姜黄素纳米分散膜及其制备方法与用途与流程

本发明涉及一种化学方法，特别是涉及一种姜黄素纳米分散膜及其制备方法与用途。

背景技术：

肿瘤，特别是恶性肿瘤已成为目前威胁人类健康、危害最大的疾病之一。物理上切除肿瘤的手术仍然是肿瘤相关疾病的主要治疗方法，尤其是良性肿瘤以及早期阶段的恶性肿瘤。然而，手术切除后残留的肿瘤细胞保留了复发和转移的风险。手术与化学疗法，放射疗法或免疫疗法的结合可以有效减少这些危害。例如，细胞减灭术（crs）和腹膜内高温化疗（hipec）现在被视为某些阑尾癌和腹膜间皮瘤的标准治疗方法，并且在胰腺癌治疗中也显示出成功。但是放疗与化疗药物的辐射和副作用（例如胃肠道问题，皮疹，脱发和精力不足）会造成非特异性损害，从而降低患者的生活质量并限制治疗剂量。另一方面，化疗与免疫疗法的高昂费用对于大多数患者，尤其是发展中国家的患者也是无法承受的经济负担。

姜黄素（化学式：c21h20o6;（1e，6e）-1,7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮）已被确定为姜黄的主要生物活性化合物。已有研究证明姜黄素可以有效诱导各种类型的癌细胞凋亡。姜黄素除具有出色的功效外，还具有广泛的来源，并且已被证明具有极低的毒性。在临床试验中，姜黄素的成人口服安全剂量可高达每天8000毫克。尽管姜黄素安全、便宜并且在体外具有显着的药理作用，但其在肿瘤的实际临床治疗中，疗效并不显著。这主要是由于姜黄素不易被人体吸收，而且其本身不稳定，容易被人体快速讲解。因此，有效提高姜黄素生物利用度，将会提供一种高效、低毒性、低成本的肿瘤治疗手段，提高病人生存率与生活质量，降低患者与社会的经济负担。

目前，关于利用姜黄素用于制备用于治疗肿瘤的制剂还十分有限。专利cn110279677a公开了一种制备姜黄素缓释膜的制备方法，但是这种方法需要利用紫外光对载药纤维膜进行照射，而紫外线的照射增加了所载药物被破坏的风险。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种姜黄素纳米分散膜的制备方法，用于解决现有技术中易降解、溶解度差、生物利用度低等问题。

为实现上述目的及其它相关目的，本发明提供一种姜黄素纳米分散膜的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（1）将姜黄素活性体与明胶溶解在溶剂中；所述姜黄素活性体为姜黄素、姜黄素盐、姜黄素共晶体、或者姜黄素衍生物中的任一种或者几种；

（2）利用静电纺丝法制备姜黄素纳米分散膜中间体；

（3）对姜黄素纳米分散膜中间体干燥，孵育，冲洗后冻干即可。

天然存在的类姜黄素包括姜黄素（1,7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮）、去甲氧基姜黄素（1-（4-羟基苯基）-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮）和双去甲氧基姜黄素（1,7-双（4-羟基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮）的酮式与烯醇式，以及它们的任意组合。

进一步地，所述姜黄素活性体选自1,7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮或1,7-双（4-羟基苯基）庚-4-烯-3-酮骨架的化合物，其中所述苯基可独立地带有一个或多个烷氧基残基，尤其是在3位上的一个甲氧基残基。

姜黄素盐、姜黄素共晶体、或者姜黄素衍生物。所述姜黄素衍生物可以是姜黄素铜盐二聚体，去甲氧基姜黄素，双去甲氧基姜黄素等具有治疗作用的化学物质。

进一步地，所述步骤（1）中姜黄素活性体与明胶的质量比为1:10-15。

进一步地，所述溶剂为有机溶剂，例如三氟乙醇。

进一步地，所述溶剂中姜黄素的终浓度为9-11%wt/v。

进一步地，姜黄素与明胶溶解在溶剂中可以搅拌，使得混合液更加混匀。

进一步地，所述静电纺丝法的工艺参数为：电压15-17kv，注射泵的速度为1-2.5ml/h，针尖与接受器之间的距离为10-20cm。

进一步地，所述干燥的方法为将姜黄素纳米分散膜中间体置于3-4℃的真空干燥箱中20-28小时。

进一步地，所述孵育的条件为：将姜黄素纳米分散膜中间体置于有机溶剂中，20-28℃下孵育20-28小时。

进一步地，所述冻干是指将姜黄素纳米分散膜中间体置于-35~-45℃温度下20-28小时。

本发明的另一方面提供了上述方法制备的姜黄素纳米分散膜。

本发明的另一方面提供了上述姜黄素纳米分散膜在制备肿瘤治疗药物中的用途。

进一步地，所述肿瘤选自以下任一种:鼻咽肿瘤、口腔肿瘤、舌肿瘤、喉肿瘤、食管肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、贡门肿瘤、胃肿瘤、幽门肿瘤、膜腺肿瘤、胰腺肿瘤、肠肿瘤、膀肮肿瘤、前列腺肿瘤、宫颈肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤、唇肿瘤、皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、骨瘤、肉瘤、恶性脑胶质瘤、尤文氏瘤、何杰金氏病、非何杰金氏病。

如上所述，本发明的姜黄素纳米分散膜的制备方法，具有以下有益效果：

（1）制备方法简单快捷，工艺参数柔性较高，可以低成本的大规模的生产负载姜黄素分散体的纳米纤维膜；

（2）所制备的纳米纤维在与水接触后，发生溶胀而不溶解，药物分子可以自纳米纤维中缓慢释放；

（3）交联后的载药膜具有一定的弹性，而且所制备明胶纳米纤维膜，本身无生物毒性、无抗原性、在生物体内可降解，是一种良好的原位给药基体材料；

（4）本方法采用避免了紫外线的照射增加了所载药物被破坏的风险。

附图说明

图1显示为姜黄素分散膜制备流程。

图2显示为姜黄素分散膜实物照片。

图3姜黄素纳米分散膜扫描电子显微镜图像。

图4姜黄素纳米分散膜荧光显微镜图像。

图5姜黄素纳米分散膜x射线晶体衍射图。

图6姜黄素纳米分散膜体外释放姜黄素浓度随时间变化曲线。

图7姜黄素纳米分散膜对正常干细胞的影响。

图8姜黄素纳米分散膜浸出液对通路的相关蛋白表达影响。

图9姜黄素纳米分散膜浸出液对胰腺癌细胞的杀灭效果。

图10荧光显微镜观察姜黄素纳米分散膜浸出液对肿瘤细胞簇的影响（右侧为明场视野，左侧为以绿色荧光活细胞示踪在荧光显微镜下观察肿瘤团的生长形态；上排为对照，下排为经载黄素纳米分散膜治疗组）。

图11荧光显微镜观察姜黄素纳米分散膜浸出液对肿瘤细胞簇的影响（用两种染料对给药后的细胞簇进行染色，红色代表死细胞、绿色代表活细胞，上排的是对照组给药前后细胞簇（细胞数量）有所增大、而且基本都是活细胞（绿色），下排是给药组，给药后细胞簇（细胞数量）有所减小、而且基本都是死细胞（红色））。

图12a照片显示姜黄素纳米分散膜治疗14天后小鼠肿瘤组织实物图片。

图12b姜黄素纳米分散膜对小鼠肿瘤生长的在体抑制效果（左图是肿瘤组织体积随时间的变化，右图是肿瘤生长第28天（治疗第14天）肿瘤的体积统计）。

图13姜黄素纳米分散膜治疗后小鼠肿瘤组织切片brdu免疫组化染色结果（上排是为空白明胶膜组、下排为姜黄素纳米分散膜治疗组，右图是左图部分区域的放大，brdu染色越强表明细胞增殖活性越强，姜黄素纳米分散膜治疗后切片中brdu染色信号较弱，说明肿瘤细胞增殖活性被降低）。

图14姜黄素纳米分散膜治疗后小鼠肿瘤组织切片p-stat3免疫组化染色结果（上排是为空白明胶膜组、下排为姜黄素纳米分散膜治疗组，姜黄素纳米分散膜治疗后切片中p-stat3染色信号较弱，说明肿瘤细胞中p-stat3表达量降低）。

图15姜黄素纳米分散膜治疗后小鼠肿瘤组织切片bip免疫组化染色结果（上排是为空白明胶膜组、下排为姜黄素纳米分散膜治疗组，姜黄素纳米分散膜治疗后切片中bip染色信号较强，说明肿瘤细胞bip表达量上升）。

具体实施方式

为了便于理解本发明，现对本发明中的原料药作进一步说明。

姜黄素：

中文名：姜黄素

外文名：curcumin

cas号：458377

化学式：c21h20o6;（1e，6e）-1,7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮

分子量：368.39

密度l.307g/cm³

熔点183℃

沸点593.2℃（760mmhg下）

化学结构式:

明胶：

明胶是胶原部分水解后的产物，无色至浅黄色固体，成粉状、片状或块状。有光泽，无嗅，无味。相对分子质量约50000～100000。相对密度1.3～1.4。明胶因其具有较高的生物相容性、生物可降解性且体内降解后不产生其他副产物、无免疫原性和血液相容性以及具有与胶原相同的组分和生物性质，广泛应用于组织工程和药物递送系统中。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实验材料：

（1）人骨髓间充质干细胞（中国科学院细胞库）；

（2）dmem高葡萄糖培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；

（3）小鼠胰腺癌细胞399（bokong博士惠赠）；

（4）人胰腺癌细胞panc-1（中国科学院细胞库）；

（5）人胰腺癌细胞t3m4（上海源祉生物科技有限公司）；

（6）人胰腺癌细胞miapaca-2（中国科学院细胞库）。

实施例1：姜黄素纳米分散膜的制备

在常温下将1.5g明胶和0.1g姜黄素溶解于10ml三氟乙醇中，搅拌2小时使得姜黄素和明胶完全均匀混合溶解于三氟乙醇中。将该溶液装入10ml注射器中，使用0.4mm口径注射头、1.5ml/h进料速率、15kv直流电压进行静电纺丝获得含有姜黄素的纳米纤维膜。将制备的膜置于4℃的真空干燥箱中24小时，进行干燥去除残留有机溶剂，然后将所制备的纳米纤维膜放置于25％的戊二醛和1％乙醇混合溶液中，在20℃下孵育28小时，将处理后的姜黄素纳米分散膜用超纯水冲洗2次并于-40℃冻干24小时，制备完成姜黄素纳米分散膜（如图1）。

普通相机拍摄姜黄素分散膜如图2，扫描电镜（sem）证实纤维光滑，无可见结晶，提示姜黄素已经由晶体转化成为固态分散体均匀分布在明胶纳米纤维丝中（如图3）。将静电纺丝纺在载玻片上并用荧光显微镜检测，由于姜黄素本身具有荧光（绿色），可在荧光显微镜下呈现绿色荧光，证实姜黄素存在于纳米纤维（如图4）。x射线晶体衍射（xrd）证明姜黄素原药（晶体）的特征峰在载药纳米纤维膜中消失，证实姜黄素已从晶体转变为无定型态存在于纳米纤维膜中（如图5）。

实施例2：姜黄素纳米分散膜的体外释放实验

将1.5厘米×1.5厘米姜黄素纳米分散膜浸入50毫升磷酸盐缓冲盐水（pbs，ph7.4，37℃）。间隔一定时间200微升溶液，使用高效液相色谱对姜黄素含量进行测定，同时将等体积的pbs加回到原始系统中，以保持50毫升的总体积。

检测结果如图6所示，表明姜黄素可以从纳米分散膜溶解进入溶液，在姜黄素纳米分散膜浸入120小时后，缓冲液中的姜黄素浓度仍可达到约50μm以上。

实施例3：姜黄素纳米分散膜的生物相容性

我们进一步评估载药材料的生物相容性。将人骨髓间充质干细胞和载药材料体外共培养7日。通过ldh发现载药材料对正常干细胞没有毒性作用（如图7）；结果表明姜黄素分散膜与人体组织相容性好，符合药用标准。

实施例4：姜黄素纳米分散膜对体外肿瘤细胞的杀伤作用

a）将小鼠胰腺癌细胞399与空白明胶膜或姜黄素纳米分散膜共培养。2天后，用稀释的细胞裂解缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）加入蛋白酶抑制剂（上海碧云天生物技术有限公司）和磷酸酶抑制剂（上海碧云天生物技术有限公司）制备总蛋白。使用cellsignalingtechnology（赛信通（上海）生物试剂有限公司）的抗体（抗bip抗体（3177），抗p-perk（thr980）抗体（3179），抗p-eif2a（ser51）抗体（9721）和抗p-stat3抗体（9145））对bip、p-perk、p-stat3、p-elf2a和cleavedcaspase-3的表达量进行检测，gapdh被用作内参蛋白。

结果如图8显示经姜黄素纳米分散膜共培养后，小鼠胰腺癌细胞中cleavedcaspase-3，p-perk，bip和p-elf2a的表达上调，而p-stat3的表达降低.从而表明，姜黄素纳米分散膜可以通过增加胰腺癌细胞中活性氧的产生来触发内质网应激反应，即bip/p-perk/p-elf2a途径并抑制stat3的磷酸化，从而诱导胰腺癌细胞凋亡。

b）将姜黄素纳米分散膜浸入含有10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100µg/ml链霉素的dmem高葡萄糖培养基，72小时后获得含有5μm姜黄素的培养基。将小鼠胰腺癌细胞399、人胰腺癌细胞panc-1，t3m4和miapaca-2分别使用上述含有姜黄素的培养基在37℃和5％co2气氛下进行培养。7天后使用甲醇将细胞固定，用10％的结晶紫染色，并在显微镜下进行细胞克隆计数。

结果如图9所示，显示小鼠胰腺癌细胞399在含有姜黄素纳米分散膜浸出姜黄素的培养基中形成的细胞克隆数相比正常培养液约减少了60％（细胞克隆数：75.2±7.7（dmem）、29.6±6.5（姜黄素纳米分散膜浸出液））。姜黄素纳米分散膜浸出液在人胰腺癌细胞t3m4，miapaca-2和panc-1上也展示出相似的结果，表明姜黄素纳米分散膜浸出液可以有效的杀灭小鼠和人的胰腺癌细胞。

c）将2×10⁵个上述培养的人胰腺癌细胞t3m4，miapaca-2和panc-1以及鼠类胰腺癌细分别接种到10ml预冷的matrigel溶液中，在冰浴中轻轻吹打直至细胞与matrigel溶液充分混合。然后将一滴1.5ml含有〜3×10⁴细胞的matrigel溶液添加到6孔细胞培养板中。将matrigel在37℃下固化1小时后，向每个孔中加入3mldmem，并在37℃下培养24小时，然后将空白明胶膜或姜黄素纳米分散膜浸入媒介。14天后，将细胞簇用live/dead试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）染色，并通过荧光显微镜成像以观察死活细胞。

结果如图10和11所示，相较于空白明胶膜，姜黄素纳米分散膜给药组胰腺癌细胞簇体积明显变小，而且大部分细胞簇内细胞均为死细胞，说明姜黄素纳米分散膜不仅对培养的贴壁胰腺癌细胞具有杀伤作用，对于成团的胰腺癌细胞簇也具有有效的抑制增殖作用。

实施例5：姜黄素纳米分散膜对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤作用

a）将总共1×10⁶数量的小鼠胰腺癌细胞399皮下移植到8周龄野生型小鼠背部的两侧，其后每周测量肿瘤体积。14天后，进行手术以姜黄素纳米分散膜与空白材料放置于皮下接种的肿瘤和肌肉之间，紧贴在肿瘤之上。

结果如图12a和12b，显示加入姜黄素纳米分散膜后肿瘤体积增长速度相较于加入不含姜黄素的明胶膜明显降低，在加入姜黄素纳米分散膜14天（接种肿瘤28天）后，肿瘤体积仅为加入空白明胶膜对照组的五分之一左右，表明姜黄素纳米分散膜有效抑制了小鼠体内肿瘤的进一步增长。

b）将上述肿瘤组织切片去石蜡并重新水化，并使用柠檬酸盐缓冲液或蛋白酶k（上海碧云天生物技术有限公司）进行抗原修复。将内源性过氧化物酶和非特异性结合阻断后，将切片分别与抗bip、抗brdu、抗p-stat3抗体一起孵育。并使用带有hrp标记的二抗进行标记，使用dab染色工作液进行显色。然后用苏木精复染，脱水并固定。结果表明姜黄素纳米分散膜治疗后小鼠肿瘤组织切片中brdu染色信号明显减弱，说明肿瘤细胞增殖活性被降低；同时p-stat3染色信号也较弱，肿瘤细胞中p-stat3表达量降低；而bip染色信号较强，肿瘤细胞bip表达量上升，说明姜黄素纳米分散膜可以通过触发肿瘤组织中细胞内质网应激反应，即bip/p-perk/p-elf2a途径并抑制stat3的磷酸化实现对肿瘤增殖活性的有效抑制。

结果如图13-15所示，免疫组化也验证了增值细胞姜黄色材料组明显减少，内质网应激明显增加，p-stat3明显抑制。

实施例6：姜黄素纳米分散膜的制备及其体外释放、活性实验

在常温下将1.1g明胶和0.11g姜黄素溶解于10ml三氟乙醇中，搅拌2小时使得姜黄素和明胶完全均匀混合溶解于三氟乙醇中。将该溶液装入10ml注射器中，使用0.4mm口径注射头、1ml/h进料速率、16kv直流电压进行静电纺丝获得含有姜黄素的纳米纤维膜。将制备的膜置于4℃的真空干燥箱中28小时，进行干燥去除残留有机溶剂，然后将所制备的纳米纤维膜放置于25％的戊二醛和1％乙醇混合溶液中，在24℃下孵育24小时，将处理后的姜黄素纳米分散膜用超纯水冲洗2次并-45℃冻干20小时，制备完成姜黄素纳米分散膜。

切割出1.5厘米×1.5厘米制备完成的姜黄素纳米分散膜，将其浸入50毫升磷酸盐缓冲盐水（pbs，ph7.4，37℃）。间隔一定时间200微升溶液，使用高效液相色谱对姜黄素含量进行测定，同时将等体积的pbs加回到原始系统中，以保持50毫升的总体积。测定结果表明姜黄素可以从纳米分散膜溶解进入溶液，在姜黄素纳米分散膜浸入120小时后，缓冲液中的姜黄素浓度仍可达到约50μm以上。参照实施例3中方法，考察本实施例获得的姜黄素纳米分散膜对体外肿瘤细胞的杀伤作用。结果发现，与图8类似，经姜黄素纳米分散膜共培养后，小鼠胰腺癌细胞中cleavedcaspase-3，p-perk，bip和p-elf2a的表达上调，而p-stat3的表达降低。从而表明，姜黄素纳米分散膜可以通过增加胰腺癌细胞中活性氧的产生来触发内质网应激反应，即bip/p-perk/p-elf2a途径并抑制stat3的磷酸化，从而诱导胰腺癌细胞凋亡。与图9类似，本实施例的姜黄素纳米分散膜浸出液可以有效的杀灭小鼠和人的胰腺癌细胞。与图10和图11类似，本实施例的姜黄素纳米分散膜不仅对培养的贴壁胰腺癌细胞具有杀伤作用，对于成团的胰腺癌细胞簇也具有有效的抑制增殖作用。此外，参照实施例5中方法考察本实施例的姜黄素纳米分散膜对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明，本实施例的姜黄素纳米分散膜有效抑制了小鼠体内肿瘤的进一步增长。

实施例7：姜黄素纳米分散膜的制备及其体外释放、活性实验

在常温下将1.35g明胶和0.09g姜黄素溶解于10ml三氟乙醇中，搅拌2小时使得姜黄素和明胶完全均匀混合溶解于三氟乙醇中。将该溶液装入10ml注射器中，使用0.4mm口径注射头、2.5ml/h进料速率、17kv直流电压进行静电纺丝获得含有姜黄素的纳米纤维膜。将制备的膜置于4℃的真空干燥箱中20小时，进行干燥去除残留有机溶剂，然后将所制备的纳米纤维膜放置于25％的戊二醛和1％乙醇混合溶液中，在28℃下孵育20小时，将处理后的姜黄素纳米分散膜用超纯水冲洗2次并于-35℃冻干20小时，制备完成姜黄素纳米分散膜。

切割出1.5厘米×1.5厘米制备完成的姜黄素纳米分散膜，将其浸入50毫升磷酸盐缓冲盐水（pbs，ph7.4，37℃）。间隔一定时间200微升溶液，使用高效液相色谱对姜黄素含量进行测定，同时将等体积的pbs加回到原始系统中，以保持50毫升的总体积。测定结果表明姜黄素可以从纳米分散膜溶解进入溶液，在姜黄素纳米分散膜浸入120小时后，缓冲液中的姜黄素浓度仍可达到约50μm以上。参照实施例3中方法，考察本实施例获得的姜黄素纳米分散膜对体外肿瘤细胞的杀伤作用。结果发现，与图8类似，经姜黄素纳米分散膜共培养后，小鼠胰腺癌细胞中cleavedcaspase-3，p-perk，bip和p-elf2a的表达上调，而p-stat3的表达降低.从而表明，姜黄素纳米分散膜可以通过增加胰腺癌细胞中活性氧的产生来触发内质网应激反应，即bip/p-perk/p-elf2a途径并抑制stat3的磷酸化，从而诱导胰腺癌细胞凋亡。与图9类似，本实施例的姜黄素纳米分散膜浸出液可以有效的杀灭小鼠和人的胰腺癌细胞。与图10和图11类似，本实施例的姜黄素纳米分散膜不仅对培养的贴壁胰腺癌细胞具有杀伤作用，对于成团的胰腺癌细胞簇也具有有效的抑制增殖作用。此外，参照实施例5中方法考察本实施例的姜黄素纳米分散膜对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明，本实施例的姜黄素纳米分散膜有效抑制了小鼠体内肿瘤的进一步增长。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。