唾液酸衍生物修饰的依鲁替尼纳米复合物及其制备方法与流程

本发明属于医药
技术领域：
，涉及唾液酸衍生物修饰的依鲁替尼纳米复合物及其制备方法和应用，还涉及以依鲁替尼纳米复合物作为活性成分的药物组合物。
背景技术：
：肿瘤(tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物(heims,mitelmanf.cancercytogenetics:chromosomalandmoleculargeneticaberrationsoftumorcells,fourthedition[m].2015)。根据肿瘤细胞特性和对机体的危害程度，医学界一般将肿瘤分为良性肿瘤与恶性肿瘤两大类，恶性肿瘤又称为癌症(englanddm,hochholzerl,mccarthymj.localizedbenignandmalignantfibroustumorsofthepleura.aclinicopathologicreviewof223cases[j].americanjournalofsurgicalpathology,1989,13(8):640.)。进入21世纪后，恶性肿瘤已经成为除心血管疾病以外人类的头号杀手。2018年2月，国家癌症中心发布的最新一期的全国癌症统计数据显示：(1)全国癌症的发病率以惊人的速度增长，2014年全国恶性肿瘤估计新发病率数380.4万例(男性211.4万例，女性169.0万例)，平均每分钟就有7人被确诊为癌症；(2)国内不同地区恶性肿瘤发病率有所不同，随恶性肿瘤发病率由高到低排列依次为东部、中部、西部，其中各地区男性发病率均高于女性；(3)全国各地区肿瘤发病情况与患者年龄息息相关，0～30岁恶性肿瘤发病率较低，30岁以上人群发病率快速增长，80岁以后达到高峰；(4)在全国范围内，肺癌位居全国肿瘤发病率首位，每年发病约78.1万，其后依次是胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病率的第1位(陈万青,孙可欣,郑荣寿,等.2014年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[j].中国肿瘤,2018,27(1):1-14)。随着全球人口的不断增长与老龄化，加上越来越多的人群沾染上不健康的生活习惯，肿瘤的发病率与死亡率已呈逐年上升的趋势，如何有效地治疗肿瘤已成为人类必须面对的世界性难题。聚乙二醇化多柔比星脂质体是美国fda批准的第一种用于治疗恶性肿瘤的纳米药物(1995)(barenholzy.--thefirstfda-approvednano-drug:lessonslearned[j].journalofcontrolledrelease,2012,160:117-34.)，在被动靶向脂质体制剂的开发中起着重要的作用(gabizona,cataner,uzielyb,kaufmanb,safrat,cohenr,etal.prolongedcirculationtimeandenhancedaccumulationinmalignantexudatesofdoxorubicinencapsulatedinpolyethylene-glycolcoatedliposomes[j].cancerresearch,1994,54:987-92.)。然而，在过去的二十年中，包括在内的常规化疗药物存在许多不可避免的缺陷，包括较低的治疗效果和严重的毒副作用(solomanr,gabizonaa.clinicalpharmacologyofliposomalanthracyclines:focusonpegylatedliposomaldoxorubicin[j].clinicallymphoma&myeloma,2008,8:21-32.)(damsetm,lavermanp,oyenwjg,stormg,scherphofgl,meerjwmvd,etal.acceleratedbloodclearanceandalteredbiodistributionofrepeatedinjectionsofstericallystabilizedliposomes[j].journalofpharmacology&experimentaltherapeutics,2000,292:1071-9.)(szebenij,muggiaf,gabizona,barenholzy.activationofcomplementbytherapeuticliposomesandotherlipidexcipient-basedtherapeuticproducts:predictionandprevention[j].advanceddrugdeliveryreviews,2011,63:1020-30.)。这表明对于恶性肿瘤而言，迫切需要一种更为有效的治疗策略(maruyamak,ishidao,takizawat,moribek.possibilityofactivetargetingtotumortissueswithliposomes[j].advanceddrugdeliveryreviews,1999,40:89-102.)(chok,wangx,nies,chenzg,shindm.therapeuticnanoparticlesfordrugdeliveryincancer[j].clinicalcancerresearch,2008,14:1310-6.)。众所周知，在恶性肿瘤的生长和侵袭过程中，肿瘤细胞并不是孤立生长的，需要创造适合其生长的“土壤”，而这种适合肿瘤细胞生长的局部微环境，也称为肿瘤微环境(tumormicroenvironment，tme)。在肿瘤生长阶段，先天免疫细胞由于局部稳态的破坏而被激活(gaos,yangd,fangy,etal.engineeringnanoparticlesfortargetedremodelingofthetumormicroenvironmenttoimprovecancerimmunotherapy[j].theranostics,2019,9(1):126.)。中性粒细胞，巨噬细胞和肥大细胞等对这种局部失衡做出强烈反应，通过释放介质来招募和激活额外的免疫细胞，以对抗这种干扰并激活适应性免疫系统。浸润到肿瘤组织的免疫细胞以各种形式影响肿瘤的生长和侵袭，包括促进血管生成和细胞外基质的重塑(schiffelersrm,stormg.liposomalnanomedicinesasanticancertherapeutics:beyondtargetingtumorcells[j].internationaljournalofpharmaceutics,2008,364(2):258-264.)。然而，最新研究表明肿瘤细胞的“智慧”远远不止于重塑“周边环境”，而将“魔爪”伸向机体的整个免疫系统。报道显示，肺癌细胞能够远程调控成骨细胞，即肺癌细胞与腿部骨骼中的成骨细胞能够远程互相促进。研究人员发现，肺癌模型的小鼠全身多处骨骼骨密度升高，新骨生成，成骨细胞增多，破骨细胞无显著变化，并且70％的肺癌患者中(包括未发生骨转移的患者)也存在这样的情况，从而体现出将癌症作为全身性疾病加以研究的重要性。通过小鼠肺癌模型证明，siglecf高表达的中性粒细胞起了媒介作用(engblomc,pfirschkec,zilionisr,etal.osteoblastsremotelysupplylungtumorswithcancer-promotingsiglecfhighneutrophils[j].science,2017,358(6367):eaal5081.)(备注：siglec的全称是sialicacid-bindingimmunoglobulin-typelectins，即唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素，包括siglec-1～siglec-17，存在于中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓系祖细胞、b细胞、dc、nk等细胞表面，siglecf与siglece存在于小鼠与大鼠体内，人类比鼠类有更多的siglec)。2013年，chen等人提出“肿瘤免疫循环”的概念(chends,mellmani.oncologymeetsimmunology:thecancer-immunitycycle[j].immunity,2013,39(1):1-10.)，具体包括：①死亡癌细胞释放抗原；②肿瘤抗原提呈；③启动与激活；④t细胞运输至肿瘤部位；⑤t细胞浸润肿瘤；⑥t细胞识别癌细胞；⑦癌细胞被杀死。这些步骤分别发生在肿瘤、淋巴结与血液循环当中，意味着肿瘤治疗策略不能仅仅着眼于肿瘤实质细胞或者肿瘤微环境，更应该放眼于全身性免疫系统。近年来，大量研究报道了基于机体免疫系统而不是肿瘤细胞自身的免疫疗法，为我们提供了一种全新的肿瘤治疗思路(massó-vallésd,jausett,serranoe,etal.ibrutinibexertspotentantifibroticandantitumoractivitiesinmousemodelsofpancreaticadenocarcinoma[j].cancerresearch,2015,75(8):1675-1681.)。鉴于免疫细胞在恶性肿瘤生长的各个阶段均有重要的影响，有必要基于肿瘤免疫学的角度重新探讨恶性肿瘤治疗策略(chends,mellmani.oncologymeetsimmunology:thecancer-immunitycycle[j].immunity,2013,39(1):1-10.)，将机体免疫系统与肿瘤细胞的串联放在更重要的位置。洞悉免疫系统和肿瘤细胞的复杂关系，才能更好地阻断肿瘤细胞的增殖和转移；充分调动机体免疫系统，才能将恶性肿瘤这株“枝繁叶茂”的大树连根拔起，从源头处“扼杀”肿瘤细胞。依鲁替尼(ibrutinib，ibr，曾用代号pci-32765)是全球首个上市的布鲁顿酪氨酸激酶(brutontyrosinekinase，btk)选择性和共价抑制剂(davidsms,brownjr.ibrutinib:afirstinclasscovalentinhibitorofbruton'styrosinekinase[j].futureoncology,2014,10(6):957-967.)。现已通过突破性药物、优先审评、加速批准、孤儿药资格等多种快速途径获得美国fda批准治疗复发性或难治性套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，mcl)、经治慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，cll)和waldenstrom巨球蛋白血症等(jerkemanm,hallekm,dreylingm,etal.targetingofb-cellreceptorsignallinginb-cellmalignancies[j].journalofinternalmedicine,2017.)。除了b淋巴细胞外，btk还在巨噬细胞，中性粒细胞，以及肥大细胞等多种免疫细胞中过表达(molina-cerrilloj,alonso-gordoat,gajatep,etal.bruton’styrosinekinase(btk)asapromisingtargetinsolidtumors[j].cancertreatmentreviews,2017,58:41-50.)，并通过多种途径共同促进肿瘤细胞的增殖和侵袭(gundersonaj,kanedamm,tsujikawat,etal.brutontyrosinekinase–dependentimmunecellcross-talkdrivespancreascancer[j].cancerdiscovery,2016,6(3):270-285.)。作为btk的理想抑制剂，ibr已被证实可以通过抑制btk激活的方式，压制多种肿瘤生长相关白细胞的活性，从而对肿瘤的生长以及浸润加以控制(maffeir,fiorcaris,martinellis,etal.targetingneoplasticbcellsandharnessingmicroenvironment:the“doubleface”ofibrutinibandidelalisib[j].journalofhematology&oncology,2015,8(1):60.)。目前，一些临床试验评估了ibr对转移性胰腺癌(nct02436668)、皮肤黑色素瘤(nct02581930)和egfr突变阳性非小细胞肺癌(nct02321540)等多种实体瘤的疗效(rauff,festaf,parkjg,mageem,eatons,rinaldic,etal.ibrutinibinhibitionoferbb4reducescellgrowthinawnt5a-dependentmanner[j].oncogene,2018,37(17):2237–50.)。依鲁替尼的上市剂型为胶囊剂，规格140mg/粒，商品名辅料包括羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、微晶纤维素、月桂基硫酸钠。口服，1次/d，4粒/次(560mg)用于治疗mcl；口服，1次/天，3粒/次(420mg)用于治疗cll。不良反应主要包括出血、感染、骨髓抑制、肾毒性、第二原发恶性肿瘤、胚胎-胎儿毒性(张建忠.2014年2月fda批准新药概况[j].上海医药,2014,(7):60-61)。mcl患者中最常见发生不良反应(≥20％)是血小板减少、腹泻、中性粒细胞减少、贫血、疲乏、肌肉骨骼痛、周边水肿、上呼吸道感染、恶心、瘀伤、呼吸困难、便秘、皮疹、腹痛、呕吐和食欲减低。cll患者中最常见不良反应(≥20％)是血小板减少、腹泻、瘀伤、中性粒细胞减少、贫血、上呼吸道感染、疲乏、肌肉骨骼痛、皮疹、发热、便秘、周边水肿、关节痛、恶心、口腔炎、窦炎和眩晕。最常见3或4级非血液学不良反应(≥5％)是肺炎、高血压、心房纤颤、窦炎、皮肤感染、脱水、和肌肉骨骼痛(陈本川.治疗套细胞淋巴瘤及慢性淋巴细胞白血病新药—依鲁替尼(ibrutinib)[j].医药导报,2014,33(10):1336-1338.)。空腹情况下，口服依鲁替尼胶囊剂的绝对生物利用度为2.9％，服用食物的绝对生物利用度是空腹的2倍。健康人口服单剂量放射性14c标记的ibr后，约90％的放射性药物在168小时被体内清除，其中80％从粪便排出，近10％从尿液排出。在标记的粪便排泄物中，近1％是原形药，而尿液排泄物中无原形药，这也提示ibr大部分都被体内代谢(scheerse,leclercql,dejj,etal.absorption,metabolism,andexcretionoforal14cradiolabeledibrutinib:anopen-label,phasei,single-dosestudyinhealthymen[j].drugmetabolism&dispositionthebiologicalfateofchemicals,2015,43(2):289-297.)。作为小分子抑制剂，ibr的口服生物利用度极低，体内清除速率较快，导致较短的血液循环时间，极低的肿瘤靶向效率，严重影响了其在实体瘤中的疗效，增加了其毒副作用(usecfmpfh.guidelineontheinvestigationofbioequivalence.london:europeanmedicinesagency,2010.)。唾液酸(sialicacid，sa)又称糖酸，是一类九碳单糖，它主要以短链残基的形式通过α-糖苷键连接于糖蛋白、糖脂与寡糖的末端，普遍存在于哺乳动物的细胞膜表面，其中红细胞及血管内皮细胞表面被高度唾液酸化(borngv,palinskiw.unusuallyhighconcentrationsofsialicacidsonthesurfaceofvascularendothelia[j].britishjournalofexperimentalpathology,1985,66(5):543.)。研究表明，红细胞经唾液酸酶处理后其寿命从原来的120天锐减到短短数小时(boonsgj,demchenkoav.recentadvancesino-sialylation[j].chemicalreviews,2000,100(12):4539-4566.)。另外，许多病原体利用sa“装扮”自身，以掩蔽自身抗原表位，抑制补体的旁路激活途径，降低免疫原性进而成功逃脱宿主免疫系统的攻击(charlandn,kobischm,martineau-doizéb,etal.roleofcapsularsialicacidinvirulenceandresistancetophagocytosisofstreptococcussuiscapsulartype2[j].femsimmunology&medicalmicrobiology,1996,14(4):195-203.)。当纳米粒进入体内后，无法完全避开免疫系统，容易产生复杂的免疫响应，因此有必要用免疫学的思维方式来考虑纳米制剂的问题。本课题组曾经提出免疫药剂学(immunopharmaceutics或者immunopharmacy)的概念，用免疫学的理论，完善药剂学相关理论的构建，指导处方设计、制备工艺、质量控制与合理应用。简而言之，免疫药剂学就是应用免疫学的基本理论、方法、技术和手段，研究药剂学中有关制剂产品设计的一门理论学科。由于免疫系统极为复杂，可谓是“牵一发而动全身”，各种因素都会影响免疫系统，包括药剂学的各种指标，如材料种类、药物种类、剂量、粒径大小、形状、荷电性、载药量等。因此，我们意识到sa既可以发挥免疫伪装作用，又可以介导药物的靶细胞高效递送(luox,lium,hul,etal.targeteddeliveryofpixantronetoneutrophilsbypoly(sialicacid)-p-octadecylamineconjugatemodifiedliposomeswithimprovedantitumoractivity[j].internationaljournalofpharmaceutics,2018,547(1-2):315-329.)。除此之外，sa的受体在多种白细胞表面高表达，其中包括胞质中富含btk的中性粒细胞和巨噬细胞等。通过与中性粒细胞和巨噬细胞等细胞表面上的selectin、siglec受体结合，实现靶向递送药物目的，提高ibr在免疫细胞中的累积，从而扩大肿瘤治疗谱，达到免疫治疗的目的。ibr的口服生物利用度极低，体内清除速率较快，导致较短的血液循环时间，极低的肿瘤靶向效率，严重影响了其在实体瘤中的疗效。而注射剂虽然具有起效快，生物利用度高的特点，但是由于其制备过程中存在的大量问题也导致现有技术中仍然没有注射剂的剂型，也没有相关的文献报道。技术实现要素：：本发明的目的在于，制备一种唾液酸衍生物修饰的新型依鲁替尼纳米复合物肿瘤靶向制剂，解决依鲁替尼目前临床没有注射剂型的难题。针对依鲁替尼不溶于水，胶囊剂绝对生物利用度仅有2.9％，以及临床给药剂量大的问题，将其制成纳米复合物，以增加依鲁替尼的水溶性，提供一种可以注射的产品用于降低药物日剂量，并且可用于临床危重患者，解决该类患者无法口服药物的难题。基于“免疫药剂学”的理论，采用唾液酸对复合物进行修饰，提高制剂在肿瘤部位的累积及对肿瘤进展相关免疫细胞的抑制作用，从而扩大依鲁替尼的肿瘤治疗谱，提高药物疗效。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：唾液酸衍生物修饰依鲁替尼纳米复合物，包括依鲁替尼，磷脂和唾液酸衍生物，依鲁替尼和磷脂的摩尔比为1：0.5～1：5，唾液酸衍生物与磷脂的摩尔比为1：19～1：1。磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和心肌磷脂中的一种或几种。可以是天然、半合成与全合成，如蛋黄磷脂酰甘油(epg)、氢化蛋黄脂磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dmpg)中的一种或两种以上磷脂。本发明的磷脂优选磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇，可采用一种或者两种以上磷脂的组合物。本发明所述的唾液酸衍生物由唾液酸甲酯、唾液酸乙酯或唾液酸与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸通过化学键偶联得到。优选地，本发明所述的唾液酸脂质衍生物的结构如下：化合物1(mt-18)：化合物2(mt-16)：化合物3(sa-18)：化合物4(et-18)：上述的唾液酸衍生物修饰依鲁替尼纳米复合物中，依鲁替尼和磷脂的摩尔比为1：1～1：4。上述的唾液酸衍生物修饰依鲁替尼纳米复合物中，优选地，依鲁替尼和磷脂的摩尔比为1：2～1：3。上述的唾液酸衍生物修饰依鲁替尼纳米复合物中，唾液酸衍生物与磷脂的摩尔比为1：4～1：1。上述的唾液酸衍生物修饰依鲁替尼纳米复合物中，优选地，唾液酸衍生物与磷脂的摩尔比为3：7～1：1.5。根据具体情况，可以采用葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油、氯化钠等物质，调节渗透压，达到符合注射要求。也可进行冷冻干燥或者喷雾干燥，获得固体产品。处方中还可以加入其它辅料，如edta(二钠盐、钙钠盐)、人血清白蛋白、泊洛沙姆、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、多糖类物质(如人参多糖、黄芪多糖、香菇多糖)与ph调节剂等。本发明还提供了唾液酸衍生物修饰依鲁替尼纳米复合物的制备方法，其通过如下方法制备：将依鲁替尼、磷脂和唾液酸衍生物溶于适量的有机溶剂中，在一定温度下搅拌反应一定时间后，除去有机溶剂，得到唾液酸衍生物修饰的依鲁替尼纳米复合物。可以进一步采用冷冻干燥或者喷雾干燥技术。其中，所述的有机溶剂为：甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮中的一种或者两种以上的组合。依鲁替尼在有机溶剂中的质量体积浓度为2.5mg/ml～20mg/ml。所述的反应温度为：20～60℃。本发明还提供了含有如上纳米复合物的药物组合物，所述的药物组合物为所述的纳米复合物与药学上可接受的赋形剂制备的临床上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、软膏剂、口服液剂、输液剂、注射剂等制剂。所述的药学上可接受的赋形剂可以为药学上可接受的抗氧剂、稀释剂、粘合剂等。本发明首次采用将依鲁替尼制备为平均粒径在纳米级别的复合物，其粒径为20-100nm，进一步制备肿瘤靶向纳米注射液，s180荷瘤小鼠注射后呈现出极佳的抗肿瘤效果。由于体外细胞研究结果表明，依鲁替尼对肿瘤细胞无明显杀伤作用，因此，本发明提出治疗肿瘤新策略，唾液酸介导的肿瘤治疗策略并非针对肿瘤细胞自身，而是通过抑制肿瘤进展相关免疫细胞，从而压制肿瘤的生长，侵袭和转移。最为重要的是，本发明意外发现，唾液酸修饰的依鲁替尼纳米复合物扩大了肿瘤治疗谱，从慢性淋巴细胞白血病(cll)等血液肿瘤扩大到肉瘤、乳腺癌、肺癌等实体瘤。附图说明图1为唾液酸甲酯衍生物的合成路线图2为唾液酸甲酯衍生物的核磁图谱图3为唾液酸甲酯衍生物的质谱图图4为依鲁替尼原料药及不同蛋黄磷脂酰甘油/依鲁替尼摩尔比的唾液酸修饰复合物在去离子水溶液中的外观情况图5为不同唾液酸修饰密度对s180荷瘤昆明鼠肿瘤生长抑制图6为不同唾液酸修饰密度对s180荷瘤昆明鼠体重影响图7为不同唾液酸修饰密度对s180荷瘤昆明鼠的抑瘤指数影响图8为非修饰复合物与唾液酸修饰复合物的透射电子显微镜(tem)成像图a：非修饰复合物b：唾液酸修饰复合物图9为各依鲁替尼制剂在不同ph条件下的溶解度图10为非修饰复合物与唾液酸修饰复合物的体外释放过程图11为小鼠白血病细胞对依鲁替尼制剂的摄取情况考察a：流式细胞仪分析b：细胞摄取平均荧光强度图12为激光共聚焦显微镜分析依鲁替尼制剂在小鼠白血病细胞内的摄取情况图13为依鲁替尼制剂wistar大鼠体内药动学行为图14为依鲁替尼制剂在s180荷瘤昆明鼠体内荧光成像a：荷瘤小鼠在体荧光呈像b：离体脏器荧光成像图15为依鲁替尼制剂在s180荷瘤昆明鼠体内的组织分布情况a：荷瘤小鼠在体荧光强度变化b：离体脏器荧光强度图16为依鲁替尼制剂在s180荷瘤昆明鼠肿瘤组织分布情况a：肿瘤切片荧光成像b：肿瘤相关巨噬细胞荧光成像图17为s180荷瘤昆明鼠肿瘤生长曲线图18为s180荷瘤昆明鼠体重变化图19为s180荷瘤昆明鼠抑瘤指数图20为依鲁替尼制剂对s180肉瘤细胞毒性分析图21为小鼠肿瘤组织细胞增殖情况图22为小鼠肿瘤组织激活的布鲁顿络氨酸激酶表达情况图23为s180荷瘤昆明鼠肿瘤组织切片图24为s180荷瘤昆明鼠重要组织切片。图25为4t1荷瘤小鼠肿瘤生长曲线图26为4t1荷瘤小鼠体重变化图27为4t1荷瘤小鼠抑瘤指数。具体实施方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通与/或改变都将落入本发明保护范围。仪器：bs124s电子分析天平(德国赛多利斯公司)；df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)；pb-10型ph计(德国赛多利斯公司)；anketdl80-2b离心机(上海安亭科学仪器厂)；uv1801型紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；uv5100型紫外-可见分光光度计(安徽皖仪科技股份有限公司)；p230高压恒流泵(大连依利特分析仪器有限公司)；uv200ii紫外可变波长检测器(大连依利特分析仪器有限公司)；hw-2000色谱数据处理工作站(大连依利特分析仪器有限公司)；at-130柱温箱(天津市金洲科学仪器有限公司)；高精度全自动交流稳压器(中川电气科技有限公司)；0.45μm聚偏乙烯微孔滤膜(上海摩速科学器材有限公司)。试药：依鲁替尼原料药(ibr，南京熙泽生物科技有限公司，纯度≥99％)；蛋黄磷脂酰甘油(epg，上海艾韦特医药科技有限公司，纯度≥97％)；唾液酸(sa，长兴制药有限公司)；十八烷酸(上海迈瑞尔化学技术有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心)；正己烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；正辛醇(分析纯，天津市恒兴化学化学试剂制造有限公司)；乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)；磷酸氢二钠(分析纯，西陇化工股份有限公司)；磷酸二氢钠(分析纯，西陇化工股份有限公司)；磷酸(分析纯，辽宁嘉城精细化学品有限公司)。实施例1唾液酸甲酯衍生物mt-18的合成精密称取20g唾液酸在含有3.68m盐酸的250ml甲醇中搅拌，并在50℃下回流2.5h。真空干燥除去溶剂并用冷甲醇洗涤得到残留的混合物。通过重结晶纯化后得到甲基化的唾液酸白色固体。精密称取7.5g硬脂酸在0.233mol亚硫酰氯中搅拌溶解1h，并通过减压蒸发挥除残留的溶剂。紧接着，将3g甲基化的唾液酸和0.1g4-二甲基氨基吡啶溶解在30ml无水吡啶中。随后，在0℃下将含有2.8g十八烷基氯的二氯甲烷溶液滴加到混合物中，并在相同温度下搅拌反应30min。之后将反应物温度调制室温并继续反应10h。反应完成后，加入50ml蒸馏水，用40ml二氯甲烷萃取混合物三次。用30ml饱和氯化钠洗涤提取物后使用无水mgso4干燥。通过柱色谱分离后得到唾液酸甲酯衍生物，产率为50.9％。唾液酸甲酯衍生物的合成路线见附图1，核磁图谱见附图2，质谱图见附图3。类似地，根据上述步骤分别以棕榈酸、肉蔻酸或月桂酸作为原料，可合成mt-16、mt-14、mt-12。实施例2唾液酸十八酸衍生物sa-18的合成精密称取20g唾液酸在含有3.68m盐酸的250ml甲醇中搅拌，并在50℃下回流2.5h。真空干燥除去溶剂并用冷甲醇洗涤得到残留的混合物。通过重结晶纯化后得到甲基化的唾液酸白色固体。精密称取7.5g硬脂酸在0.233mol亚硫酰氯中搅拌溶解1h，并通过减压蒸发挥除残留的溶剂。紧接着，将3g甲基化的唾液酸和0.1g4-二甲基氨基吡啶溶解在30ml无水吡啶中。随后，在0℃下将含有2.8g十八烷基氯的二氯甲烷溶液滴加到混合物中，并在相同温度下搅拌反应30min。之后将反应物温度调制室温并继续反应10h。反应完成后，加入50ml蒸馏水，用40ml二氯甲烷萃取混合物三次。用30ml饱和氯化钠洗涤提取物后使用无水mgso4干燥。通过柱色谱分离后得到唾液酸甲酯衍生物(mt-18)。将0.89mmolmt-18，0.37g碳酸氢钠加入至50ml茄型瓶中，加入10ml丙酮和3ml蒸馏水，45℃下反应2h。趁热抽滤，滤液用1m盐酸调节ph值至4.0，旋干得白色固体0.47g，用5ml甲醇重结晶得到唾液酸-十八酸衍生物(sa-18)。类似地，根据上述步骤分别以棕榈酸、肉蔻酸或月桂酸作为原料，可合成sa-16、sa-14、sa-12。实施例3唾液酸乙酯衍生物et-18的合成精密称取20g唾液酸在含有3.68m盐酸的250ml乙醇中搅拌，并在50℃下回流2.5h。真空干燥除去溶剂并用冷甲醇洗涤得到残留的混合物。通过重结晶纯化后得到乙基化的唾液酸白色固体。精密称取7.5g硬脂酸在0.233mol亚硫酰氯中搅拌溶解1h，并通过减压蒸发挥除残留的溶剂。紧接着，将9.2mmol乙基化的唾液酸和0.1g4-二甲基氨基吡啶溶解在30ml无水吡啶中。随后，在0℃下将含有2.8g十八烷基氯的二氯甲烷溶液滴加到混合物中，并在相同温度下搅拌反应30min。之后将反应物温度调制室温并继续反应10h。反应完成后，加入50ml蒸馏水，用40ml二氯甲烷萃取混合物三次。用30ml饱和氯化钠洗涤提取物后使用无水mgso4干燥。通过柱色谱分离后得到唾液酸甲酯衍生物，产率为45.2％。类似地，根据上述步骤分别以棕榈酸、肉蔻酸或月桂酸作为原料，可合成et-16、et-14、et-12。实施例4不同药物-磷脂比依鲁替尼纳米复合物的制备为了考察纳米复合物中依鲁替尼与负电磷脂的最佳配比，选用蛋黄磷脂酰甘油作为负电磷脂，将药脂比设定为1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5。将依鲁替尼与不同比例的负电磷脂溶解在无水乙醇中并回流0.5h，反应结束后挥除乙醇，并在搅拌下加入预热的5％葡萄糖注射液搅拌10min，形成粒径均一的纳米复合物。通过0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的不溶性依鲁替尼颗粒。药物在乙醇中的质量浓度设为10mg·ml-1，所选磷脂为蛋黄磷脂酰甘油(epg)。考察不同药物与磷脂的投料摩尔比对纳米复合物外观、粒径、zeta电位以及复合效率的影响，结果见附图4和表1。实验结果表明，依鲁替尼原料药完全不溶于水。当药脂比为1：0.5时，大量游离的ibr未能被完全包裹，制剂外观浑浊，除去游离ibr后测得纳米复合物粒径较大，均一程度低，多分散系数较大，zeta电位大于14mv。该组制剂结果显示较低的负电磷脂用量无法制备出粒径均匀且复合效率较高的依鲁替尼纳米复合物。当药脂比提高到1：1时，依鲁替尼纳米复合物可以在水中分散均匀且复合效率大于90％，体现了该组纳米制剂对ibr较高的装载效率。该组纳米复合物粒径为29.6±3.4nm，粒径分布小，多分散系数低，复合物的zeta电位为8.0±0.2mv。由于复合物表面带正电荷，将其注射进入机体后容易被体内的血浆蛋白非特异性粘附，进而加快其清除速率，难以达到较好的体内效果。当药脂比提高到1：2或以上时，负电磷脂用量的增加无法显著提高纳米制剂的载药量，但是能够有效降低复合物的zeta电位。当epg的摩尔比为ibr的2倍时，纳米复合物的zeta电位下降至-12mv。负电性的纳米制剂能够避免其在血液循环中被血浆蛋白非特异性吸附，制剂的血浆稳定性较高，循环时间更长。该组纳米复合物粒径约为30nm且粒径分布较小，多分散系数较低。随着epg用量的进一步增加，制剂的zeta电位并未进一步下降，各组纳米复合物的平均zeta电位均在-12～-14mv之间，且药物的复合效率均在90％以上。当药脂比提高到1：4或1：5时，纳米制剂出现明显的乳光。两组纳米复合物的粒径均大于47nm，多分散系数大于0.4，提示纳米制剂粒径增长且均匀程度下降。基于上述结果，我们负电磷脂与ibr摩尔比优选为1：2，以保证纳米制剂表面电荷为负电，不出现明显乳光且粒径均匀分布。表1不同药脂比依鲁替尼复合物处方及表征数据实施例5不同唾液酸修饰密度抗肿瘤疗效考察(附图5，6，7，8)为了确定纳米复合物处方中sa的最优修饰比例，选用蛋黄磷脂酰甘油作为负电磷脂，将sa与负电磷脂的摩尔比设定为1：19(5％唾液酸修饰复合物组)，1：9(10％唾液酸修饰复合物组)，1：4(20％唾液酸修饰复合物组)，3：7(30％唾液酸修饰复合物组)，2：3(40％唾液酸修饰复合物组)。将处方量依鲁替尼，磷脂和不同摩尔比的唾液酸衍生物溶解在无水乙醇中并回流0.5h，反应结束后挥除乙醇，并在搅拌下加入预热的5％葡萄糖注射液搅拌10min，形成粒径均一的纳米复合物。通过0.22μm微孔滤膜过滤除去未复合的不溶性依鲁替尼颗粒。制备得到不同密度唾液酸修饰的依鲁替尼纳米复合物，并对各组制剂进行s180抗肿瘤疗效研究。从液氮中取出保存的s180细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的s180细胞悬液接种于昆明小鼠腹腔内。6～8天后在无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将s180细胞混悬液接种于小鼠右前腋下的皮下组织，每只小鼠接种0.2ml，共接种36只。荷瘤后第3天，将小鼠随机分成6组，即对照组、5％唾液酸修饰复合物组、10％唾液酸修饰复合物组，20％唾液酸修饰复合物组，30％唾液酸修饰复合物组，40％唾液酸修饰复合物组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后第3天)开始给药，每3天1次，共给药5次(接种后第3、6、9、12与15天)，各唾液酸修饰复合物组单次给药剂量均为10mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液，剂量为10ml·kg-1。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量、死亡事件等数据。通过最佳sa修饰比例制备的依鲁替尼复合物电子透射显微镜图见附图8。从结果可知，与对照组相比，各唾液酸修饰依鲁替尼复合物组均具有一定的抑瘤效果。随着sa修饰密度的上调，依鲁替尼复合物组的肿瘤抑制率越高，这可能是因为更高密度的sa衍生物修饰在复合物表面后，增加了制剂被血液循环中吞噬细胞系统，如中性粒细胞和单核细胞的摄取，携带纳米制剂的循环白细胞在肿瘤慢性炎症的驱动下，携带着药物跨过血管壁进入肿瘤组织，从而导致更多的药物滞留在肿瘤部位中，创造更好的肿瘤抑制效果。其中，30％唾液酸修饰复合物组和40％唾液酸修饰复合物组抑瘤效果相仿，23天后肿瘤体积均最小，抑瘤率最高，显著优于对照组和低sa修饰密度组，提示当sa的修饰密度提高到30％后，继续增加sa的修饰比例无法提高ibr纳米复合物的抗肿瘤效果。抗肿瘤药物临床前疗效仅以生存时间、治愈率、复发率与死亡率等传统指标来评价抗肿瘤疗效并不全面。一般抗肿瘤药物在抑制肿瘤生长的同时也会带来严重毒副作用，导致患者生命质量(qualityoflife,qol)下降。为了更合理地评价抗肿瘤药物的疗效，20世纪40年代人们开始了肿瘤患者qol的研究。1985年，fda规定新药评价必须包括qol测评。体质量的变化可以快速反应出抗肿瘤药物的非特异性毒性，是一个经典的qol指标。因此，在药效试验中记录了荷瘤小鼠的体质量。结果表明，在实验期间各给药组小鼠体质量稳步上升，提示sa修饰密度的提高并不会对小鼠造成明显毒性。为了充分比较制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制与对机体非特异性的损伤，采用抑瘤指数综合评价各给药组的治疗效果。结果表明，各组荷瘤后第23天抑瘤指数的顺序为：40％sa修饰复合物组≈30％sa修饰复合物组>20％sa修饰复合物组>10％sa修饰复合物组>5％sa修饰复合物组>对照组。通过对各组抑瘤指数的比较，高sa修饰密度组远大于其余各组，提高了sa的修饰密度不但具有较好的抑瘤效果，而且对机体的非特异性毒性较小，综合疗效最佳；而低修饰密度组(如，5％唾液酸修饰复合物组和10％唾液酸修饰复合物组)具有一定的抑瘤效果，且抑瘤指数大于对照组，但是通过统计学分析发现，两组抑瘤指数显著低于高修饰密度组。由于30％唾液酸修饰复合物组和40％唾液酸修饰复合物组抑瘤指数相近，提示当sa的修饰密度提高到30％后，继续增加sa的修饰比例无法提高ibr纳米复合物的综合疗效。表2不同密度唾液酸修饰依鲁替尼制剂的抑瘤效果基于上述s180抗肿瘤实验结果，唾液酸衍生物的用量优选为负电磷脂摩尔量的30％，以保证依鲁替尼纳米制剂极佳的抗肿瘤效果。电子透射显微镜结果表明，未修饰及30％唾液酸修饰纳米复合物均为大小均一的球形纳米颗粒，直径约为30nm。如无特殊说明，以下唾液酸修饰依鲁替尼纳米复合物中唾液酸衍生物含量均为30％(摩尔比)。肉瘤是一种ibr非敏感型的高发性恶性肿瘤，局部肉瘤患者的存活率为70-80％，转移性肉瘤患者的存活率仅为30％。尽管存活率相对较高，但肉瘤通常通过截肢手术进行治疗，极大地摧毁了患者的身心健全。该基于肿瘤免疫学的靶向治疗策略能够在体内对包括s180肉瘤在内的多种ibr非敏感型的肿瘤细胞株产生良好的治疗效果，从而扩大药物肿瘤治疗谱，有着深远的意义。实施例6依鲁替尼制剂溶解度考察(附图9)为了比较不同ph下依鲁替尼原料药及其复合物的溶解度。将各制剂加入到5ml酸碱度分别为1.02、4.01或7.02的溶解介质中，制剂在25℃下振荡24h。之后通过10000rpm离心将过量的不溶性药物沉淀分离。上清液于容量瓶中采用无水乙醇稀释，定溶，使用紫外/可见光分光光度计在260nm波长下测量各组介质中依鲁替尼的含量。结果表明，依鲁替尼原料药的溶解度受ph影响较大，在偏中性条件下几乎不溶，从而导致较低的口服生物利用度和较差的体内抗肿瘤效果。然而，依鲁替尼复合物的溶解度受ph的影响较弱，且在各ph下均能极显著提高依鲁替尼的溶解度。在ph为4.01时，未修饰复合物和唾液酸修饰复合物的溶解度分别为依鲁替尼原料药的152.0倍和155.4倍。而在ph为7.02时，未修饰复合物和唾液酸修饰复合物的溶解度分别为依鲁替尼原料药的313.6倍和321.9倍。溶解度的提高的原因可以归结为，依鲁替尼在复合物中以无定形形式存在。因此，当药物溶解时，无需克服自身的晶格能，降低了溶解难度(lum,qiuq,luox,etal.phyto-phospholipidcomplexes(phytosomes):anovelstrategytoimprovethebioavailabilityofactiveconstituents[j].asianjournalofpharmaceuticalsciences,2018.)。表3不同依鲁替尼制剂溶解度情况实施例7依鲁替尼复合物的体外释放考察(附图10)通过透析袋法对两种依鲁替尼纳米复合物的药物释放进行分析。将两种依鲁替尼纳米复合物制剂转移至与处理过的透析袋中，置于磷酸盐缓冲液中，并在37℃±2℃下避光恒温透析。在特定时间点收集2ml透析液并补加等体积的空白释放介质。用流动相稀释样品，并使用高效液相色谱测量药物浓度，按照下列公式计算药物的累计释放量rn％。其中，v0为释放介质体积，cn为第n次取样时浓度，v为取样体积，mt为总的药物浓度。从结果中分析可知，两依鲁替尼复合物中的药物释放缓慢，在24h内仅有较少的药物从复合物中释放，表明利用纳米复合物作为载体有效延缓了依鲁替尼的释放。实施例8小鼠raw264.7细胞对依鲁替尼制剂的摄取量考察(附图11，12)为了评估唾液酸修饰的依鲁替尼复合物可以有效增加肿瘤相关巨噬细胞对药物的内化效果，将小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞株raw264.7作为体外巨噬细胞模型进行摄取情况分析(zhengh,lij,wangm,etal.exhaustingtumorassociatedmacrophageswithsialicacid-polyethyleneimine-cholesterolmodifiedliposomaldoxorubicinforenhancingsarcomachemotherapy[j].internationaljournalofpharmaceutics,2019.)。使用细胞培养基轻轻吹打小鼠raw264.7细胞，使之成为细胞悬液，以1×105/孔的密度接种到6孔培养板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。取出培养板后，更换共装载荧光探针dir的未修饰或唾液酸修饰依鲁替尼复合物培养液，于5％co2、37℃的培养箱中共孵育2h，离心去除上清液并收集细胞。加入4％多聚甲醛固定细胞后，在流式细胞仪上通过pe通道检测样品的荧光强度，并用flowjo7.6.1软件对实验数据进行分析。采用竞争性抑制实验证明唾液酸修饰复合物能够通过受体-配体特异性识别增强巨噬细胞对药物的摄取。首先使用过量唾液酸溶液与raw264.7细胞预孵育，竞争性抑制细胞表面的受体识别功能，然后通过离心去除上清液并收集细胞。小鼠raw264.7细胞继续与唾液酸修饰复合物在37℃下共孵育2h(称为竞争性抑制组)。离心去除上清液并收集细胞，加入4％多聚甲醛固定细胞后，使用流式细胞仪进行检测。除此之外，为了进一步研究唾液酸修饰对细胞摄取的影响，使用共聚焦激光显微镜观察raw264.7细胞对依鲁替尼纳米复合物的摄取情况。将细胞接种在6孔板中24h，并与共装载荧光探针dir的依鲁替尼纳米复合物溶液在37℃下孵育2h。使用细胞核染料dapi进行细胞核复染。染色结束后用冷的pbs清洗三次。轻轻甩干爬片，将抗荧光淬灭封片剂滴于载玻片上，从培养板中取出盖玻片，附着有细胞的一面向下扣在载玻片上，排除气泡，吸干溢出的封片剂，封边，最后爬片置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。流式细胞术结果显示，与未修饰复合物组相比，唾液酸修饰复合物在raw264.7细胞中显现出更强的荧光信号，荧光强度为未修饰组的2.5倍，提示细胞对制剂的摄取量显著增加。在竞争性抑制实验中，唾液酸溶液预孵育后显著抑制了raw264.7细胞对唾液酸修饰复合物的摄取。该结果表明，游离的唾液酸可以作为竞争性抑制剂与细胞表面上的唾液酸受体结合，阻断了唾液酸修饰复合物与raw264.7细胞受体结合的机会，从而导致更低的细胞摄取量。激光共聚焦显微镜结果进一步显示，与未修饰复合物组相比，唾液酸修饰复合物显著增强了raw264.7细胞细胞质中的dir荧光信号。该结果与流式细胞术结果一致，表明在复合物表面修饰唾液酸基团后能够有效地促进了巨噬细胞对依鲁替尼纳米复合物的摄取，这对于药物发挥体内免疫治疗作用至关重要。实施例9依鲁替尼制剂wistar大鼠体内药动学行为(附图13)将9只体重180-220g的wistar大鼠随机分为3组，每组3只。一组大鼠口服20mg/kg依鲁替尼混悬液，另外两组大鼠分别静脉注射相同剂量的未修饰复合物或唾液酸修饰复合物。在肝素预处理的管中以特定的时间间隔从眼眶窦收集血样。通过以4500rpm离心分离血浆。取200μl血浆加入600μl甲醇混合后，每管样品加入100μl甲苯磺丁脲溶液作为内标。所有样品10000rpm离心10min，取600μl上清液，使用氮气流挥干样品。用100μl流动相复溶挥干的样品，10000rpm离心10min后，高效液相色谱仪测量上清液中依鲁替尼的浓度。das2.0软件进行药代动力学参数分析，并记录各组的药时曲线下面积，最大药物浓度和半衰期。结果表明，大鼠口服依鲁替尼混悬液后血浆药物浓度较低，与依鲁替尼混悬液组相比，未修饰及唾液酸修饰复合物组的药时曲线下面积有效提高超过19倍。此外，未修饰及唾液酸修饰复合物药时曲线下面积没有明显差别，从而证明纳米复合物表面上的唾液酸修饰不影响药物的药代动力学特征。结果表明，纳米复合物可显着增加药物的药时曲线下面积，从而提高其抗肿瘤效果。表4不同依鲁替尼制剂的药物动力学参数实施例10s180荷瘤昆明鼠体内荧光成像与组织分布(附图14，15)从液氮中取出保存的s180细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的s180细胞悬液接种于昆明小鼠腹腔内。6～8天后在无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将s180细胞混悬液接种于小鼠右前腋下的皮下组织，每只小鼠接种0.2ml，共接种6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达1000mm3后(约接种后第10～12天)，将小鼠随机分成2组，即未修饰复合物组与唾液酸修饰复合物组，每组3只。以1mg·kg-1剂量尾静脉注射共装载荧光探针dir的依鲁替尼纳米复合物，分别于1、4、8和24h进行活体荧光成像，测量各组小鼠在体肿瘤组织荧光强度。在24h之后脱颈处死小鼠，分离肿瘤与其他主要器官进行离体器官成像，并测量每个脏器的平均荧光强度。实验结果表明，随着时间的延长小鼠肿瘤部位逐渐检测到依鲁替尼纳米复合物的荧光，两组荧光强度均在8h达到峰值。与未修饰复合物组相比，唾液酸修饰复合物注射后在肿瘤组织中检测到较高的dir积累。这可能是由于唾液酸修饰的纳米复合物可以提高血液循环中吞噬细胞系统，如中性粒细胞和单核细胞的摄取，吞噬了纳米制剂的循环白细胞在肿瘤慢性炎症的驱动下，携带着药物跨过血管壁进入肿瘤组织，从而导致更多的药物滞留在肿瘤部位中。在制剂注射24h后，收集肿瘤和其他主要器官，检测制剂在小鼠中的生物分布。在荷瘤小鼠组织中，唾液酸修饰的复合物展现出更强的肿瘤靶向能力。定量测量肿瘤组织的荧光强度可进一步证实该结论，唾液酸修饰复合物组的肿瘤滞留量约为未修饰组的3倍，并且在其他主要器官中没有显着性差异。实施例11s180荷瘤昆明鼠肿瘤相关巨噬细胞对依鲁替尼制剂摄取考察(附图16)为了进一步证明唾液酸的修饰可有效提高小鼠体内肿瘤相关巨噬细胞对药物的吞噬作用，将荷瘤小鼠分为两组，分别注射共装载荧光探针dir的未修饰依鲁替尼复合物溶液或唾液酸修饰依鲁替尼复合物，使用巨噬细胞标记物f4/80对肿瘤组织中的巨噬细胞进行标记，观察肿瘤相关巨噬细胞对药物的摄取。冰冻切片制作①组织固定新鲜肿瘤组织固定液固定24h以上，将组织从固定液取出用手术刀将目的部位组织修平整。②脱水：将修切好的组织放于15％的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后转入30％的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。③oct包埋将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上oct包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct变白变硬后即可进行切片。新鲜组织直接冰冻切片则不需要固定脱水，直接用手术刀将目的部位组织修平整oct包埋剂包埋切片。④切片将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。片子写好标签后-20℃保存备用。⑤免疫荧光染色将肿瘤切片与一抗孵育，4℃过夜，然后在室温下与荧光素缀合的二抗孵育1h。⑥染核玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加dapi染液室温避光染核10min。⑦封片玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。⑧镜检拍照切片于荧光显微镜下观察并采集图像。根据肿瘤切片的免疫荧光实验结果可知，与未修饰复合物组相比，在唾液酸修饰复合物组f4/80标记的肿瘤相关巨噬细胞中展现出更强的荧光信号，荧光强度为未修饰复合物组的3.3倍。这些结果表明，唾液酸的修饰能够有效提高肿瘤相关巨噬细胞对纳米复合物的摄取，该结果与体外细胞摄取结果一致。实施例12依鲁替尼制剂对s180荷瘤昆明鼠抗肿瘤研究(附图17，18，19)从液氮中取出保存的s180细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的s180细胞悬液接种于昆明小鼠腹腔内。6～8天后在无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将s180细胞混悬液接种于小鼠右前腋下的皮下组织，每只小鼠接种0.2ml，共接种24只。荷瘤后第3天，将小鼠随机分成4组，即对照组、口服混悬液组、未修饰复合物组与唾液酸修饰复合物组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后第3天)开始给药，每3天1次，共给药5次(接种后第3、6、9、12与15天)，口服混悬液组单次给药剂量为25mg·kg-1，未修饰及唾液酸修饰复合物组单次给药剂量均为10mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液，剂量为10ml·kg-1。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量、死亡事件等数据。抗肿瘤实验结果显示，抑瘤率依次为：唾液酸修饰复合物组>未修饰复合物组>口服混悬液组。口服混悬液组小鼠在实验期间肿瘤体积持续增长，且在第19天时平均肿瘤体积与5％注射液对照组无明显差异。这可以解释为，依鲁替尼混悬液口服生物利用度较低，肿瘤组织分布量少，导致较差的治疗效果和极低的抑瘤率。而未修饰及唾液酸修饰复合物组均显着抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，并延长小鼠的存活时间。与口服混悬液组比，纳米复合组表现出更好的抗肿瘤效果是由于纳米复合物提高了药物的药时曲线下面积和进入肿瘤部位的药物量。值得注意的是，唾液酸修饰复合物组小鼠的肿瘤体积被大大抑制，抑瘤率显著高于未修饰组。由于中性粒细胞及巨噬细胞在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起关键作用(mantovania,marchesif,malescia,etal.tumour-associatedmacrophagesastreatmenttargetsinoncology[j].naturereviewsclinicaloncology,2017,14(7):399.)(kimj,baejs.tumor-associatedmacrophagesandneutrophilsintumormicroenvironment[j].mediatorsofinflammation,2016,2016.)，唾液酸衍生物修饰的纳米复合物可以有效增强巨噬细胞和中性粒细胞对制剂的摄取，从而发挥更强效的免疫治疗作用。药物制剂在肿瘤治疗过程中，不仅需要考虑药物的抑瘤效果，还应该考虑到药物对机体的非特异性损伤，以损伤机体作为代价的抗肿瘤治疗并不值得提倡。在实验期间，各组小鼠的体重逐渐增加，这可间接反映各组制剂对小鼠机体的毒性较低。为了更好地体现制剂的有效性与靶向性，兼顾制剂对肿瘤细胞的抑制和对机体非特异性的损伤，本课题组曾提出“抑瘤指数(tumor-inhibitionindex,tiindex)”作为指标评价药物制剂对小鼠的综合抑瘤效果(luox,hul,zhengh,etal.neutrophil-mediateddeliveryofpixantrone-loadedliposomesdecoratedwithpoly(sialicacid)–octadecylamineconjugateforlungcancertreatment[j].drugdelivery,2018,25(1):1200-1212.)。“抑瘤指数”可以分为“质量抑瘤指数”或者“体积抑瘤指数”两种计算形式，即“荷瘤动物质量/肿瘤质量”或者“荷瘤动物体积/肿瘤体积”，也可采用荷瘤动物质量/肿瘤体积、去瘤动物质量/肿瘤体积、去瘤动物质量/肿瘤质量，抑瘤指数越大，整体治疗效果越好。由于小鼠体质量较易获取，因此我们选择采用质量抑瘤指数形式进行计算分析。通过对各组抑瘤指数的比较，我们发现纳米复合物组远大于口服混悬液组，口服混悬液组抑瘤指数与对照组相似，说明该制剂抑瘤效果不佳，综合疗效差。此外，唾液酸修饰复合物组抑瘤指数远高于未修饰复合物组，提示复合物被唾液酸修饰后可有效提高制剂的抑瘤作用，且具有更高的安全性，因此表现出最佳的综合疗效。抑瘤指数将肿瘤生长情况与生存质量(qualityoflife,qol)有机地结合在一起，为客观评价抗肿瘤药物疗效提供更多的信息，获得更多的思考与启示，也充分体现了其在抗肿瘤实验过程中的重要价值。表5不同依鲁替尼制剂的抑瘤效果作为布鲁顿络氨酸激酶的共价抑制剂，唾液酸衍生物修饰的依鲁替尼纳米复合物不仅能够高效靶向肿瘤组织，还可以作用于多种肿瘤进展相关免疫细胞，从而造成良好的抑瘤效果。这种针对巨噬细胞，中性粒细胞等免疫细胞的策略可以发挥卓越的抗肿瘤效果(shez,zhangt,wangx,etal.theanticancerefficacyofpixantrone-loadedliposomesdecoratedwithsialicacid–octadecylamineconjugate[j].biomaterials,2014,35(19):5216-5225.)(songleizhou,yihuideng,etal.targeteddeliveryofepirubicintotumor-associatedmacrophagesbysialicacid-cholesterolconjugatemodifiedliposomeswithimprovedantitumoractivity.internationaljournalofpharmaceutics.2017,523.1:203-216.)(sunj,songy,lum,etal.evaluationoftheantitumoreffectofdexamethasonepalmitateanddoxorubicinco-loadedliposomesmodifiedwithasialicacid–octadecylamineconjugate[j].europeanjournalofpharmaceuticalsciences,2016,93:177-183.)(宋艳志，黄振军，邓意辉*等.不同链长唾液酸衍生物修饰脂质体的药效学研究[j].药学学报:2016,51.2:316-324.)(宋艳志，邓意辉*等，表面修饰唾液酸的唑来膦酸与多柔比星共载脂质体的制备[j]沈阳药科大学学报,2017,9:729-736.)。然而，在免疫药剂学理论指导下的本次实验结果，与后续的研究结果均证明，肿瘤的治疗并非必须得对肿瘤细胞进行直接杀伤。在肿瘤的形成阶段，肿瘤细胞为了避免机体的免疫监视，会释放出许多信号，招募多种炎性细胞浸润。这些浸润的炎性细胞在肿瘤部位“驻扎”，通过多种机制通路“协助”肿瘤细胞生长和转移。因此抑制肿瘤微环境中炎性细胞的促瘤功能，能够有效扼制肿瘤的生长。另一方面，昆明鼠是一种免疫健全的动物模型，当机体产生肿瘤时，机体会调动免疫系统，尤其是t细胞对肿瘤的杀伤作用，但是由于肿瘤微环境中的基质细胞会通过多种途径抑制t细胞对肿瘤的识别和杀伤作用，通过抑制巨噬细胞和中性粒细胞在内的多种免疫细胞，可以有效改善肿瘤的生长环境，使得t细胞充分发挥作用，产生抑瘤效果。这说明，对于肿瘤的治疗，最终途径还是得调动免疫系统，杀伤肿瘤。实施例13依鲁替尼制剂对s180肉瘤细胞毒性分析(附图20)采用mtt法测定各依鲁替尼制剂对s180小鼠肉瘤细胞的细胞毒性，实验方法如下：①将s180小鼠肉瘤细胞悬液加入到96孔板(边缘孔用无菌水或pbs填充)，细胞密度为每孔1×105个。设置空白孔(有培养基，无细胞)与对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定3复孔。②置37℃，5％co2孵育4小时，倒置显微镜下观察。③每孔加入10μl待检测不同浓度依鲁替尼制剂，37℃孵育48h。④每孔加入10μlmtt溶液，37℃孵育4小时。⑤每孔加入三联液过夜溶解活细胞产生的甲瓒。⑥在570nm纳米波长下测定各孔的吸光值。⑦结果分析：将各测试孔的od值减去调零孔od值或对照孔od值。各重复孔的od值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞od-空白od)/(对照细胞od-空白od)×100％，并计算细胞的半数抑制浓度(ic50)。由细胞毒性分析结果可知，不同组别的ibr制剂对s180小鼠肉瘤细胞仅有轻微的毒性，其半数抑制浓度>20μm。体外毒性分析结果表明，ibr对s180肉瘤细胞仅有微弱的生长抑制效果。结合实施例9，10，11可知，sa修饰的依鲁替尼复合物在体内能够高效靶向到肿瘤进展相关免疫细胞从而产生抗s180肿瘤效果。中性粒细胞和巨噬细胞对肿瘤增殖与恶化起关键性作用，这两类细胞的细胞质中均高表达布鲁顿络氨酸激酶btk，激活的btk可以导致巨噬细胞向促进肿瘤增殖和血管生成的方向分化，分泌多种促瘤因子，如白介素10和肿瘤生长因子β等，抑制th2型t细胞的分化，毒性t细胞的成熟及t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，从而抑制机体对肿瘤细胞的免疫监视(gundersonaj,kanedamm,tsujikawat,etal.brutontyrosinekinase–dependentimmunecellcross-talkdrivespancreascancer[j].cancerdiscovery,2016,6(3):270-285.)。sa修饰依鲁替尼复合物产生优异肿瘤治疗效果的原因可以归结为，唾液酸的修饰导致药物大量被肿瘤进展相关免疫细胞摄取，抑制其胞质中btk，从而促使其向不利于肿瘤生长的方向分化，最终产生良好的抑瘤效果。唾液酸介导的肿瘤治疗策略并非针对肿瘤细胞自身，而是通过抑制肿瘤进展相关免疫细胞，从而压制肿瘤的生长，侵袭和转移。肉瘤是一种ibr非敏感型的高发性恶性肿瘤，局部肉瘤患者的存活率为70-80％，转移性肉瘤患者的存活率仅为30％。尽管存活率相对较高，但肉瘤通常通过截肢手术进行治疗，极大地摧毁了患者的身心健全。该基于肿瘤免疫学的靶向治疗策略能够在体内对包括s180肉瘤在内的多种ibr非敏感型的肿瘤细胞株产生良好的治疗效果，从而扩大药物肿瘤治疗谱，有着深远的意义。实施例14肿瘤切片增殖以及布鲁顿络氨酸激酶抑制分析(附图21，22)为了研究巨噬细胞中btk的抑制是否影响肿瘤增殖和血管生成，在s180荷瘤昆明鼠抗肿瘤实验结束后，收集各组荷瘤小鼠的肿瘤组织制备冰冻切片进行观察。冰冻切片制作①组织固定新鲜肿瘤组织固定液固定24h以上，将组织从固定液取出用手术刀将目的部位组织修平整。②脱水：将修切好的组织放于15％的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后转入30％的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。③oct包埋将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上oct包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct变白变硬后即可进行切片。新鲜组织直接冰冻切片则不需要固定脱水，直接用手术刀将目的部位组织修平整oct包埋剂包埋切片。④切片将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。片子写好标签后-20℃保存备用。⑤免疫荧光染色将肿瘤切片与一抗孵育，4℃过夜，然后在室温下与荧光素缀合的二抗孵育1h。⑥染核玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加dapi染液室温避光染核10min。⑦封片玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。⑧镜检拍照切片于尼康荧光显微镜下观察并采集图像。ki-67是一种增殖细胞相关核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，是细胞增殖必不可少的，因此用抗ki-67标记肿瘤切片对肿瘤组织切片的增殖情况进行分析。结果显示，与对照组相比，未修饰及唾液酸修饰复合物组小鼠肿瘤组织呈现出较低的荧光信号，表明肿瘤细胞增殖速率降低。其中唾液酸修饰复合物治疗后的肿瘤组织具有最低的增殖信号，证明唾液酸的修饰能够有效提高药物的抑瘤效果。为了进一步研究肿瘤组织增殖活性的减弱是否由于药物对巨噬细胞和中性粒细胞中布鲁顿络氨酸激酶的抑制。肿瘤相关巨噬细胞中布鲁顿络氨酸激酶的活化能够促进血管生成，抑制免疫反应，并进一步促进肿瘤生长和转移(gundersonaj,kanedamm,tsujikawat,etal.brutontyrosinekinase–dependentimmunecellcross-talkdrivespancreascancer[j].cancerdiscovery,2016,6(3):270-285.)。我们使用免疫荧光染色分析在给予不同的依鲁替尼制剂治疗后肿瘤组织中激活的布鲁顿络氨酸激酶表达。免疫荧光结果显示，与对照组相比，未修饰及唾液酸修饰复合物组小鼠肿瘤组织呈现出较低的荧光信号，表明肿瘤组织中激活的布鲁顿络氨酸激酶含量减少。其中唾液酸修饰复合物治疗后的肿瘤组织具有最低的荧光信号，证明唾液酸的修饰能够有效提高药物在巨噬细胞和中性粒细胞中的分布，从而抑制该细胞群中的蛋白酶活力，导致其下游磷酸化产物减少，阻断该通路对肿瘤细胞增殖和转移的促进作用。实施例15s180荷瘤昆明鼠肿瘤与重要组织切片(附图23，24)为了考察各依鲁替尼制剂对小鼠肿瘤及主要器官的影响，在s180荷瘤昆明鼠抗肿瘤实验结束后，收集各组荷瘤小鼠的肿瘤组织以及心、肝、脾、肺、肾等脏器，用于he病理切片。石蜡切片制作①组织固定将新鲜剥离的心、肝、脾、肺、肾组织用pbs(ph7.4)洗净后用4％多聚甲醛固定24h以上，固定结束后将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将组织修平整。②冲洗将修整好的组织块放入包埋盒，将包埋盒置于蒸馏水下，用较低的流水速度冲洗组织，冲洗12～24h。③脱水将包埋盒放进吊篮里，置于脱水机内，用不同梯度的乙醇进行脱水，依次用75％乙醇作用4h，85％乙醇、90％乙醇各作用2h，95％乙醇作用1h，再用无水乙醇作用2次进行脱水。④透明与浸蜡将各组织转移至密闭容器内，二甲苯：乙醇(1：1，v/v)作用5～10min，二甲苯i作用5～10min，二甲苯ii作用5～10min。透明结束后将各组织块浸没在完全融化的石蜡中(60℃恒温箱)1h，再将组织块转移到新的石蜡液中进行二次浸蜡1h。⑤包埋将浸好蜡的组织置于包埋机中进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，在蜡凝固之前，将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。在-20℃冻台冷却，待蜡凝固后，将蜡块从包埋框中取出并对蜡块进行修整。⑥切片将蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚5μm，将切片漂浮于摊片机上，40℃温水将组织展平，用防脱载玻片将组织捞起，并于60℃烘箱内烤片。待水烤干、蜡烤化后，将载玻片取出，常温保存备用。⑦he染色⑧石蜡切片脱蜡至水将组织切片放入二甲苯i、二甲苯ii溶液中各浸泡20min，100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各浸泡5min，最后用蒸馏水冲洗10min。⑨染核切片入苏木素染液染8min，用蒸馏水冲洗去浮色，再用1％的盐酸酒精分化数20s，最后用蒸馏水冲洗返蓝。⑩染质切片入伊红染液中染色3min，再用蒸馏水冲洗20s。脱水封片将切片依次用95％酒精i、95％酒精ii各浸泡5min，再用无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ各浸泡5min，然后在二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中各浸泡5min脱水透明，最后将切片从二甲苯中拿出晾干，用中性树胶封片。镜检拍照待封片干燥完毕后，将载玻片置于倒置显微镜下观察。对各组肿瘤切片进行观察可知，各组切片肿瘤粉染较少，说明各ibr制剂组并未对肿瘤细胞造成严重的杀伤情况。结合上述肿瘤组织增殖及布鲁顿络氨酸激酶抑制结果，可得出结论，ibr纳米复合物对小鼠肿瘤生长的抑制效果并非来自于其对肿瘤细胞的直接杀伤作用，而是通过sa的修饰导致药物大量被肿瘤进展相关免疫细胞摄取，抑制其胞质中btk，从而促使其向不利于肿瘤生长的方向分化，最终产生良好的抑瘤效果。除此之外，对各脏器切片进行观察可知，各ibr制剂组小鼠心肌细胞完整且没有观察到心肌断裂现象。对于肝脏病理切片，肝细胞核完整没有受到破坏，肝细胞和肝窦上皮细胞的形态正常，肝窦无充血现象。此外，肾小球和肾小管上皮细胞完整，肾小囊正常，并且所有小鼠肾脏切片均未观察到出血或炎性浸润。小鼠肺和脾脏切片中，各制剂组中均未显示出组织病理学异常、病变或退化。上述结果表明，经过5次药物治疗后，包括心脏、肺、肝、脾和肾在内的小鼠器官未显示出组织病理学异常、病变或退化，证明各依鲁替尼制剂用于小鼠肿瘤治疗安全。实施例16依鲁替尼制剂对4t1荷瘤小鼠抗肿瘤研究(附图25，26，27)从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4t1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4t1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4t1细胞混悬液接种于小鼠第三对乳房垫上，每只小鼠接种0.1ml，共接种24只，将小鼠随机分成4组，即对照组、口服混悬液组、未修饰复合物组与唾液酸修饰复合物组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(接种后第8天)开始给药，每3天1次，共给药5次(接种后第8、11、14、17与20天)，口服混悬液组单次给药剂量为25mg·kg-1，未修饰及唾液酸修饰复合物组单次给药剂量均为10mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液，剂量为10ml·kg-1。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量、死亡事件等数据。抗肿瘤实验结果显示，抑瘤率依次为：唾液酸修饰复合物组>未修饰复合物组>口服混悬液组。口服混悬液组小鼠在实验期间肿瘤体积持续增长，且在第26天时平均肿瘤体积与5％注射液对照组无明显差异。这可以解释为，依鲁替尼混悬液口服生物利用度较低，肿瘤组织分布量少，导致较差的治疗效果和极低的抑瘤率。而未修饰及唾液酸修饰复合物组均显着抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，并延长小鼠的存活时间。值得注意的是，唾液酸修饰复合物组小鼠的肿瘤体积被大大抑制，在26天时，该组平均抑瘤率为49.55％，显著高于未修饰组。除此之外，对于原位三阴乳腺癌4t1模型而言，由于肿瘤位于小鼠乳腺，epr效应较弱，导致较差的临床治疗效果。课题组之前的实验结果表明，peg阿霉素化脂质体对4t1荷瘤小鼠的抑瘤率低于40％，远不及唾液酸修饰的依鲁替尼纳米复合物。由于中性粒细胞及巨噬细胞在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起关键作用，唾液酸衍生物修饰的纳米复合物可以有效增强巨噬细胞和中性粒细胞对制剂的摄取，从而发挥更强效的免疫治疗作用。在实验期间，各组小鼠的体重较为稳定，说明各组制剂对小鼠机体的毒性较低。通过对各组抑瘤指数的比较，我们发现纳米复合物组远大于口服混悬液组，口服混悬液组抑瘤指数与对照组相似，说明该制剂抑瘤效果不佳，综合疗效差。此外，唾液酸修饰复合物组抑瘤指数远高于未修饰复合物组，提示复合物被唾液酸修饰后可有效提高制剂的抑瘤作用，且具有更高的安全性，因此表现出最佳的综合疗效。表6不同依鲁替尼制剂的抑瘤效果实施例17对a549荷瘤裸鼠抗肿瘤研究液氮中取出保存的a549细胞(人非小细胞肺癌)冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的a549细胞悬液置于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中37℃，5％co2条件下培养。2-3次传代后，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液，调整稀释倍数，使混悬液的瘤细胞数为1×107cells·ml-1。采用75％酒精消毒，将a549细胞混悬液接种于小鼠右后背的皮下组织，每只小鼠接种0.1ml，共接种36只。荷瘤后第9天，将小鼠随机分成6组，即对照组、未修饰复合物组、mt-18、mt-16、sa-18、et-18唾液酸修饰复合物组(备注：唾液酸衍生物的加入量为30％(摩尔比))，每组6只。各组裸鼠均于肿瘤体积到达100mm3后(约接种后第9天)开始尾静脉注射给药，每3天1次，共给药5次(接种后第9、12、15、18与21天)，各组的单次给药剂量均为10mg·kg-1，对照组5％glu的给予量为10ml·kg-1。各唾液酸衍生物结构式如下所示，给药结束后第二天，剖取肿瘤，计算抑瘤率，结果见表7。mt-18结构式：mt-16结构式：sa-18结构式：et-18结构式：表7不同唾液酸修饰的复合物抗a549实验结果组别抑瘤率(％)未修饰复合物组31.1mt-1863.6mt-1651.8sa-1855.4et-1851.2当前第1页12