影剂的透射电镜图。

图2为包载全氟化碳的纳米级超声造影剂的粒径电位分布图。

图3为包载全氟化碳的纳米级超声造影剂的储存稳定性。

图4为超声仪器进行无造影剂的肝门静脉造影成像图。

图5为静脉注射包载全氟化碳的纳米级超声造影剂的肝门静脉造影成像图。

具体实施方式

本发明具体实施方式列举的实施例子仅用于对本发明进行说明，并不对本发明内容进行限制。

实施例1

一种包载全氟化碳的纳米级超声造影剂制备方式包括以下步骤：

(1)将氢化大豆磷脂、peg化磷脂及胆固醇按摩尔比溶于三氯甲烷，超声使完全溶解，40℃减压蒸发除去有机溶剂得脂质薄膜。加入适量生理盐水作为水合介质，37℃水合30min得脂质囊泡。

(2)取步骤(1)制得的脂质体，加入全氟化碳，以50％强度进行探头超声粉碎，超声10min后即得粗混悬液。

(3)将步骤(2)制得的粗混悬液与步骤(1)制得的脂质囊泡混合后，按顺序挤出通过400nm，200nm，100nm的纤维素膜，每层挤出次数不少于13次，取续滤液，稀释后即得所述超声造影剂。

对上述制得的制剂进行透射电镜扫描，其外观呈现大小均一的球形，可见明显壳核结构，磷脂壳有明显多层结构，见附图1。进行粒径测定和zeta电位评价，该制剂粒径均值为200nm，粒径分布范围为80～400nm，表面荷负电，电位绝对值约为25mv，粒径电位分布见附图2。

实施例2

实施例1制备的超声造影剂的储存稳定性评价主要包括如下步骤：

将制得的造影剂置于4℃条件下，于第1，2，3，4，5，6，7天取样，对样品进行粒径测定及zeta电位评价。

评价结果见图3

实施例3

实施例1制备的超声造影剂活体成像效果评价主要包括如下步骤：

(1)选取雄性sd大鼠，将腹部毛发剔除，腹腔注射巴比妥类药物用于麻醉。在腹部涂上超声耦合剂，用超声仪器进行无造影剂的肝门静脉造影，储存图像见附图4。

(2)将实施例1所述造影剂用生理盐水稀释5-10倍，经尾静脉注射造影剂，对其进行肝门静脉造影，储存图像见附图5。