一种负载外泌体的水凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于技术凝胶技术领域，具体涉及一种负载外泌体的水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.外泌体是现在炙手可热的研究热点，但外泌体用于抗衰领域的凝胶产品则鲜有报道。间充质干细胞来源的外泌体是其发挥疗效的主要来源物质。外泌体作为细胞间相互传递信号的内源性物质，能够避免传统细胞制剂治疗过程中的免疫原性、致敏性、致瘤性等风险，安全程度得到提高。外泌体性质稳定，剂量和浓度易控制，可生物归巢和易于储存。诸多优点使得外泌体近期备受关注。外泌体为平均直径为40～150nm的具膜脂质囊泡，其内容物包含mrna及mirna外，还含有大量细胞因子、神经酰胺和金属蛋白酶等。尤其是间充质干细胞来源外泌体所含内容蛋白和rna成分，可与受损细胞进行信息交流，可对靶细胞进行生物调控，刺激组织再生，有效地修护皮肤破损部位。间充质干细胞外泌体对皮肤成纤维细胞的调控功能具有促进伤口愈合与抑制瘢痕形成的双重调节作用。即在伤口愈合的早期通过促进胶原的合成来提高修复速度，晚期则减少胶原的合成而抑制瘢痕组织的形成，提升修复效果。但外泌体缺乏组织特异性，因而采用局部给药形式是比较理想的选择。
3.凝胶作为一种药物投递平台，已经被广泛应用于药物缓释和组织工程领域。水凝胶的生物安全性高，生物相容性好，具有生物可降解性的特性，可以物理或者化学吸附的方式与外泌体结合制成的相应的剂型。通过扩散作用，渗透作用等方式进入人体内，使活性成分以稳定可控的速率，合适的浓度在人体内持续而缓慢地释放。其优势在于能够有效地解决因传统方式引起的人体局部活性物质浓度过大，生物利用率低，毒副作用强及外泌体半衰期短等问题。常见的水性凝胶基质为卡波姆，是丙烯酸键合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物。卡波姆及其分解产物无毒无害，赋予皮肤屏障效果，防止微生物入侵。含卡波姆的凝胶剂由于具有较为优良的黏合性、保水性、缓释性等优势，共同在局部发挥较为理想的治疗作用。但是现有卡波姆基水凝胶不具有可注射性或者是注射性较差，不能有效将活性成分输送到特定部位，并且目前较老的卡波姆型号使用苯作溶剂提取，苯毒性很大且不易代谢，存在残留的潜在危险。旧型号卡波姆耐离子能力差，无法兼容离子型多糖等其他物质。这些物质能破坏已形成的卡波姆网状结构，使得凝胶强度降低。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明提供一种负载外泌体的水凝胶及其制备方法和应用，以得到一种理化性能优良并且具有良好美容效果的水凝胶。
5.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种负载外泌体的水凝胶，包括凝胶基底以及负载于所述凝胶基底上的外泌体，外泌体与凝胶基底的质量之比为0.5～5:100000；凝胶基底通过以下质量份的原料制备得到：
6.凝胶基质1～6份，活性糖0.1～1份，柠檬酸0.1～2份，酸度调节剂1～5份，保湿剂2
～30份，助剂0.1～0.5份和纯化水55～95份。
7.本发明采取上述技术方案的有益效果是：本发明将外泌体负载到凝胶基底上，外泌体以凝胶基底作为载体，不仅有利于外泌体的保藏和运输，并且外泌体的使用更加多样化，可以通过注射等方式将负载有外泌体的凝胶输送到特定部位，并在凝胶作用下实现外泌体的缓慢释放。
8.本发明中的凝胶基底通过凝胶基质、活性糖、柠檬酸、酸度调节剂、保湿剂、助剂和纯化水等组分制得，各组分协同作用，可以是凝胶基底具有更加丰富的空间网络结构，不仅凝胶基底结构更加稳定，而且有助于外泌体在凝胶基底上的稳定负载。
9.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
10.进一步，凝胶基质为卡波姆、海藻酸钠和羧甲基壳聚糖按5～10:2～4:1的质量比混合后的混合物。
11.进一步，活性糖为芦荟活性多糖、低聚果糖、低聚半乳糖、棉籽糖、水苏糖和低聚木糖中的至少一种。
12.进一步，酸度调节剂为三乙醇胺或氢氧化钠。
13.进一步，保湿剂为1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和甘油中的至少一种。
14.进一步，助剂为苯氧乙醇、苯甲醇和羟苯丁酯按2～5:1～3:0.1的质量比混合后的混合物。
15.进一步，凝胶基底经过以下步骤制得：
16.sl：将柠檬酸溶解于1/10体积的纯化水，然后加入凝胶基质，溶胀16～24h，得凝胶基材；
17.s2：将活性糖溶解于1/10体积的纯化水，得活性成分溶液；将助剂溶解于1/20体积的纯化水中，再加入保湿剂，得保湿液；
18.s3：将酸度调节剂、活性成分溶液、保湿液以及剩余的纯化水加入凝胶基材中，于35～45℃下搅拌反应1～2h，然后离心脱气20～30min，即得。
19.进一步，外泌体来源于脐带间充质干细胞。
20.本发明中的负载外泌体的水凝胶的制备方法包括以下步骤：
21.s1：将外泌体重悬于10mm的pbs溶液中，得外泌体悬液；
22.s2：将外泌体悬液加入到凝胶基底中，于4℃下以600rpm/min的搅拌速率搅拌5～10min，即得。
23.本发明的有益效果是：
24.本发明中水凝胶的制备方法简单、快速、可重复性高，适合工业化生产。制备得到的负载外泌体的复合水凝胶具备局部高浓度、全身低毒性的优点，具有皮肤渗透性且滞留时间长。此外，该负载外泌体的复合水凝胶还具有可注射性能、生物可降解性能以及缓释性能。另外，外泌体作为天然内容性物质，具有免疫原性低、不致敏、传递细胞间信息能力强、安全性高等优点，配合凝胶基底释放，可有效实现缓慢释放以及局部给药的目的，并能给予皮肤物理屏障，实现皮肤组织再生，可有效改善瘢痕组织和皮肤色素沉着。
附图说明
25.图1为实施例以及对比例1和2所得水凝胶的可注射性检测图。
具体实施方式
26.一、外泌体的提取和纯化
27.收集脐带间充质干细胞上清液，并对上清液依次进行超速离心和超滤处理，从上清液中分离得到外泌体。具体步骤如下：
28.超速离心：提前打开低温离心机，温度设置为4℃预冷。将收集的脐带间充质干细胞培养上清加入无菌离心管中，每管50ml，置于离心机中，温度设置为4℃，时间设置为10分钟，离心后弃沉淀取上清液；
29.取上清液转移至新的无菌离心管中，温度设置为4℃，时间设置为10分钟，离心后弃沉淀取上清液；
30.取上清液转移至新的无菌离心管中，温度设置为4℃，时间设置为30分钟，离心后弃沉淀取上清液；
31.无菌针筒吸取上清液，使用0.22μm过滤器过滤至新的无菌离心管，保留过滤液；
32.打开超速离心机，4℃预冷，离心转子提前放入4℃冰箱预冷。取过滤液置于超速离心适配离心管中，使用天平配平相对应的离心管，误差不超过0.1g。离心机参数设置为100000g，温度设置为4℃，时间设置为70分钟离心。
33.离心结束后使用移液枪轻柔吸出细胞上清，注意不要触到底层的沉淀。后加入适量pbs充分混匀，使用移液枪转移到离心管。
34.超滤：提前打开离心机，温度设置为4℃预冷。移液枪吸取去离子水或缓冲溶液滴加在超滤管滤膜表面，使其浸润整个膜表面，离心机参数设置为1000g，温度设置为4℃，时间设置为10分钟，离心后弃下层液体，以洗涤膜表面多余的甘油或叠氮化钠；
35.取重悬液15ml加入超滤管上层管，离心机参数设置为3000g，温度设置为4℃，时间设置为20分钟，离心完后保留上层液体；
36.使用移液枪小心吸取超滤管上层管液体转移至新离心管中，加入10ml pbs充分混匀，加入新超滤管上层管中，离心机参数设置为3000g，温度设置为4℃，时间设置为30分钟。离心后移液枪吸取上层液体(约200-500μl)置于2ml无菌离心管中，-80℃冰箱保存。
37.二、制备凝胶基底
38.本发明中凝胶基底通过凝胶基质、活性糖、柠檬酸、酸度调节剂、保湿剂、助剂和纯化水等组分制备得到。其中，
39.凝胶基质为卡波姆、海藻酸钠和羧甲基壳聚糖按5～10:2～4:1的质量比混合后的混合物；
40.活性糖为芦荟活性多糖、低聚果糖、低聚半乳糖、棉籽糖、水苏糖和低聚木糖中的至少一种；
41.酸度调节剂为三乙醇胺或氢氧化钠；
42.保湿剂为1,3-丙二醇、1,2-丙二醇或甘油；
43.助剂为苯氧乙醇、苯甲醇和羟苯丁酯按2～5:1～3:0.1的质量比混合后的混合物。
44.本发明中凝胶基底的制备方法包括以下步骤：
45.sl：将柠檬酸溶解于1/10体积的纯化水，然后加入凝胶基质，溶胀16～24h，得凝胶基材；
46.s2：将活性糖溶解于1/10体积的纯化水，得活性成分溶液；将助剂溶解于1/20体积
的纯化水中，再加入保湿剂，得保湿液；
47.s3：将酸度调节剂、活性成分溶液、保湿液以及剩余的纯化水加入凝胶基材中，于35～45℃下搅拌反应1～2h，然后离心脱气20～30min，即得。
48.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
49.实施例1
50.一种负载外泌体的水凝胶，包括凝胶基底以及负载于凝胶基底上的外泌体，外泌体与凝胶基底的质量之比为1:100000。
51.本实施例中的胶基底通过以下质量份的原料制备得到：
52.凝胶基质1.5份，活性糖0.5份，柠檬酸0.5份，酸度调节剂1份，保湿剂20份，助剂0.5份和纯化水76份；其中，凝胶基质为卡波姆u30、海藻酸钠和羧甲基壳聚糖按8:3:1的质量比混合后的混合物；活性糖为芦荟多糖；酸度调节剂三乙醇胺；保湿剂为1,3-丙二醇和甘油等质量混合后的混合物；苯氧乙醇、苯甲醇和羟苯丁酯按3:2:0.1的质量比混合后的混合物。凝胶基底经过以下步骤制得：
53.sl：将柠檬酸溶解于1/10体积的纯化水，然后加入凝胶基质，溶胀20h，得凝胶基材；
54.s2：将活性糖溶解于1/10体积的纯化水，得活性成分溶液；将助剂溶解于1/20体积的纯化水中，再加入保湿剂，得保湿液；
55.s3：将酸度调节剂、活性成分溶液、保湿液以及剩余的纯化水加入凝胶基材中，于40℃下搅拌反应1h，然后离心脱气25min，即得。
56.本实施例中的外泌体来源于脐带间充质干细胞，提取方法如上所述。
57.本实施例中的负载外泌体的水凝胶经过以下步骤制得：
58.s1：将外泌体重悬于10mm的pbs溶液中，得外泌体悬液；
59.s2：将外泌体悬液加入到凝胶基底中，于4℃下以600rpm/min的搅拌速率搅拌8min，即得。
60.实施例2
61.一种负载外泌体的水凝胶，包括凝胶基底以及负载于凝胶基底上的外泌体，外泌体与凝胶基底的质量之比为5:100000。
62.本实施例中的胶基底通过以下质量份的原料制备得到：
63.凝胶基质1份，活性糖1份，柠檬酸0.1份，酸度调节剂1份，保湿剂2份，助剂0.1份和纯化水60份；其中，凝胶基质为卡波姆u30、海藻酸钠和羧甲基壳聚糖按5:4:1的质量比混合后的混合物；活性糖为芦荟多糖；酸度调节剂氢氧化钠；保湿剂为1,2-丙二醇和甘油等质量混合后的混合物；助剂为苯氧乙醇、苯甲醇和羟苯丁酯按5:1:0.1的质量比混合后的混合物。凝胶基底经过以下步骤制得：
64.sl：将柠檬酸溶解于1/10体积的纯化水，然后加入凝胶基质，溶胀16h，得凝胶基材；
65.s2：将活性糖溶解于1/10体积的纯化水，得活性成分溶液；将助剂溶解于1/20体积的纯化水中，再加入保湿剂，得保湿液；
66.s3：将酸度调节剂、活性成分溶液、保湿液以及剩余的纯化水加入凝胶基材中，于35℃下搅拌反应2h，然后离心脱气20min，即得。
67.本实施例中的外泌体来源于脐带间充质干细胞，提取方法如上所述。
68.本实施例中的负载外泌体的水凝胶经过以下步骤制得：
69.s1：将外泌体重悬于10mm的pbs溶液中，得外泌体悬液；
70.s2：将外泌体悬液加入到凝胶基底中，于4℃下以600rpm/min的搅拌速率搅拌5min，即得。
71.实施例3
72.一种负载外泌体的水凝胶，包括凝胶基底以及负载于凝胶基底上的外泌体，外泌体与凝胶基底的质量之比为5:100000。
73.本实施例中的胶基底通过以下质量份的原料制备得到：
74.凝胶基质6份，活性糖0.1份，柠檬酸2份，酸度调节剂5份，保湿剂30份，助剂0.5份和纯化水90份；其中，凝胶基质为卡波姆u30、海藻酸钠和羧甲基壳聚糖按10:2:1的质量比混合后的混合物；活性糖为芦荟多糖；酸度调节剂氢氧化钠；保湿剂为1,2-丙二醇和甘油等质量混合后的混合物；助剂为苯氧乙醇、苯甲醇和羟苯丁酯按2:1:0.1的质量比混合后的混合物。凝胶基底经过以下步骤制得：
75.sl：将柠檬酸溶解于1/10体积的纯化水，然后加入凝胶基质，溶胀24h，得凝胶基材；
76.s2：将活性糖溶解于1/10体积的纯化水，得活性成分溶液；将助剂溶解于1/20体积的纯化水中，再加入保湿剂，得保湿液；
77.s3：将酸度调节剂、活性成分溶液、保湿液以及剩余的纯化水加入凝胶基材中，于45℃下搅拌反应1h，然后离心脱气30min，即得。
78.本实施例中的外泌体来源于脐带间充质干细胞，提取方法如上所述。
79.本实施例中的负载外泌体的水凝胶经过以下步骤制得：
80.s1：将外泌体重悬于10mm的pbs溶液中，得外泌体悬液；
81.s2：将外泌体悬液加入到凝胶基底中，于4℃下以600rpm/min的搅拌速率搅拌10min，即得。
82.对比例1
83.一种负载外泌体的水凝胶。与实施例1相比，凝胶基底的制备原料中，凝胶基质仅包括卡波姆u30，其余组分和制备方法与实施例完全相同。
84.对比例2
85.一种负载外泌体的水凝胶。与实施例1相比，凝胶基底的制备原料中，助剂仅包括羟苯丁酯，其余组分和制备方法与实施例完全相同。
86.结果分析
87.由于三个实施例所制得的负载外泌体的水凝胶性能类似，但以实施例1外观条件较好，因此以实施例1中制得的水凝胶为例说明水凝胶的性能。
88.通过注射器注射的方式检测实施例1以及对比例1和对比例2中制得的水凝剂的注射性能，结果如图1所示，其中，(a)为实施例1水凝胶的可注射性检测图，(b)为对比例1水凝胶的可注射性检测图，(c)为对比例2水凝胶的可注射性检测图。从图1中可以看出，采用本发明中的原料和方法制得的水凝胶注射后液滴更容易流动，表明其具有更好的注射性能，这可能是因为单纯的卡波姆u30黏合性较强，而海藻酸钠和羧甲基壳聚糖对卡波姆的黏合
性能具有调节作用，同时助剂中的苯氧乙醇、苯甲醇和羟苯丁酯共同作用，对卡波姆u30的黏合性进行调节，从而改善卡波姆u30的黏合性，得到注射性优良的水凝胶。
89.另外，通过dpph自由基清除实验验证水凝胶对自由基的清除效果。检测过程包括以下步骤：
90.(1)配制样品溶液：准确吸取制得的水凝胶100μl，加入等体积的纯化水稀释，然后吸取稀释后的水凝胶溶液100μl于96孔板中，再加入100μl浓度为0.2mmol/ml的dpph-乙醇溶液。
91.(2)配制对照溶液：准确吸取制得的水凝胶100μl，加入等体积的纯化水稀释，然后吸取稀释后的水凝胶溶液100μl于96孔板中，再加入100μl乙醇。
92.(3)配制空白溶液：准确吸取100μl蒸馏水于96孔板中，再加入100μl浓度为0.2mmol/ml的dpph-乙醇溶液。
93.上述配制的样品溶液、对照溶液和空白溶液分别摇匀后，避光反应20min，517nm处测定吸光度a，同时进行三组平行试验，结果取平均值。用以下公式计算自由基的清除率。
94.dpph自由基清除率(％)＝1-(a
样品-a
对照
)*100％/a
空白
95.公式中：a
样品
：dpph-样品溶液的吸光度；a
对照
：对照溶液的吸光度；a
空白
：空白溶液的吸光度。
96.通过上述检测方法对实施例1以及对比例1和2所制得的水凝胶的自由基清除率进行测定。结果如表1所示。
97.表1水凝胶的自由基清除率
[0098] 实施例1对比例1对比例2自由基清除率(％)433133
[0099]
从表1中可以看出，采用本发明中的原料和方法制得的水凝胶对自由基具有更好的清除率，这可能是因为单纯的卡波姆u30所形成的凝胶基底空间网络结构较差，外泌体在凝胶基底上的负载率较低，不能对自由基进行有效的清除，本技术通过对凝胶基质以及助剂的组成进行调控，可以有效改善凝胶基底的空间网络结构，外泌体在凝胶基底上的负载量以及负载稳定性大大提高，进而对自由基的清除率较高。
[0100]
本技术中水凝胶的制备原料无毒无害，并对人体友好，并且可以有效消除自由基，能够有效减缓衰老，可以作为美容制剂的制备原料。
[0101]
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。