一种基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料、制备方法及应用与流程

本发明涉及磁共振成像介导的光动力治疗诊疗一体化材料领域，特别是涉及一种基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料、制备方法及应用。

背景技术：

目前，锰基纳米材料在磁共振成像(mri)诊断中运用越来越多，并且其诊断的多样性及其联合治疗得到科研工作者的重视。锰基纳米材料，包括mno2、mno、mn2o3、mn3o4和mnox纳米材料及其衍生物在生物成像、生物传感、药物或基因传递和肿瘤治疗等方面有着广泛的应用。锰基纳米材料在生物成像方面的能力主要是由于与h⁺、过氧化氢(h2o2)、谷胱甘肽(gsh)等发生反应，从而在肿瘤微环境中降解，导致靶部位锰离子浓度升高，提高mri效能。除此之外，锰基纳米材料的纳米体系还可以参与超声、光热成像、光声成像以及光热治疗和光动力治疗(pdt)等。

pdt已成为一种无创、光激发的癌症治疗模式，在浅表型肿瘤和深部肿瘤(食管癌、皮肤癌和非小细胞肺癌)都可进行治疗，并逐渐被临床认可。实现pdt需要整个过程主要有激发光、光敏剂和分子氧等要素^[45]。在特定波长的光源激发下，可以选择性地激活ps，产生一系列的活性氧自由基(ros)，继而出现细胞毒性、血管损伤和免疫调节等，最终诱导癌细胞死亡。在pdt治疗过程中，光源具有时间和位置的可控性，可以避开正常组织在肿瘤中选择性滞留，精准产生和释放ros，从而实现肿瘤特异性pdt且副作用降到最低。由于ros能够激活急性炎症反应，增强肿瘤的免疫原性，增强t细胞浸润，因此pdt可能产生强烈的免疫反应，增强检查点的阻断治疗。更重要的是，pdt中生成的ros既可以直接通过诱导肿瘤细胞凋亡/坏死杀死癌细胞，也可以通过产生肿瘤特异性免疫间接杀死癌细胞，从而产生协同的pdt/免疫治疗。用于pdt的光敏剂种类多样，常见的光敏剂包括卟啉相关的大环化合物，非卟啉相关的酞菁、金丝桃素、卟吩，吩噻嗪类化合物以及金属衍生物。其中，金丝桃素是一种常见的药用植物贯叶连翘的提取物，其单体高度疏水，给药时需要载体，常见的载体有脂质体、胶束、纳米颗粒等。

因此，开发一种既可以用作磁共振成像对比剂又可以用作光动力治疗的新型纳米材料，即满足上述的高效磁共振成像及光动力治疗诊疗一体化的目的，这是本领域技术人员需要解决的问题。

申请人前期申请的公开号为201510043825.6的发明专利申请公开了一种聚甘油结构树枝状大分子及其制备方法和应用，所述聚甘油结构树枝状大分子的结构式如式(i)所示。本发明的聚甘油结构树枝状大分子，其内部含有大量的醚键，具有良好的生物相容性，且生理条件下化学结构稳定；其表面含有大量的反应性基团，可用来键合多种药物，分子探针以及靶向基团，其内核具备的空腔结构也可负载药物和生物探针，可以作为生物载体材料广泛地用于药物、基因、造影剂，生物探针的输送；本发明的制备方法，合成步骤少，分离纯化简单，容易合成高分子量的树枝状大分子，大幅提高了聚甘油结构树枝状大分子的合成效率，使得这种具有广泛应用前景的树枝状大分子规模化生产成为可能。

技术实现要素：

本发明提供了一种新的纳米材料，为一种基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料，该纳米材料具有较高的弛豫率并且在光照(595nm)条件下具有很高光动力转化效率，可以作为磁共振对比剂和光动力治疗剂，应用于磁共振成像和光动力治疗中，以实现肿瘤的诊疗一体化。

一种基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料的制备方法，在水介质中加入金丝桃素、氯化锰和表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子，产物自组装形成所述基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料，

其中，表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子的结构式如式i所示：

所述金丝桃素为单体金丝桃素，分子式：c30h16o8，分子量：504.45，cas号：548-04-9，其结构式如下所示：

优选的，金丝桃素、氯化锰和表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子的投料质量比为0.004∶5.04∶50。

优选的，反应体系中表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子与水介质的质量体积比为50mg∶5.4ml。

优选的，氯化锰和表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子均为水溶液，金丝桃素溶解在二甲亚砜中，

反应步骤为：将金丝桃素的二甲亚砜溶液加入表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子的水溶液中，避光搅拌1小时，再将氯化锰水溶液滴加入反应液中，滴加完毕后调节反应液ph至9，室温搅拌反应2小时。应结束后的溶液采用的透析膜在去离子水中透析除去多余的mn离子，用3500da的超滤膜离心管浓缩并定容，最终棕色纳米粒溶液。

本发明的制备方法中，氯化锰在碱性条件下发生氧化还原反应，氧化形成二氧化锰(mno2)颗粒；mno2颗粒和金丝桃素包裹在表面带有半胱氨酸的聚甘油结构树枝状大分子中，形成球状纳米级材料。

本发明又提供了所述制备方法制备的基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料。

本发明通过将mno2颗粒和金丝桃素同时接在表面带有半胱氨酸的树枝状大分子上，从而制备了基于锰基树枝状大分子复合纳米对比剂，得到粒径大小为109nm之间，弛豫率为5.8mm^-1s^-1之间的球状纳米颗粒，高于临床小分子钆对比剂的弛豫率，具有较好的造影效果，并且可以通过纳米级大分子对比剂的epr效应富集在肿瘤组织中，提高mri的灵敏度，提升早期癌症的诊断水平。

本发明还提供了所述基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料在制备磁共振成像对比剂和/或光动力治疗剂中的应用。本发明制备的纳米材料在波长为595nm具有一定量的吸收，研究发现，将本发明的纳米材料作用到肿瘤细胞中，在光照条件下，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，因此，可以将其作为光动力治疗剂。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明通过自组装制备高效的基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料，具有弛豫效率较高，体内循环时间长、肾清除迅速、靶向性、生物兼容性高和毒副作用小等优点。

(2)本发明制得的纳米材料在595nm具有较高光动力转化效率，可以作为光敏剂应用到光动力治疗中，另外借助磁共振技术监测肿瘤的位置、大小以及光治疗剂在肿瘤组织中的富集情况，用于评价治疗效果，实现磁共振成像介导的光动力治疗诊疗一体化。

附图说明

图1为纳米材料dhm在水中的动态光散射仪测得的粒径分布图。

图2为纳米材料dhm透射电镜图。

图3为纳米材料dhm磁共振对比剂的弛豫率与锰浓度的关系。

图4为纳米材料dhm各个浓度的体外磁共振成像图。

图5为在有或无激光照射下，dhm对4t1细胞增值效果图(595nm，0.25mwcm^-2，5min)。

图6为纳米材料dhm作为磁共振对比剂增强原位乳腺肿瘤磁共振成像图(a)以及信号强度定量图(b)。

图7为纳米材料dhm作为磁共振对比剂增强小鼠肝脏层面的冠状位磁共振成像图。

图8为纳米材料dhm对4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验中肿瘤生长曲线图。

图9为纳米材料dhm对4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验过程中，balb/c小鼠体重变化曲线图。

具体实施方式

实施例1

1、纳米材料的制备

(1)第1代表面带氨基酸基团的聚甘油结构树枝状大分子(g1-cys，50mg，结构式如式i所示)溶解于5ml水中，加入光动力学药物金丝桃素的二甲亚砜(dmso)溶液(0.2mgml^-1，20μl)，避光搅拌1小时，随后滴加mncl2(12.6mgml^-1，400μl)，调至溶液ph至9，室温再搅拌2小时。

(2)继续在室温下、避光反应3小时。

(3)透析膜(3500da)在去离子水中透析纯化24小时。

(4)用超滤膜离心管(3500da)浓缩并定容得到棕色dhm纳米粒溶液

2、纳米材料的性能分析

(1)采用动态光散射粒度仪(dls)测定dhm纳米对比剂(上述制备的dhm纳米粒)的平均粒径和粒径分布。取0.5mgml^-1(1ml)的dhm纳米对比剂溶液置于dls仪器进行测定，如图1所示，dhm纳米对比剂平均粒径在109nm，粒径多分散系数(polydispersityindex，pdi)为0.15，zeta电位为-7.2mv。

(2)采用透射电子显微镜(tem)测定dhm纳米对比剂的形貌、分布和粒径大小。取0.5mgml^-1(1ml)的dhm纳米对比剂溶液浸没在铜网(400目，碳支持膜)中5分钟左右，镊子轻轻取出铜网，再用洁净的滤纸吸除多余液体并烘干，置于tem仪器上，观察样品的形貌与粒径并存储图像。如图2所示，由tem再次验证了纳米颗粒的尺寸，并且可以看到纳米对比剂呈较规则的均一球形，而且大小都比较均匀。

(3)使用0.52t微型磁共振成像仪测定dhm纳米对比剂溶液的弛豫率。利用反转恢复法测定不同浓度dhm纳米对比剂溶液(mn离子浓度0.05-0.20mm)的纵向弛豫时间(t1)，然后将得到的t1值倒数作图，其斜率为dhm在不同条件下的纵向弛豫率r1纵向弛豫率(r1)。如图3所示，纳米材料dhm的锰含量为4.15％，dhm的r1为5.8mm^-1s^-1。

(4)dhm纳米对比剂的体外mri实验：将1.5ml去离子水和等量的4种不同浓度dhm纳米对比剂溶液(mn离子浓度为0.05-0.20mm)分别置于2ml离心管中进行mri。设备为discovery750w3.0t，gehealthcare系统，成像参数如下：tr为200ms，te为3ms，分辨率512×512。如图4所示，最右侧纯净水为对照，dhm纳米对比剂溶液浓度升高，信号明显升高，具有浓度依赖性，浓度越高，信号越强。

(5)采用mtt法检测dhm纳米对比剂对4t1细胞株的体外毒性。处于对数生长期的4t1细胞分别铺在96孔板中培养过夜贴壁后，加入不同浓度的dhm纳米对比剂和hyp2小时后，细胞暴露于黄光照射(595nm，0.25mwcm^-2，5min)，再孵育24小时，孵育时间完成后再在各个孔中加入20μlmtt溶液(5mgml^-1)，继续孵育4小时，有代谢活性的细胞能将mtt还原成蓝紫色的晶体沉淀(甲臌)，离心弃培养基后加入dmso使蓝紫色晶体完全溶解，最后将96孔板置于酶标仪上读取吸光度值(562nm与620nm的差值)，间接反映dhm纳米对比剂对细胞的毒性作用。如图5所示，dhm纳米对比剂+光照组，hyp单体+光照组两组对4t1细胞的毒性较强，ic50值分别为0.18μgml^-1、0.94μgml^-1，均有较高的抗肿瘤活性。而hyp单体和dhm纳米对比剂单独使用时抗肿瘤效果欠佳，ic50值分别为4.31μgml^-1、4.77μgml^-1。hyp单体配合光动力治疗杀伤肿瘤细胞效果好，但是其单体水溶性差，体内给药难度大；而dhm纳米对比剂在各介质中均有良好的分布，配合光照具有高效的抗肿瘤效果。

(6)通过mri观察dhm纳米对比剂在荷瘤小鼠的肿瘤诊断作用。荷瘤4t1小鼠经尾静脉注射dhm纳米对比剂组(0.1mmolkg^-1mn)后，采集横断位t1wi图片及测定其信号值，并进行分析和绘图。如图6所示，(a)dhm纳米粒前，肿瘤与周边肌肉的t1信号接近，信号均较低。注射dhm纳米粒5分钟后，肿瘤周围均出现了明显的强化。随着时间的延长，肿瘤信号不断增强，在30分钟达到高峰，而后信号逐渐下降。(b)注射dhm纳米对比剂后肿瘤cnr明显升高。注射dhm纳米对比剂30分钟后肿瘤的cnr最高，约为62。dhm纳米对比剂具有较长的血液循环时间，可通过epr效应在肿瘤中积累。由于dhm纳米对比剂在肿瘤微环境中的分解和氧化还原，大量mn离子释放使其肿瘤部位的t1信号明显升高，可观察时间窗较长。由此可见，dhm纳米对比剂在小鼠乳腺癌模型中有出色的增强mri能力，大大提高了检测肿瘤的敏感性。

(7)通过mri观察dhm纳米对比剂在空白小鼠体内的分布与代谢情况。空白小鼠经尾静脉注射前或注射dhm纳米对比剂(0.1mmolkg^-1mn)后，采集冠状位t1wi图像。如图7所示，肝脏在dhm纳米对比剂注射后3小时高度强化，易与周围组织分离；注射后1天，肝脏信号明显降低，提示dhm纳米对比剂一部分可被肝脏摄取，降解并从消化道排出。肾脏在dhm纳米对比剂注射后3小时也有明显的强化，注射后6小时肾实质与肾盂容易区分，具有较高的对比度，主要是由于mn离子在肾脏的高分布。由注射dhm纳米对比剂后1天与注射后3天mri可见，肾脏和肝脏的信号衰减到与未打药前基本一致，证实了dhm可在体内代谢排出。

(8)前文在体外证明了dhm纳米对比剂有出色的细胞光动力杀伤效果，本实验进一步研究其在体内的光动力抑瘤效果。首先建立小鼠原位乳腺癌模型：4t1鼠源乳腺癌细胞(5×10⁵，200μl)接在雌性balb/c小鼠左侧腹部第三对乳腺处。肿瘤平均体积达到65mm³后，小鼠随机分成4组(n＝5)：pbs组、hyp单药+光照组(hyp10μgkg^-1)、dhm纳米对比剂组和dhm纳米对比剂(hyp当量10μgkg^-1)+光照组(595nm，2.5wcm^-2，5min)。仅一次给药，随后密切观察小鼠状态，每两天测量肿瘤体积和体重。如图8所示，4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠随机分成4组(n＝5)：小鼠随机分成4组(n＝5)：pbs组、hyp单药+光照组(hyp当量10μgkg^-1)、dhm纳米对比剂组和dhm纳米对比剂+光照组(595nm，2.5wcm^-2，5min)。仅一次给药，随后密切观察小鼠状态，每两天测量肿瘤体积和体重。由图8所示，在dhm+光照组的肿瘤完全消失，而仅dhm组、hyp+光照组和pbs组三组肿瘤生长较快，具有统计学差异(p<0.001)。如图9所示，实验组与其他三组对照组的小鼠均未出现明显的体重下降。表明dhm纳米粒具有良好的生物相容性，经尾静脉注入后在短时间内不会引起急性毒性。