杂种单克隆抗体的生产方法及其应用的制作方法

专利名称：杂种单克隆抗体的生产方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杂种单克隆抗体。更具体地说，本发明涉及一种具有两种特异性的杂种单克隆抗体(后面简称为杂种MoAb)，这两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质;并涉及一种产生所述抗体的多杂交瘤(polydoma)。
本发明还涉及一种血栓溶解药剂，它含有上述的杂种MoAb和与其免疫偶联的血栓溶解物质。
血栓溶解疗法长期以来被用于治疗血栓类疾病，例如心肌梗塞、动脉栓塞和大脑梗塞;最初，临床应用的有效的血栓溶解药剂是链激酶(后面缩写为SK)、尿激酶(后面缩写为UK)等。UK的应用尤其广泛，因为它有较强的纤维蛋白溶解作用;但其不利之处在于它对纤维蛋白的选择性很低，它也作用于纤维蛋白原，从而引起受疗病人的出血倾向。由于这一弊病，组织血纤维蛋白溶酶原活化因子(后面缩写为TPA)和尿激酶原(后面缩写为ProUK)被作为第二代血栓溶解药剂使用。与UK相比较，这些药剂对于纤维蛋白具有更高的选择性，因此可望减轻UK引起出血倾向的副作用;到目前为止已进行了许多研究。近年来，由于利用基因重组技术已能够大量生产这些药物，人们日益努力试图将它们用于临床治疗中(欧洲重组组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子合作研究小组TheLancet，842，1985)。
但这些临床应用的努力揭示出TPA等也具有某些缺陷，例如，1)TPA的半寿期很短(2-3分钟)，因此对于血栓溶解来说要求进行大量长期的施用;2)这种高剂量治疗并不总是具有减轻出血倾向的效应。
在这种情况下，研究并开发了更有效的血栓溶解药剂，已经生产了修饰过的TPA、UK-TPA或ProUK-TPA杂种蛋白等。对于修饰型TPA来说，已通过基因工程制备了缺乏部分糖链结构的TPA突变蛋白，这部分结构被认为是半寿期降低的原因。这样就避免了肝细胞糖链受体对TPA的捕获，改善了TPA在血液中的动力学状况。对于UK-TPA杂种蛋白来说，UK的强血栓溶解作用和TPA的纤维蛋白亲和性被结合利用，从而降低了施用剂量。与传统的血栓溶解药剂相比较，这些药剂虽然可望稍微减轻出血倾向，但显著的改善作用仍有待于进一步的研究和开发。
以后又出现了第三代血栓溶解药剂，即以定靶抗体为基础的蛋白复合物。也就是说，通过化学方式使基本上不与纤维蛋白原反应而仅对纤维蛋白具有高亲和性的抗体与UK(C.Bode等人，Science229∶765，1985)或TPA(M.S.Runge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶7659，1987)结合，从而开发出了仅溶解纤维蛋白而不溶解纤维蛋白原的血栓溶解药剂。据报道，在离体或活体实验中，所有这些定靶抗体的血栓溶解药剂都表现出比简单的UK或TPA强3-100倍的效应。但是，这些蛋白复合物都具有由抗体与血栓溶解酶的化学结合带来的缺陷，例如，1)抗体活性与酶活性都在化学结合过程中有所降低;2)很难得到抗体与酶的比例为1∶1的蛋白复合物;或3)蛋白质的变性加速了药剂在受疗病人体内的代谢。


图1显示由参考实例2所述的EIA法制备的抗TPA特异性抗体TPA1-41和TPA1-70的稀释曲线(见实例2)。
图2显示由参考实例3所述的EIA法制备的抗UK特异性抗体UK1-3和UK1-87的稀释曲线(见实例3)。
图3显示由参考实例8所述的EIA法制备的抗TPA-抗人纤维蛋白双特异性抗体FT2-14的稀释曲线(见实例4)。
图4显示由参考实例9所述的EIA法制备的抗UK-抗人纤维蛋白双特异性抗体FU1-74的稀释曲线(见实例5)。
图5显示实例4-③制备的双特异性抗体FT2-14与偶联有纤维蛋白的纸圆片的结合量。在图5中，■显示在纤维蛋白原(3mg/ml)存在下得到的结果;□显示在没有纤维蛋白原存在时得到的结果(见实例6)。
图6显示TPA与实例4-③制备的双特异性抗体FT2-14构成的免疫复合物(●)与简单TPA(○)之间的酶活性比较结果(见实例7)。
图7显示TPA在用实例4-③制备的双特异性抗体FT2-14预处理并结合有纤维蛋白的Cellulofine颗粒上(TPA/FT2-14)和在未处理的结合有纤维蛋白的Cellulofine颗粒上(TPA)溶解纤维蛋白的能力(见实例8)。
图8显示简单UK以及UK和实例5-③制备的双特异性抗体FU1-74构成的免疫复合物的纤维蛋白溶解能力(见实例9)。
图9显示单独使用TPA或结合使用TPA和实例4-③制备的双特异性抗体FT2-14所得到的纤维蛋白溶解能力(○)，以及单独使用UK或结合使用UK和实例5-③制备的双特异性抗体FU1-74所得到的纤维蛋白溶解能力(●)(见实例10)。
图10显示在家兔颈静脉血栓模型中，实例4-③制备的双特异性抗体FT2-14对TPA血栓溶解能力的增强结果(见实例11)。
图11显示小鼠杂交瘤FU2-16的培养上清液的稀释曲线，该杂交瘤是实例13制备的，它能够产生抗UK-抗人纤维蛋白的双特异性抗体(见实例13)。
图12显示通过参考实例3和10所述的EIA法制备的UK1-3、1-87和1-6各自的稀释曲线(见实例3、12和14)。图12(A)显示与UK的反应性;图12(B)显示与低分子量UK的反应性。
图13显示由参考实例11所述的UK酶活中和测试法得到的抗UK单克隆抗体UK1-3、1-87和1-6各自的酶活抑制曲线(见实例3、12和15)。
为了解决上述有关活体中代谢、纤维蛋白亲和性、血栓溶解能力等问题，并考虑到最近发展起来的双特异性杂种单克隆抗体这一新技术，本发明者制备了一种双特异性杂种单克隆抗体与血栓溶解物质比例为1∶1的免疫复合物，它们的抗体活性和血栓溶解活性都没有下降。制备方法是使血栓溶解物质与双特异性杂种单克隆抗体免疫偶联，从而产生一种没有副作用的特异于纤维蛋白的血栓溶解药剂。因此，本发明提供了一种双特异性杂种MoAb，它的两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质;并提供了一种产生此抗体的多杂交瘤。
本发明还提供了一种血栓溶解药剂，它含有上述双特异性杂种单克隆抗体和与其免疫偶联的一种血栓溶解物质。
任一种产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤都能用于本发明中，只要它产生特异于纤维蛋白并基本上不与纤维蛋白原结合的MoAb就行。例如，使用通过纤维蛋白溶解产生的纤维蛋白的α-链N端肽段或β-链N端肽段作为免疫原可制备这样一种特异于纤维蛋白的抗体(K.Y.Hui等人，Science222∶1129，1983，或日本未审查专利公开93800/1988)。虽然任一种纤维蛋白都可接受，只要是动物来源的就行，但优选人纤维蛋白;尤其优选的是，使用相应于人纤维蛋白β链N端部分的肽。使这样得到的纤维蛋白特异性抗体与载体蛋白偶联，然后免疫动物(如家兔、大鼠、小鼠、豚鼠)而得到抗体生成细胞。然后从免疫动物体内收集抗体生成细胞如脾细胞或淋巴结细胞，并与骨髓瘤细胞相融合。对这样得到的杂交瘤细胞进行筛选，选出基本上不与纤维蛋白原反应而与纤维蛋白特异结合的抗体生成细胞。人纤维蛋白β链N端肽最好具有如下氨基酸顺序H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-R-Cys-OH其中，R代表一个由Lys-Arg-Glu-Glu代表的肽或其部分。C端的Cys用来作为与载体蛋白化学结合的接头部分。因此，通过预先用N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺(后面缩写为GMBS)使载体蛋白马来酰亚胺化，或用3-(2-吡啶连二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(后面缩写为SPDP)使载体蛋白连二硫吡啶基化，能使该肽通过肽中C端Cys的SH基与载体蛋白进行化学结合。
任一种血栓溶解物质都能用于本发明中，只要它是能够溶解血栓的蛋白或促进血栓溶解的物质就行。这类物质的例子有蛋白酶或其前体和血栓溶解促进剂(例如TPA、UK、ProUK、SK、胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、C蛋白、S蛋白)。优选使用蛋白酶，尤其优选TPA、UK等。单链或双链TPA都可以。至于UK，可以使用单链或双链低分子量UK、ProUK等(E.Haber等人，Science243∶51，1989)。可用已知方法制备抗体生成杂交瘤，即根据标准方法用上述蛋白免疫动物，使产生的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞或其他细胞融合。尤其是，对于产生抗体生成杂交瘤的方法来说，优选使用用低分子量UK免疫动物而得到的抗体生成细胞。在制备能够产生针对血栓溶解物质的抗体的杂交瘤时，可以使用与产生抗纤维蛋白抗体生成杂交瘤相同的方法，即免疫动物，然后使得到的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞或其他细胞融合。
用于免疫的动物的实例包括家兔、大鼠、小鼠和豚鼠。在生产MoAb时尤其优选使用小鼠。可根据普通方法进行接种，例如，以2-3周的间隔，在背部或腹部皮下或腹膜内接种在等量(0.1ml)生理盐水和弗氏完全佐剂中的1-100μg，优选10-25μg免疫原蛋白乳剂。
从这些免疫动物(例如小鼠)中选择具有高抗体效价的个体;在最后一次免疫3-5天后收集脾和/或淋巴结;使其中包含的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合。这种融合可以根据已知方法进行。促融合剂(fusogen)的例子有聚乙二醇(后面缩写为PEG)和仙台病毒。优选使用PEG。可以使用的骨髓瘤细胞系的例子有NS-1、P3U1和SP2/0;优选使用P3U1。脾细胞与骨髓瘤细胞的比例优选前者是1-10，后者是1。建议在混合物中加入分子量为1，000-6，000的PEG，使其浓度达10-80%，并在20-37℃，优选30-37℃下保温3-10分钟。
可用各种方法筛选抗纤维蛋白抗体生成杂交瘤。例如，使纤维蛋白原吸附在微量滴定板上，然后再通过凝血酶的作用使纤维蛋白原转化成纤维蛋白。然后，在过量纤维蛋白原的存在下，在固定有纤维蛋白的微量滴定板上加入杂交瘤的培养上清液，然后通过酶免疫检测法(后面缩写为EIA)测定培养上清液中与平板结合的抗纤维蛋白特异抗体的效价。选择抗体效价呈阳性的杂交瘤，用补充有HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的培养基进行培养，并立即进行克隆，一般通过有限稀释分析等即可容易地进行克隆。用上述方法测定克隆的杂交瘤培养上清液的抗体效价，选择出稳定产生高效价抗体的杂交瘤，即可得到所需的产生单克隆抗纤维蛋白特异性抗体的杂交瘤。
根据上述方法制备的产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤实例包括FIB1-11和FIB2-11，二者都描述于下面的实例1中。
使用吸附有血栓溶解物质的微量滴定板，通过EIA法很容易筛选出产生针对血栓溶解物质的抗体的杂交瘤。可根据上述标准方法进行克隆，得到所需的抗体生成杂交瘤。
根据上述方法制备的抗TPA抗体生成杂交瘤的实例包括TPA1-41、TPA1-70和TPA2-14，它们都描述于下面的实例2中。抗UK抗体生成杂交瘤的实例包括描述于下面实例3中的UK1-3、UK1-87，以及描述于实例12中的UK1-6。
可用一些已知方法来制备产生本发明双特异性杂种MoAb的多杂交瘤(如HiroshiAramoto等人，Protein，NucleicAcidandEnzyme33∶217，1988)。虽然可以使用这些方法中的任一种，但可以提及其中的两种①使上述产生针对血栓溶解物质的抗体的HAT抗性杂交瘤逐步适应于补充有5-溴脱氧尿苷(后面缩写为BrdU)的培养基，然后克隆胸苷激酶缺陷株使其对HAT敏感;与此相似，使产生抗纤维蛋白特异性抗体的HAT抗性杂交瘤对8-氮鸟嘌呤(后面缩写为AZG)有抗性，然后克隆次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶缺陷株使其对HAT敏感;根据标准方法使这两个克隆的杂交瘤融合而得到四杂交瘤，用补充有HAT的培养基对其进行筛选，选出分泌能与纤维蛋白和血栓溶解物质二者结合的杂种MoAb的四杂交瘤，然后克隆;②用荧光素异硫氰酸酯(后面缩写为FITC)标记产物抗纤维蛋白特异性抗体的杂交瘤，用四甲基若丹明异硫氰酸酯(后面缩写为TRITC)标记产生针对血栓溶解物质的抗体的另一个杂交瘤，然后根据标准方法使这两个杂交瘤融合;将得到的细胞悬浮液加到荧光素活化细胞分选仪(后面缩写为FACS)中，选择和克隆同时具有FITC绿色荧光和TRITC红色荧光的四杂交瘤。也可以反过来利用两种亲本株的标记来选择和克隆四杂交瘤。
用这些方法进行细胞融合时，可以使用促融合剂如仙台病毒或PEG、电激或其他方式。优选使用PEG。下面给出了一个实例，但它并不限制本发明。通常使用聚合度约为1，000-6，000的PEG，浓度约为10-80%，处理时间约为0.5-30分钟。在优选条件下可达到高效率融合，例如，保持约35-55%的PEG6，000，与细胞于37℃下接触约4-10分钟。
可用上述补充有HAT的培养基等选择多杂交瘤。为此目的，用8-AZG、6-硫鸟嘌呤(6-TG)或5-BrdU进行化学适应，得到对各化学试剂具抗性的细胞株。通过在融合细胞中导入新标记可使用各种选择培养基。这类选择培养基的实例包括补充有新霉素的培养基和补充有潮霉素B的培养基(B.Sugden等人，MolecularandCellularBiology5∶410，1985)。
还有另一种已知方法，就是使用不同荧光染料标记的两个杂交瘤相互融合，然后用FACS选择双标记的杂种杂交瘤(L.Karawajew等人，J.ofImmunologicalMethods96∶265，1987)。
可用各种方法筛选生产杂种抗体的杂交瘤。例如，可以将下列方法经适当组合或修改后加以使用①结合使用分别用于筛选产生抗纤维蛋白特异抗体的杂交瘤和用于筛选产生针对血栓溶解物质抗体的杂交瘤的上述EIA法;②检测双特异性杂种抗体的EIA法，即当所用针对血栓溶解物质的抗体与抗纤维蛋白特异性抗体属于不同的亚类时，将有关培养上清液加至偶联有纤维蛋白的微量滴定板上，然后加入HRP标记的血栓溶解物质;③检测双特异性抗体的EIA法，即将有关培养上清液加至偶联有纤维蛋白的微量滴定板上，然后加入HRP标记的抗小鼠IgG亚类特异性抗体。
将对于杂种抗体活性呈阳性的多杂交瘤立即进行克隆，此过程一般很容易通过有限稀释分析等完成。用上述方法测定克隆的多杂交瘤培养上清液的抗体效价，选择出稳定产生高效价抗体的多杂交瘤，即可得到所需的产生单克隆杂种抗体的多杂交瘤。
本发明的上述多杂交瘤一般可用已知方法在液体培养基或动物(如哺乳动物如小鼠)腹膜腔内培养。可以结合使用已知的生化技术从培养液和腹水液中纯化出抗体。例如，离心细胞培养液或腹水液;取出得到的上清液进行盐析(通常使用硫酸铵或硫酸钠)。将产生的蛋白沉淀溶于适当的溶液中并透析，然后通过柱层析(离子交换柱、凝胶过滤柱、A蛋白柱、羟磷灰石柱等)分离和纯化所需抗体。例如，通过这种分离纯化步骤从1升培养上清液中大约产生1-5mg杂种MoAb，以蛋白重量计，纯度在80%以上。从20ml腹水液中可得到产率为3-10mg的同样抗体。
这样得到的杂种MoAb是一种均一蛋白;它用蛋白酶(如胃蛋白酶)等处理时产生能与纤维蛋白和血栓溶解物质二者结合的F(ab′)2或其他片段，它们都可象本发明的杂种MoAb一样用于同样的目的。
根据上述方法制备的产生杂种抗体的多杂交瘤实例包括下面实例4、5和13中所述的四杂交瘤。
除了由抗纤维蛋白MoAb生成杂交瘤和产生针对血栓溶解物质的抗体的另一杂交瘤形成的四杂交瘤，也就是上面作为例子提及的生产本发明杂种MoAb的多杂交瘤以外，还可以使用由产生一种MoAb的杂交瘤与产生另一种MoAb的细胞所形成的三杂交瘤、通过使产生不同MoAb的细胞融合(在用EB病毒等永久化以后)而得到的杂交瘤及其他杂交瘤，它们都可用于同样的目的，只要它们能产生本发明的杂种MoAb就行。
如果这些多杂交瘤产生小鼠IgGMoAb，则能够制备一种小鼠-人嵌合抗体，方法是制备一个编码可变或高可变区的DNA，该区含有这种双特异性杂种MoAb的抗原识别位点，然后利用基因操作技术(Z.Steplewski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶4852，1988)使该DNA与编码人IgG恒定区的基因结合。优选使用这种嵌合抗体是因为它施用于人时的抗原性较低。
有一些已知方法可用来本发明的双特异性杂种MoAb或由血栓溶解物质和双特异性杂种MoAb制备的选择性血栓溶解蛋白复合物进行血栓溶解治疗，这些方法包括①预先对血栓病患者施用本发明的杂种MoAb，在一段足够长的时间后施用血栓溶解物质如TPA或UK，使它与病人体内形成的血栓结合;②对血栓病患者同时施用杂种MoAb和血栓溶解物质;③预先使杂种MoAb和血栓溶解物质反应，分离出未反应的血栓溶解物质后，给血栓病患者施用所得到的选择性血栓溶解蛋白复合物。
本发明的血栓溶解药剂、杂种MoAb或血栓溶解物质可直接制成注射剂等，或在用滤膜等过滤除去细菌(这是必需的步骤)以后与药学上可接受的适当载体、赋形剂、稀释剂等混合，施用给哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猫、狗、猪、牛、猴、人)，以达到治疗血栓或阻塞性疾病的目的，例如治疗心肌梗塞、外周动静脉梗阻、视网膜动静脉梗阻、大脑梗塞和肺栓塞。
虽然本发明的血栓溶解药剂的日剂量取决于疾病的种类、症状和施用途径，但对成年心肌梗塞患者的静脉施用剂量一般是(例如)对于杂种MoAb来说大约0.02-1mg/kg，优选大约0.04-0.4mg/kg;对于血栓溶解物质来说，TPA大约为0.01-0.5mg/kg，优选大约0.02-0.2mg/kg，UK大约为0.01-0.5mg/kg，优选大约0.02-0.2mg/kg。
本发明的杂种MoAb能够与纤维蛋白特异结合，而基本上不与纤维蛋白原反应，并且能与血栓溶解物质特异结合而不破坏其纤维蛋白溶解能力。因此能够容易地制备杂种MoAb与血栓溶解物质1∶1的免疫复合物;它们的结合使用能够对血栓进行选择性和高效率的溶解或去除。
通过上面所述的方法，使用本发明的杂种MoAb并结合使用一种血栓溶解物质，能够对血栓进行选择性和高效率的溶解或去除，所述杂种MoAb能够与目标血栓部位特异结合，而基本上不与纤维蛋白原结合。
实例下面通过参考实例和工作实例对本发明进行更详细的描述;这些实例并不限制本发明的范围。
实例中所用的动物细胞系都如下表所示进行了保藏。
动物细胞系(IFO)IFO编号(FRI)FERM编号小鼠杂交瘤FIB1-1150174BP-2081小鼠杂交瘤FIB2-1150175BP-2082小鼠杂交瘤TPA1-4150178BP-2085小鼠杂交瘤TPA1-7050179BP-2086小鼠杂交瘤TPA2-1450194BP-2519小鼠杂交瘤UK1-350176BP-2083小鼠杂交瘤UK1-8750177BP-2084小鼠杂交瘤UK1-650208BP-2548小鼠杂种杂交瘤(四杂50180BP-2158交瘤)FT2-14小鼠杂种杂交瘤(四杂50185BP-2334交瘤)FU1-74小鼠杂种杂交瘤(四杂50207BP-2547交瘤)FU2-16IFO大阪发酵研究所FRI国际工贸部发酵研究所在本说明书中，氨基酸和肽采用由IUPACIUB生化命名委员会(CBN)认可的简写系统来简写表示;下面给出了简写的实例。注意，如果在特定氨基酸等中可能存在有光学异构体，则都是L-异构体，除非特别指出。
Gln谷氨酰胺残基Asp门冬氨酸残基Pro脯氨酸残基Tyr酪氨酸残基Val缬氨酸残基Lys赖氨酸残基Glu谷氨酸残基Ala丙氨酸残基Asn门冬酰胺残基Leu亮氨酸残基Phe苯丙氨酸残基Gly甘氨酸残基His组氨酸残基Ser丝氨酸残基Thr苏氨酸残基Ile异亮氨酸残基Trp色氨酸残基Arg精氨酸残基Met蛋氨酸残基Cys半胱氨酸残基参考实例1测定抗纤维蛋白抗体的EIA在96孔微量滴定板上以每孔50μl加入在磷酸缓冲液(PBS，pH7.3)中的1mg/ml人纤维蛋白单体溶液，其中含有3.3M脲和0.01%EDTA。将此微量滴定板于4℃下放置过夜，加入150μl含有2%酪蛋白和0.01%水杨乙汞的PBS，制备出敏化平板。然后，将在PBS中的10mg/ml人纤维蛋白原溶液(含有100单位/ml肝素和3mM苯甲磺酰氟)与等量的有关杂交瘤培养上清液混合。在室温下反应30分钟后，在上述经纤维蛋白敏化的平板中加入100μl混合物，然后在室温下保温2小时。用含有0.05%吐温20的PBS(PBS-TW)充分洗涤平板后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG抗体，然后于室温下反应2小时。
洗涤平板后，在每孔中加入含有作为酶底物的邻苯二胺和H2O2的0.1M柠檬酸缓冲液，然后在室温下进行酶反应。加入1N硫酸终止反应，用Multiscan(由Flow Co.生产)在492nm波长下对成色色素进行定量。
参考实例2测定抗TPA抗体的EIA在96孔微量滴定板上以每孔100μl加入5μg/mlTPA溶液，于4℃放置过夜，然后加入150μl含有2%酪蛋白和0.01%水杨乙汞的PBS，制得敏化平板。除去上述溶液并用PBS-TW洗涤平板后，加入100μl有关杂交瘤培养上清液，在室温下反应2小时。然后，用参考实例1的方法进行酶反应，并测定抗体效价。
参考实例3测定抗UK抗体的EIA
用与参考实例2相同的方法制备UK敏化平板，但用UK代替TPA，然后用相同方法测定抗UK抗体的效价。
参考实例4测定抗纤维蛋白-抗TPA杂种抗体的EIA①如参考实例1制备纤维蛋白敏化平板，加入有关杂交瘤培养上清液，然后于室温下反应2小时。用PBS-TW洗涤平板后，加入生物素标记的TPA，然后于室温下反应2小时。然后加入抗生物素蛋白-HRP复合物，然后在室温下反应1小时。用参考实例1的方法测定与固相结合的HRP活性。
参考实例5测定抗纤维蛋白-抗UK杂种抗体的EIA①使用参考实例4中的方法，但用生物素标记的UK代替生物素标记的TPA。然后，以相同方式测定抗生物素蛋白-抗UK杂种抗体的效价。
参考实例6纤维蛋白溶解中和测试在TPA溶液(终浓度20ng/ml)或UK溶液(终浓度25ng/ml)中加入有关杂交瘤培养上清液的稀释液，然后于37℃反应1小时。然后将反应混合物以每孔5μl加至纤维蛋白-琼脂糖平板上，然后于37℃保温2-6小时。测量产生的纤维蛋白溶解斑的直径，确定杂交瘤培养上清液中MoAb中和TPA或UK酶活性的能力。
参考实例7测定抗纤维蛋白-抗TPA杂种抗体的EIA②如参考实例2制备TPA致敏平板，加入含有杂种抗体的有关溶液，然后于室温下反应2小时。用PBS-TW洗涤平板后，加入HRP标记的抗小鼠IgG1(γ1链特异性)抗体(可由Cosmo-BioK.K.购得)，然后于室温下反应2小时。用PBS-TW充分洗涤平板后，用参考实例1的方法测定与固相结合的HRP活性。
参考实例8测定抗纤维蛋白-抗TPA杂种抗体的EIA③如参考实例2制备TPA致敏平板，加入含有杂种抗体的有关溶液，然后于室温下反应2小时。用PBS-TW洗涤平板后，加入实例1-①所述的用生物素标记的人纤维蛋白β链N端肽(1-11)-BSA复合物，然后于室温下反应2小时。然后加入抗生物素蛋白-HRP复合物，然后于室温下反应1小时;用参考实例1的方法测定与固相结合的HRP活性。
参考实例9测定抗纤维蛋白-抗UK杂种抗体的EIA②如参考实例3制备UK致敏平板，加入含有杂种抗体的有关溶液，然后于室温下反应2小时。用PBS-TW洗涤平板后，加入实例1-①所述的用生物素标记的人纤维蛋白β链N端肽(1-11)-BSA复合物，然后于室温下反应2小时。然后加入抗生物素蛋白-HRP复合物，然后于室温下反应1小时;用参考实例1的方法测定与固相结合的HRP活性。
参考实例10测定抗低分子量UK抗体效价的EIA如参考实例2所述，制备用低分子量UK(双链低分子量UK，可得自JCRCo.)代替TPA而致敏的平板，以相同方式测定抗低分子量UK的抗体效价。
参考实例11UK酶活中和测试在UK溶液(终浓度1.7μg/ml)中加入有关抗体溶液，反应于室温下进行30分钟。在反应混合物中加入合成的肽底物S-2444(1mM，焦谷氨酰甘氨酰精氨酰对硝基苯胺，由KabiCo.生产)。于37℃反应15分钟后，测量释放出的对硝基苯胺(在405nm处的光吸收)。
实例1制备产生小鼠抗人纤维蛋白单克隆抗体的杂交瘤①免疫原的制备首先用GMBS使12mg/2ml牛血清清蛋白(BSA)的水溶液马来酰亚胺化(以每摩尔BSA13摩尔的比例引入马来酰亚胺基)，向其中加入3.3mg人纤维蛋白β链N端肽(1-11)-Cys，它是用肽合成仪(430A型，AppliedSystemCo.)根据已知的固相合成法制备的。然后于30℃反应1小时，产生人纤维蛋白β链N端肽(1-11)-BSA复合物。用生理盐水透析3次(3l×3)后，将此复合物贮存在冰冻条件下，然后作为免疫原使用。
②免疫向生理盐水中的1mg/ml肽-BSA复合物溶液中加入等量的弗氏完全佐剂，然后在小鼠(♀，n＝10∶0.1mg/0.2ml/小鼠)背部和腹部作皮下免疫。以2-3周的间隔，通过接种与等量弗氏不完全佐剂结合的免疫原再进行5次免疫。
③细胞融合最后一次免疫3天后，切下脾脏，按标准方法制备脾细胞悬浮液(大约108个细胞)。加入2×107个小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)后，根据Koehler和Milstein的方法(Nature 256∶495，1975)用PEG6000进行细胞融合。
融合过程完成后，将细胞混合物悬浮于HAT培养基中，其中含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷，然后培养10天。完成亲本细胞的选择后，立即用不含氨基蝶呤的HT培养基替换HAT培养基，然后作进一步培养。
④杂交瘤的选择和克隆根据参考实例1所述的EIA法，测定杂交瘤培养上清液的抗体效价，该方法使用吸附有人纤维蛋白单体的微量滴定板作为固相。在融合10-20天后，出现杂交瘤并检测出与人纤维蛋白特异结合的抗体。通过有限稀释分析，对具有特别强亲合力的杂交瘤进行克隆。
通过EIA筛选克隆的杂交瘤的培养上清液;选择与人纤维蛋白有强亲合力的杂交瘤。
结果得到了小鼠杂交瘤FIB1-11和FIB2-11，二者都产生能在高浓度纤维蛋白原存在下与纤维蛋白特异结合的MoAb。这两个杂交瘤分别产生抗体FIB1-11和FIB2-11，用Ouchterlony方法鉴定，二者都是免疫球蛋白类和亚类中的IgG1。
根据参考实例1所述的EIA法，在有和没有纤维蛋白原存在的情况下，测定这两种抗人纤维蛋白特异性抗体FIB1-11和FIB2-11。结果示于表1。注意，用作对照的是抗人纤维蛋白原抗体FIB2-162。
表1.测定抗纤维蛋白抗体的EIA1)光吸收(492nm)单克隆抗体在没有纤维蛋白原存在下在纤维蛋白原存在下2)FIB1-110.500.20FIB2-110.510.16FIB2-1620.320.01
1)参考实例1所述的EIA。
2)终浓度5mg/ml。
实例2产生小鼠抗TPA单克隆抗体的杂交瘤的制备①免疫向200μg/ml市售单链TPA(可得自ChuoKagakuKogyoK.K.)的生理盐水溶液中加入等量的弗氏佐剂。在BALB/c小鼠(♀，20μg/0.2ml/小鼠)的背部和腹部皮下施用此乳液，然后以2-3周的间隔再作加强免疫。在3次加强免疫后10天，对具有最大血清抗体效价的动物静脉施用TPA抗原溶液(50μg/0.1ml生理盐水/小鼠)。
②细胞融合根据实例1-③所述方法进行细胞融合。
③杂交瘤的选择和克隆根据参考实例2所述的EIA法筛选杂交瘤，使用结合有TPA的微量滴定板。然后根据实例1-④的方法得到抗TPA-MoAb生成杂交瘤。从这些杂交瘤中得到一个小鼠杂交瘤TPA1-41，它产生抗TPAMoAb，它与TPA特异结合而不破坏其纤维蛋白溶解能力;一个小鼠杂交瘤TPA1-70，它产生一种TPA中和抗体;一个小鼠杂交瘤TPA2-14，它产生一种TPA非中和性抗体，它与血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂(PAI)竞争性地与TPA结合。用Ouchterlony方法鉴定出，分别由这三个杂交瘤产生的抗体TPA1-41、TPA1-70和TPA2-14分别是免疫球蛋白类和亚类中的IgG2b、IgG1和IgG1。
图1显示了用参考实例2所述的EIA法测定这些抗TPA特异抗体TPA1-41(-●-)和TPA1-70(-▲-)的结果。
实例3产生小鼠抗UK单克隆抗体的杂交瘤的制备①免疫按与实例2-①完全相同的方法进行小鼠免疫，但使用UK(由NipponSeiyaku生产)代替实例2-①所述的TPA。
②细胞融合根据实例1-③所述方法进行细胞融合。
③杂交瘤的选择和克隆用参考实例3所述的EIA法筛选杂交瘤，使用结合有UK的微量滴定板。然后按照实例1-④的方法获得抗UKMoAb生成杂交瘤。从这些杂交瘤中得到小鼠杂交瘤UK1-3和UK1-87，二者都产生与UK特异结合而不破坏其纤维蛋白溶解能力的抗UKMoAb。用Ouchterlony方法鉴定出，分别由这两个杂交瘤产生的抗体UK1-3和UK1-87分别是免疫球蛋白类和亚类中的IgG1和IgG2b。
图2显示了用参考实例3所述的EIA法测定这些抗UK特异抗体UK1-3(-●-)和UK1-87(-▲)的结果。
实例4具有抗TPA-抗人纤维蛋白双特异性的杂种单克隆抗体的生产①细胞融合将实例1得到的产生抗人纤维蛋白抗体的杂交瘤FIB1-11和实例2得到的产生抗TPA抗体的杂交瘤TPA1-41，分别在含有0.5μg/mlFITC和1.5μg/mlTRITC的Iscove-HamF-12培养基中于37℃保温30分钟，以进行荧光染色。然后加入LSM溶液(可购自WakoPureChemicalIndustriesLtd.)，并除去死细胞。然后使这两个杂交瘤以1∶1的比例混合在一起，然后根据实例1-③所述方法用PEG6000进行细胞融合。
于37℃保温2小时后，将细胞混合物加到FACS中，从而得到25，000个荧光素-若丹明双染色的细胞。在96孔微量滴定板上以每孔10个细胞接种这些双染色细胞并进行培养，微量滴定板预先以5×105个细胞/孔接种小鼠胸腺细胞作为喂养细胞。
②杂种杂交瘤的选择和克隆从融合1-2周后发生细胞增殖的小孔中取培养上清液分别进行参考实例1、2、7和8所述的EIA法，测定抗体活性。以同样方式测定分别由实例1-④和2-③得到的杂交瘤FIB1-11和TPA1-41的培养上清液的抗体活性作为对照。结果示于表2。
通过有限稀释分析，对表现出高杂种抗体效价的小孔进行克隆;得到所需的产生双特异性抗体的小鼠杂种杂交瘤(四杂交瘤)FI2-14。
表2.由杂种杂交瘤产生的抗体的特异性EIA抗体效价4)抗TPA-抗TPA-抗杂交瘤培抗纤维蛋抗小鼠纤维蛋白β养上清液白5)抗TPA6)IgG17)链N端肽8)杂种杂交瘤A1)0.66 0.99 1.90 2.45杂种杂交瘤B1)0.30 0.60 0.51 2.19FIB1-112)0.29 0.00 0.01 0.00TPA1-413)0.01 1.01 0.01 0.00
1)实例4-②得到的杂种杂交瘤。
2)实例1-④得到的杂交瘤。
3)实例2-③得到的杂交瘤。
4)以492nm处的光吸收表示(见参考实例1)。
5)参考实例1所述的EIA。
6)参考实例2所述的EIA。
7)参考实例7所述的EIA。
8)参考实例8所述的EIA。
③杂种抗体的纯化对6只BALB/c小鼠预先腹膜内施用0.5ml矿物油，然后以5×106个细胞/小鼠腹膜内接种小鼠杂种杂交瘤(四杂交瘤)FT2-14。大约10-20天后，收集20ml积存的腹水液，用50%饱和的硫酸铵进行盐析，得到IgG组分。在20mM PBS(pH7.5)中透析后，将IgG组分加到偶联有纤维蛋白的Cellulofine柱上，用pH2.9的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液洗脱。在PBS中透析后，将酸洗脱组分加到偶联有TPA的Sepharose 4B柱上，用pH2.3的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液洗脱。洗脱液在PBS中透析，得到9.4mg双特异性抗体FT2-14。
对得到的抗体进行参考实例8所述的EIA法;画出双特异性抗体的稀释曲线。结果示于图3。从图3中明显可见，所得到的抗体对TPA和纤维蛋白都表现出强烈的亲合力。
实例5具有抗UK-抗人纤维蛋白双特异性的杂种单克隆抗体的生产
①细胞融合根据实例4-①所述的方法，将实例1得到的产生抗人纤维蛋白抗体的杂交瘤FIB1-11和实例3得到的产生抗UK抗体的杂交瘤UK1-3，分别用FITC和TRITC进行荧光染色，然后用PEG6000进行细胞融合。将细胞混合物加到FACS中;选择并培养双染色的细胞。
②杂种杂交瘤的选择和克隆从融合1-2周后发生细胞增殖的小孔中取培养上清液，分别进行参考实例1、3和9所述的EIA法，测定其抗体活性。以同样方式测定分别由实例1-④和3-③得到的杂交瘤FIB1-11和UK1-3的培养上清液中的抗体活性作为对照。
通过有限稀释分析，对表现出最大杂种抗体活性的小孔进行克隆，得到所需的产生双特异性抗体的小鼠杂交瘤FU1-74。
③杂种抗体的纯化根据实例4-③所述方法收集腹水液，然后用硫酸铵盐析，用偶联有纤维蛋白的柱和偶联有UK的柱进行免疫亲和层析;从大约20ml腹水液中得到14mg本发明的抗UK-抗人纤维蛋白双特异性抗体FU1-74。
将得到的抗体进行参考实例9所述的EIA法;画出双特异性抗体的稀释曲线。结果示于图4。从图4明显可见，所得到的FU1-74抗体对UK和纤维蛋白都有很强的亲合力。
实例6抗TPA-抗人纤维蛋白双特异性抗体FT2-14的性质①将直径9.5mm的纸圆片浸于2mg/ml人纤维蛋白原溶液中，然后加入人凝血酶(50NIH单位/ml)，在纸圆片上形成纤维蛋白凝块。充分洗涤后，将此偶联有纤维蛋白的纸圆片在纤维蛋白原(3mg/ml)存在下浸于实例4-③得到的双特异性抗体FT2-14的溶液中。用HRP标记的抗小鼠IgG2b抗体测定与纸圆片结合的抗体量。结果示于图5。
在纤维蛋白原(3mg/ml)存在下得到的纤维蛋白亲合力(■)差不多与不存在纤维蛋白原时得到的亲合力(□)相等，表明本发明的FT2-14抗体特异于纤维蛋白。
实例7抗TPA-抗人纤维蛋白双特异性抗体FT2-14的性质②使不同浓度的TPA与实例4-③得到的双特异性抗体FT2-14的溶液于37℃反应30分钟，后者的摩尔浓度为TPA的4.3倍，从而产生TPA和FT2-14抗体的免疫复合物(TPA/FT2-14抗体)。然后加入3mM肽合成底物S-2288(由KaviCo.生产)，于37℃反应2小时。在405nm处测定所释放的对硝基苯胺的光吸收;将上述TPA-FT2-14抗体复合物的酶活性与简单TPA作比较。结果示于图6。
在图6中，●显示TPA/FT2-14抗体复合物的酶活性，○显示简单TPA的酶活性。结果证实，TPA即使与本发明的双特异性抗体FT2-14结合，也完全不降低其酶活性。
实例8抗TPA-抗人纤维蛋白的双特异性抗体FT2-14的性质③根据已知方法(EtsukoEbisui等人，Seikagaku54∶732，1982)，将人纤维蛋白原通过结合固定在Cellulofine颗粒(可购自SeikagakuKogyoK.K.)上，然后通过加入人凝血酶使其转化成纤维蛋白。在0.2g这种纤维蛋白-Cellulofine颗粒复合物中加入10μg/500μlFT2-14抗体溶液，然后于37℃反应90分钟。充分洗涤后，使反应混合物与100ngTPA于37℃反应40分钟。洗涤后，使反应混合物与加入的血纤维蛋白溶酶原(3单位/ml)于37℃反应1小时。用FDP-EIA药盒(由AmericanDiagnosticsCo.生产)对释放到上清液中的肽(纤维蛋白降解产物FDP)进行定量。
结果示于图7。
TPA对用双特异性抗体FT2-14预处理的纤维蛋白-Cellulofine颗粒比对未处理的纤维蛋白-Cellulofine颗粒有更强的效应;抗体增强了TPA的纤维蛋白溶解能力。
实例9抗UK-抗人纤维蛋白双特异性抗体FU1-74的性质①将2.5μlUK溶液(25ng/ml)和实例5-③得到的双特异性抗体FU1-74的溶液(40ng/ml或160ng/ml)一起注射到参考实例6所述的纤维蛋白-琼脂糖平板的一个孔中，然后于37℃反应4小时。然后，测量所产生的纤维蛋白溶解斑，并与用简单UK得到的纤维蛋白溶解斑比较。结果示于图8。与简单UK比较，与FU1-74抗体共存导致其纤维蛋白溶解能力提高3-5倍。
实例10抗TPA-抗人纤维蛋白双特异性抗体FT2-14和抗UK-抗人纤维蛋白双特异性抗体FU1-74的体外纤维蛋白溶解能力的增强使用实例8得到的纤维蛋白-Cellulofine颗粒装填的柱分别与实例4-③得到的FT2-14(0-100μg/ml)和实例5-③得到的FU1-74(0-50μg/ml)相偶联，然后用含有0.01%TritonX-100的PBS(PBS-T)洗涤。以200μg/400ml的量和240ml/小时的流速，对FT2-14处理柱注射TPA溶液，对FU1-74处理柱注射UK溶液。用PBS-T洗柱后，将Cellulofine颗粒载体转移至试管中，与加入的血纤维蛋白溶酶原(4.5单位/1.5ml)于37℃反应2小时。加入等量的6mM对脒基苯基甲磺酰氟后，用EIA药盒(由AmericanDiagnosticaCo.生产)测量由Cellulofine颗粒释放出的纤维蛋白降解产物(FDP)。结果示于图9。结果发现，与未用抗体处理的纤维蛋白-Cellulofine颗粒上的TPA(○)和UK(●)的纤维蛋白溶解能力相比较，在100μg/mlFT2-14处理的纤维蛋白-Cellulofine颗粒(○)中，纤维蛋白溶解能力提高3.8倍，在50μg/mlFU1-74处理的纤维蛋白-Cellulofine颗粒(●)中提高8.5倍。
实例11抗TPA-抗人纤维蛋白双特异性抗体FT2-14的体内血栓溶解能力的增强①家兔颈静脉血栓模型的制备雄性家兔(2.5-3.5kg)通过腹膜内注射戊巴比妥(90mg/1.5ml/家兔)和脲烷(1.5mg/3ml/家兔)而麻醉，然后将血液取样插管插至右股静脉中，在左颈静脉中插入血液注射插管和一根棉线。在宽约3cm的区段夹住颈静脉阻断血流，然后依次加入生理盐水和0.2ml含有10U/ml凝血酶的12mM CaCl2溶液洗涤血管内部。向洗涤过的血管中注射0.2ml由股静脉收集的自体血液。立即取下插管;连接产生的开口。然后将动物放置30分钟使血液凝结。
②有关药物溶液的注射对血栓模型家兔腹膜内(250U/kg)和皮下(500U/kg)注射肝素;从颈静脉摘下夹子。然后将注射针头插入另一侧的耳静脉，然后静脉内注射有关药物溶液，注射量为2ml/家兔，即总剂量体积的10%。然后持续注射剩余的90%体积，流速为6ml/小时，时间共4小时。4小时后，取出吸附于棉线上的血栓称量其湿重。所用的有关药物溶液是生理盐水对照、TPA溶液(0.25mg/kg和1.0mg/kg)、FT2-14抗体溶液(1.2mg/kg)和实例4-③得到的TPA/FT2-14抗体复合物溶液(0.25mg/kgTPA+1.2mg/kgFT2-14)。结果示于图10。
在4小时内持续注射0.25mg/kgTPA时，对照组中的血栓湿重由61.5±7.2mg(n＝4)降至31.7±10.1mg(n＝6)。在接受0.25mg/kgTPA和1.2mg/kgFT2-14(二者以TPA为1、双特异性抗体为2的摩尔比结合)的实验组中，湿重变为19.6±6.5mg(n＝7)，也就是说，血栓溶解能力被增强到几乎与1.0mg/kgTPA实验组的血栓湿重(15.5±5.0mg，n＝3)相等的程度。在1.2mg/kgFT2-14实验组中，血栓湿重为41.5mg(n＝1)。
实例12产生小鼠抗低分子量UK单克隆抗体的杂交瘤的制备①免疫按与实例2-①完全相同的方法进行小鼠免疫，但用市售双链低分子量UK(可得自JCRCo.)代替实例2-①所述的TPA。
②细胞融合根据实例1-③所述方法进行细胞融合。
③杂交瘤的选择和克隆用参考实例10所述的EIA法用结合有低分子量UK的微量滴定板筛选杂交瘤，并进行与实例1-④相同的操作，得到产生抗低分子量UKMoAb的杂交瘤。从这些杂交瘤中选出小鼠杂交瘤UK1-6，它产生的抗低分子量UK的MoAb与UK特异结合而不损害UK的纤维蛋白溶解能力。用Ouchterlony的方法鉴定出，由这样得到的杂交瘤产生的抗体UK1-6的免疫球蛋白的类和亚类是IgG1(k链)。
实例13具有抗UK-抗人纤维蛋白双特异性的杂种单克隆抗体的生产②①细胞融合根据实例4-①所述的方法，将实例1得到的产生抗人纤维蛋白抗体的杂交瘤FIB1-11和实例12得到的产生抗低分子量UK抗体的杂交瘤UK1-6，分别用FITC和TRITC进行荧光染色，然后用PEG6000进行细胞融合。然后将细胞加到FACS中，选择出双染色细胞进行培养。
②杂种杂交瘤的选择和克隆从融合1-2周后发生细胞增殖的小孔中取培养上清液分别进行参考实例1、9和10所述的EIA法，测定其抗体活性。
通过有限稀释分析，对表现出最大杂种抗体活性的小孔进行克隆，得到所需的产生双特异性抗体的小鼠杂种杂交瘤FU2-16。
用参考实例5所述的EIA法检测杂种杂交瘤FU2-16的培养上清液。结果示于图11。
③杂种抗体的纯化用实例4-③所述的方法收集腹水液，用硫酸铵进行盐析，用纤维蛋白偶联柱和UK偶联柱进行免疫亲和层析，从大约20ml腹水液中得到大约23mg本发明的抗UK-抗人纤维蛋白双特异性抗体FU2-6。
实例14抗UK单克隆抗体的性质①分别使用结合有UK的微量滴定板和结合有低分子量UK的微量滴定板(分别叙述于参考实例3和10)，对实例3和12得到的抗UK单克隆抗体UK1-3、1-87和1-6进行EIA法，并将其亲合力与UK(图12(A))和低分子量UK(图12(B))作比较。结果示于图12。
UK1-3抗体不与低分子量UK结合，而UK1-87和UK1-6两种抗体都对UK和低分子量UK表现出相等的反应性。
实例15抗UK单克隆抗体的性质②用参考实例11所述的合成肽底物S-2444对实例3和12得到的抗UK单克隆抗体UK1-3、1-87和1-6进行UK酶活中和测试。结果示于图13。
这些抗UK单克隆抗体中没有一个抑制UK的酶活性。
权利要求
1.一种产生双特异性杂种单克隆抗体的多杂交瘤，该抗体的两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质。
2.如权利要求1所述的多杂交瘤，其特征在于，所述血栓溶解物质是蛋白酶。
3.如权利要求2所述的多杂交瘤，其特征在于，所述蛋白酶是组织血纤维蛋白溶酶原活化因子。
4.如权利要求2所述的多杂交瘤，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
5.一种通过由产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤与产生抗组织血纤维蛋白溶酶原活化因子抗体的杂交瘤融合而得到的四杂交瘤，它产生一种双特异性的杂种单克隆抗体，该抗体能在同一分子上与纤维蛋白和组织血纤维蛋白溶酶原活化因子二者相结合。
6.一种通过由产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤与产生抗尿激酶抗体的杂交瘤融合而得到的四杂交瘤，它产生一种双特异性的杂种单克隆抗体，该抗体能在同一分子上与纤维蛋白和尿激酶二者相结合。
7.一种双特异性的杂种单克隆抗体，它的两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质。
8.如权利要求7所述的抗体，其特征在于，所述血栓溶解物质是蛋白酶。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述蛋白酶是组织血纤维蛋白溶酶原活化因子。
10.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
11.一种血栓溶解药剂，它含有如权利要求7所述的抗体和与其免疫偶联的血栓溶解物质。
12.如权利要求11所述的血栓溶解药剂，其特征在于，所述血栓溶解物质是蛋白酶。
13.如权利要求12所述的血栓溶解药剂，其特征在于，所述蛋白酶是组织血纤维蛋白溶酶原活化因子。
14.如权利要求12所述的血栓溶解药剂，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
15.一种生产能产生双特异性杂种单克隆抗体的多杂交瘤的方法，该抗体的两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质，该方法包括使产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤或细胞与产生针对血栓溶解物质的抗体的杂交瘤或细胞相互融合。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述血栓溶解物质是蛋白酶。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是组织血纤维蛋白溶酶原活化因子。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的多杂交瘤是一种四杂交瘤，它是通过由产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤与产生抗组织血纤维蛋白溶酶原活化因子抗体的杂交瘤融合而得到的，该四杂交瘤产生一种双特异性的杂种单克隆抗体，该抗体能在同一分子上与纤维蛋白和组织血纤维蛋白溶酶原活化因子二者相结合。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述多杂交瘤是一种四杂交瘤，它是通过由产生抗纤维蛋白抗体的杂交瘤与产生抗尿激酶抗体的杂交瘤融合而得到的，该四杂交瘤产生一种双特异性的杂种单克隆抗体，该抗体能在同一分子上与纤维蛋白和尿激酶二者结合。
21.一种生产双特异性杂种单克隆抗体的方法，该抗体的两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质，该方法包括在液体培养基或动物的腹膜腔内培养如权利要求15所述的多杂交瘤，从培养上清液或腹水液中收集所述抗体。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述血栓溶解物质是蛋白酶。
23.如权利要求22的方法，其特征在于，所述蛋白酶是组织血纤维蛋白溶酶原活化因子。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶是尿激酶。
25.一种溶解或去除哺乳动物体内血栓的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的如权利要求7所述的抗体与血栓溶解物质的结合物。
26.如权利要求7所述的抗体与血栓溶解物质的结合物在血栓的溶解或去除中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种双特异性的杂种单克隆抗体，它的两种特异性分别针对纤维蛋白和血栓溶解物质；还提供了一种产生所述抗体的多杂交瘤和一种血栓溶解药剂，该药剂含有所述抗体和与其免疫偶联的血栓溶解物质。所述抗体与血栓溶解物质结合可用于选择性地和高效率地溶解或去除血栓。
文档编号A61K39/395GK1041783SQ89107488
公开日1990年5月2日 申请日期1989年9月27日 优先权日1988年9月27日
发明者岩佐进, 黑川智文, 豐田幸生 申请人:武田药品工业株式会社